重組醬油曲霉堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白制備抗氧化肽的研究

柯 野，劉園園，朱永麗，曾松榮，殷 爽，劉玉萍，何璐娜

（韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東韶關(guān)512005）

重組醬油曲霉堿性蛋白酶水解大豆分離蛋白制備抗氧化肽的研究

柯 野，劉園園，朱永麗，曾松榮，殷 爽，劉玉萍，何璐娜

（韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院，廣東韶關(guān)512005）

利用重組醬油曲霉堿性蛋白酶（rAp）對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行水解，制備了抗氧化肽；進(jìn)一步對(duì)抗氧化肽的抗氧化能力和苦味情況等方面進(jìn)行了研究.結(jié)果表明：重組堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白具有較強(qiáng)的水解效果，當(dāng)酶與底物比（E/S）為3 000U/g時(shí)，大豆分離蛋白的水解度達(dá)到17.09%；當(dāng)E/S為5 000 U/g時(shí)，抗氧化肽對(duì)DPPH自由基的清除率高達(dá)83.38%，對(duì)亞油酸也具有較強(qiáng)的抗氧化性，并且該抗氧化肽的苦味不明顯.在同樣條件下，rAp對(duì)大豆分離蛋白的水解效率、抗氧化肽的活性和低苦味均優(yōu)于商品化的堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶.這些結(jié)果表明rAp具有較好的應(yīng)用潛力，并且其抗氧化肽在化妝品、飼料和食品等行業(yè)中也具有較好的應(yīng)用前景.

重組醬油曲霉蛋白酶；大豆分離蛋白；抗氧化肽

醬油曲霉(Aspergillus sojae)是傳統(tǒng)食品發(fā)酵工業(yè)的主要生產(chǎn)菌種之一，有著悠久的應(yīng)用歷史［1］.主要是由于醬油曲霉向胞外分泌多種蛋白酶，這些蛋白酶具有對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品中植物蛋白的水解作用，該水解產(chǎn)物對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵食品的品質(zhì)起到至關(guān)重要的作用［1-2］.在這些胞外蛋白酶中，以堿性蛋白酶為主［3］，但該蛋白酶在大豆分離蛋白對(duì)大豆分離蛋白的水解效果，水解產(chǎn)物中的抗氧化肽，以及抗氧化肽的苦味等方面的研究仍未見(jiàn)報(bào)道.

采用蛋白酶水解大豆蛋白制備大豆活性肽可以促進(jìn)大豆蛋白的溶解，有利于人體對(duì)大豆蛋白的吸收、消化和利用.這些活性肽對(duì)人體還具有各種各樣的生理功能，如降血壓、血脂、膽固醇和抗氧化性等［4］.抗氧化肽能夠清除機(jī)體多余的自由基、以及維持機(jī)體內(nèi)自由基平衡的作用，從而對(duì)增強(qiáng)機(jī)體免疫力、延緩機(jī)體衰老具有功效；因此，抗氧化肽在食品、化妝品和保健品等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景［5］.

本研究以自制的重組醬油曲霉蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白進(jìn)行水解，以此制備抗氧化肽，并對(duì)該抗氧化肽的抗氧化性和苦味等方面進(jìn)行研究，為該重組蛋白酶對(duì)大豆蛋白深加工方面的應(yīng)用提供參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1 .1 菌株

重組醬油曲霉堿性蛋白酶工程菌株為韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保藏.

1.1 .2 主要試劑及材料

蛋白質(zhì)Marker購(gòu)于Fermentas公司；IMAC預(yù)裝柱（5 mL）購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司；木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、酪蛋白、苯硫脲（PTC）、大豆分離蛋白等購(gòu)于上海生物工程有限公司，其他相關(guān)的化學(xué)試劑均為分析純.

1.1.3 主要培養(yǎng)基的配制

YPD培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖.

BMGY培養(yǎng)基：稱取10 g酵母提取物、20 g胰蛋白胨，量取100 mL 1M磷酸鉀緩沖液（pH=6.0）、10 mL甘油，補(bǔ)水至1 000 mL.

BMMY培養(yǎng)基：稱取10 g酵母提取物、20 g胰蛋白胨，量取100 mL 1M磷酸鉀緩沖液（pH=6.0）于1 000 mL容量瓶中，補(bǔ)水至1 000 mL.

上述各培養(yǎng)基分裝后，115℃，高壓蒸汽滅菌20 min，備用.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2 .1 重組醬油曲霉堿性蛋白酶的制備

工程菌的活化：將保存于-20℃冰箱的菌種凍存管取出，取300 μL均勻菌液接種于盛有50 mL PDA培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中，30℃，180 rpm，振蕩培養(yǎng)24 h.

工程菌的誘導(dǎo)：將活化菌株接種于裝有50 mL BMGY培養(yǎng)基的150 mL三角瓶中后，30℃，180 rpm，振蕩培養(yǎng)3 d.取發(fā)酵液2 000 rpm離心10 min，棄上清，將菌體沉淀轉(zhuǎn)接于裝有150 mL BMMY培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，30℃，180 rpm，振蕩培養(yǎng)7 d，期間每隔24 h加入培養(yǎng)基體積的1%甲醇對(duì)工程菌株誘導(dǎo)產(chǎn)生重組蛋白酶.

重組醬油曲霉堿性蛋白酶的收集與純化：誘導(dǎo)7 d后，4 000 rpm離心20 min，取上清棄沉淀；經(jīng)80%硫酸銨鹽析、鎳柱親和層析、Sephadex G-75層析純化，通過(guò)SDS-PAGE鑒定.

1.2 .2 酶活測(cè)定

采用Folin-酚法測(cè)定酶活［6］：向?qū)嶒?yàn)組1.5 mL離心管中加入100 μL酶液和100 μL底物（2%酪蛋白溶液），向?qū)φ战M1.5 mL離心管中加入100 μL酶液和100 μLTCA.在40℃下水浴10 min，然后向?qū)嶒?yàn)組中加入200μL TCA，向?qū)φ战M中加入100 μL底物（2%酪蛋白溶液）.40℃水浴20 min，取出，12 000 rpm離心5 min，取上清300 μL于試管中，先后分別加入1.5 mL 0.4 M Na2CO3和300 μLFolin-酚，搖勻，40℃水浴20 min后，于波長(zhǎng)660 nm處測(cè)其吸光值.酶活單位的定義：40℃反應(yīng)溫度下，每分鐘水解酪蛋白后產(chǎn)生1μg酪氨酸即為1個(gè)酶活力單位.

1.2 .3 重組蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解

用0.05 M，pH=10的Gly-NaOH緩沖液配制濃度為5%大豆分離蛋白（SPI），在沸水浴中預(yù)處理10 min，冷卻后調(diào)pH為10，按酶/底物比分別為1 000 U/g、3 000 U/g、5 000 U/g、8 000 U/g分別加入重組醬油曲霉堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶，在40℃水浴處理1 h，期間適當(dāng)攪拌.

1.2 .4 大豆分離蛋白抗氧化肽的制備

按照1.2.2的水解產(chǎn)物通過(guò)等電點(diǎn)沉淀，離心、利用細(xì)菌過(guò)濾膜，利用10 kDa的超濾膜超濾，獲得的澄清黃色溶液即為大豆分離蛋白抗氧化肽溶液［7］.

1.2 .5 水解度（DH）的測(cè)定

采用甲醛滴定法：取5 mL的水解產(chǎn)物，加入60 mL的蒸餾水，用0.1 M NaOH的調(diào)節(jié)pH到8.2，加入20 mL已經(jīng)中和的甲醛（pH=8.2），然后用0.1 M的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到9.2，記錄消耗NaOH的體積V1，用緩沖液代替樣品，操作方法相同，測(cè)的空白體積為V0.

則樣品的水解度為：DH（%）=100(1 000×0.l×(V1-V0)/5.00/c-0.33)/7.8式中：c為樣品中原大豆分離蛋白的濃度，g/L；0.33為大豆分離蛋白中游離氨基酸的濃度，mmol/g；7.8為每克大豆分離蛋白的肽鍵當(dāng)量數(shù)，mmol/g.

1.2.6 抗氧化肽對(duì)DPPH自由基清除能力的測(cè)定

利用DPPH無(wú)水乙醇在517 nm有紫色團(tuán)的特征吸收峰，以分光光度計(jì)測(cè)定加入活性肽后，在517 nm處吸收值的下降表示其對(duì)DPPH自由基的清除能力［8-9］.在2 mL離心管中加入1 mL 2×10-4mol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液，再加入1 mL抗氧化活性肽的無(wú)水乙醇，混勻，在室溫下30 min后，517 nm處測(cè)得吸光值A(chǔ)I，同時(shí)測(cè)定1 mL 2×10-4mol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液與1 mL無(wú)水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)0，以及1 mL抗氧化活性肽與2 mL無(wú)水乙醇混合液的吸光值A(chǔ)J.DPPH自由基的清除率計(jì)算公式如下：

DPPH自由基的清除率（%）=[A0-(AI-AJ)]/A0×100%

1.2 .7 抗氧化肽的硫氰酸鐵測(cè)定法

向試管中加入1 mL抗氧化劑活性肽的無(wú)水乙醇溶液，然后加入1 mL 2.5%亞油酸無(wú)水乙醇溶液、2 mL 0.05 mol/L pH為7.0的磷酸緩沖液、1 mL蒸餾水，密封.空白對(duì)照以無(wú)水乙醇代替抗氧化活性肽，4℃保存.從0時(shí)刻開(kāi)始計(jì)，每24 h檢測(cè)一次.檢測(cè)時(shí)，取出0.1 mL亞油酸乳化液于空試管中，加入9 mL無(wú)水乙醇、0.1 mL 30%硫氰酸氨溶液、0.1 mL 0.02 mol/L溶于3.5%鹽酸的氯化亞鐵溶液，迅速混勻，反應(yīng)3 min后，于500 nm處檢測(cè)其吸光值.

1.2 .8 抗氧化肽的苦味評(píng)價(jià)

稱取PTC配成的濃度1/750 mol/L，編為1號(hào)液.并依次將1號(hào)溶液按倍比法稀釋.并編號(hào)為1～14號(hào)液，分別裝入消毒好的飲用杯中.將3種酶E/S為8 000 U/g制得的大豆多肽與不同濃度的PTC溶液進(jìn)行感官苦味評(píng)定，從而確定大豆多肽的苦味值.苦味評(píng)定小組由實(shí)驗(yàn)室9位有相關(guān)經(jīng)驗(yàn)的志愿者組成.進(jìn)行感官評(píng)定之前，要對(duì)評(píng)定小組成員進(jìn)行苦味評(píng)定培訓(xùn)，使其適應(yīng)苦味評(píng)定，品嘗結(jié)果的平均值為該樣品的最后苦味值.

2 結(jié)果與分析

2.1 重組醬油曲霉堿性蛋白酶的表達(dá)純化結(jié)果

對(duì)工程菌株誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白酶的純化結(jié)果如圖1所示.由圖1可見(jiàn)，箭頭指向的蛋白條帶為重組堿性蛋白酶，這是由于該蛋白酶基因推測(cè)的蛋白理論大小約為35.0 kDa，電泳所得的蛋白條帶與理論推測(cè)一致.由圖1進(jìn)一步表明本試驗(yàn)獲得了電泳純的重組蛋白酶.

2.2 重組堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解結(jié)果

重組醬油曲霉堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解結(jié)果如圖2所示：在E/S為1 000 U/g、3 000 U/g、5 000 U/g、8 000 U/g 的條件下，木瓜蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解度分別為1.64%、4.06%、6.21%、8.71%；重組醬油曲霉堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解度分別為7.83%、17.09%、19.53%、19.43%；堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解度分別為11.88%、12.23%、12.78%、14.78%.木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶隨著E/S的增加對(duì)大豆蛋白的水解度持續(xù)升高；而重組醬油曲霉堿性蛋白酶E/S達(dá)到5 000 U/g時(shí)對(duì)大豆分離蛋白的水解度趨于穩(wěn)定.總體而言，在E/S相同的情況下，重組醬油曲霉堿性蛋白酶的對(duì)豆分離蛋白的水解效率和水解程度均明顯高于商品化的木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶.

圖1 重組堿性蛋白酶的純化電泳圖

圖2 重組醬油曲霉蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解效果

2.3 抗氧化肽的抗氧化性分析

2.3 .1 抗氧化肽對(duì)DPPH自由基清除率

重組醬油曲霉堿性蛋白酶與2種商品化蛋白酶制備的抗氧化肽對(duì)DPPH自由的基清除率結(jié)果見(jiàn)表1.

由表1可知，隨著E/S的比例增加，制備的抗氧化肽對(duì)DPPH自由基的清除效果越強(qiáng)，當(dāng)E/S為5 000 U/g時(shí)，重組醬油曲霉堿性蛋白酶制備的抗氧化肽的清除率已經(jīng)達(dá)到了83.38%，明顯高于兩種商品化的蛋白酶.對(duì)于兩種商品化的蛋白酶而言，只有當(dāng)E/S為8 000 U/g時(shí)，對(duì)DPPH自由的清除率才為80%左右，都低于重組蛋白酶.

2.3 .2 抗氧化肽的硫氰酸鐵測(cè)定結(jié)果

抗氧化肽的硫氰酸鐵測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖3.由圖3可知，隨著亞油酸放置的時(shí)間越長(zhǎng)，被氧化的程度加深；經(jīng)過(guò)72 h后，重組堿性蛋白酶對(duì)亞油酸的抗氧化性都明顯高于兩種商品化酶的抗氧化性強(qiáng).但是3種蛋白酶制備的抗氧化肽與藥品抗壞血酸Vc相比，抗氧化性效果還是要弱些.

2.4 抗氧化肽的苦味評(píng)價(jià)結(jié)果

3種蛋白酶制備的抗氧化肽苦味評(píng)價(jià)結(jié)果為：重組醬油曲霉堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶的苦味值分別為10.3、9.2、9.0和8.5，沒(méi)有加酶的大豆分離蛋白水解液的苦味值為10.3，這表明未加酶水解的水解產(chǎn)物沒(méi)有苦味，3種酶制備的抗氧化肽中，重組醬油曲霉蛋白酶的苦味最低.

表3 抗氧化肽對(duì)DPPH自由基清除率結(jié)果 %

圖3 抗氧化肽的硫氰酸鐵測(cè)定結(jié)果

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)對(duì)重組醬油曲霉堿性蛋白酶工程菌株進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)，對(duì)發(fā)酵液通過(guò)鹽析、層析、透析和超濾濃縮等多種純化方法結(jié)合，獲得了電泳級(jí)純的重組醬油曲霉蛋白酶.本文的重組醬油曲霉蛋白酶對(duì)大豆分離蛋白的水解效果，以及制備的抗氧化肽的抗氧化能力及其低苦味等方面，均優(yōu)于商品化的木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶；這表明利用重組醬油曲霉蛋白酶具有較高的投入生產(chǎn)實(shí)踐的價(jià)值，并且該酶制備的抗氧化肽，比木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶制備的抗氧化肽具有更強(qiáng)的抗氧化性，這表明該抗氧化性肽在食品、化妝品和保健品等行業(yè)具有一定的應(yīng)用前景.

本研究相對(duì)于參考的幾篇文獻(xiàn)研究的內(nèi)容更廣更細(xì)致些，在此研究中課題組還探究了實(shí)驗(yàn)室所有的幾種酶水解大豆分離蛋白的抗氧化性的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，探究更好的酶解效益.當(dāng)然本研究還存在一些不足，在此研究中對(duì)抗氧化肽活性分子量大小、氨基酸的組成、結(jié)構(gòu)等方面研究較少.因此，在今后的研究中，需要進(jìn)一步對(duì)重組醬油曲霉蛋白酶水解大豆分離蛋白制備抗氧化肽的分子量分布、組成與結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行深入研究.同時(shí)有待于對(duì)重組醬油曲霉蛋白酶工程菌株的高密度發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵工藝、發(fā)酵動(dòng)力學(xué)以及最佳的補(bǔ)料方式等方面深入研究，以期提高重組蛋白酶的產(chǎn)量，為其開(kāi)發(fā)利用和替代市場(chǎng)現(xiàn)有商業(yè)化蛋白酶提供參考.

［1］Sumantha A，Larroche C，Pandey A.Microbiology and industrial biotechnology of food-grade proteases；a perspective[J].Food Technol ogy and Biotechnology，2006，44（2）：211-220.

［2］Lioe H N，Selamat J，Yasuda M.Soy sauce and its umami taste:A link from the past to current situation[J].Journal of Food Scie nce，2010，75（3）：R71-76.

［3］孫常雁，李德海，孫莉潔.傳統(tǒng)釀造醬及醬油中酶系的作用[J].中國(guó)食品添加劑，2009（3）：164-169.

［4］賈芳，陳復(fù)生，徐衛(wèi)河.大豆肽的制備方法及其生理活性研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2015，28（4）：12-14.

［5］劉文穎，谷瑞增，魯軍，等.大豆低聚肽中抗氧化肽的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2017，43（2）：44-48.

［6］中華人民共和國(guó)商業(yè)部.中華人民共和國(guó)專業(yè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶活力測(cè)定法SB/T10317-1999[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，1988.

［7］鄒險(xiǎn)峰，陳麗娜，吳瓊，等.木瓜蛋白酶水解大豆球蛋白酶的抗氧化性研究[J].食品研究與開(kāi)發(fā)，2017，38（4）：15-18.

［8］Yang B，Yang H，Li J，et al.Amino acid composition，molecular weight distribution and antioxidant activity of protein hydrolysates of soy sauce lees[J].Food Chemistry，2011（2）：551-555.

［9］蔡俊，陳季旺，王茹，等.多肽體外抗氧化活性測(cè)定方法的比較[J].食品科學(xué)，2016，37（11）：52-57.

Study of Antioxidant Peptides from Soybean Protein Isolate Hydrolyzed by the Recombinant Aspergillus Sojae Alkaline Protease

KE Ye，LIU Yuan-yuan，ZHU Yong-li，ZENG Song-rong，YIN Shuang，LIU Yu-ping，HE Lu-na
（Yingdong College of Life Sciences，Shaoguan University，Shaoguan 512005，Guangdong，China）

Soybean Protein Isolate(SPI)was hydrolyzed by the recombinant Aspergillus sojae alkaline protease(rAp),and the antioxidant peptides was obtained.further,the antioxidant activity and bitterness of antioxidant peptides were evaluated.The results showed rAp had relative high efficiency in SPI hydrolysis,the hydrolysis degree was 17.09%，under the E/S ratio of 3 000 U/g.When the E/S ratio was 5 000 U/g,DPPH free radical scavenging activity of the antioxidant peptides was 83.38%,and it also had strong antioxidant properties of linoleic acid,and its bitterness was not obvious.Under the same conditions,the hydrolysis efficiency of rAp,the activity and low bitterness of antioxidant peptides were better than that of commercial proteases,such as alkaline protease and papain.All these results proved that the rAp had good application potentials,and antioxidant peptides had also good application prospects in cosmetics,feed and food industry.

recombinant aspergillus sojae alkaline protease(rAp)；soybean protein isolate(SPI)；antioxidant peptides

S565.1

A

1007-5348（2017）09-0051-05

2017-04-10

韶關(guān)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新培育項(xiàng)目(pdjh2016b0452)；廣東省教育廳特色創(chuàng)新項(xiàng)目(2015KTSCX126).

柯野(1977-)，男，四川瀘縣人，韶關(guān)學(xué)院英東生命科學(xué)學(xué)院副教授，博士；研究方向：微生物學(xué)和生物工程.

（責(zé)任編輯：邵曉軍）