準東油田萘降解菌群培養及菌群雙加氧酶基因多態性分析

馬鵬　杜雪柯　李文靜

摘要：采用無機鹽培養基，以萘為惟一的碳源物質對準東油田石油污染土壤中的萘降解菌進行液體富集培養。經過5次培養后，利用固體平板對獲得菌群萘降解能力進行檢測，同時利用HPLC對降解產物進行檢測。離心收集富集培養基中的菌體，提取基因組DNA，基于Illumina Miseq測序平臺對16S rRNA序列進行測序及生物信息學分析，同時采用萘雙加酶基因通用引物對萘雙加氧酶基因片段進行擴增、測序及分析。結果表明，含有萘的固體平板有清晰透明斑的出現；高效液相檢測結果顯示，萘被降解成小分子產物，證明液體培養基可富集培養獲得萘降解菌群。萘降解菌群16S rRNA測序比對結果顯示，富集培養獲得菌群分屬于5門9綱15目24科31屬，共33種細菌。另外共獲得萘雙加氧酶基因片段11條，GenBank注冊號為KY304819-KY304829。系統發育樹結果顯示，所獲萘雙加氧酶基因分為4個類群。通過HPLC及雙加氧酶基因的分子檢測，驗證已從準東油田石油污染土壤當中富集培養獲得萘降解菌群。

關鍵詞：萘降解菌；高效液相色譜；細菌菌群；萘雙加氧酶基因；淮東油田

中圖分類號：Q938.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）19-3726-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.19.033

Abstract： According to the literature， liquid enrichment medium supplemented with naphthalene as the sole carbon was used to culture the naphthalene degrading microbial consortia from the contaminated soil in Xinjiang Zhundong oilfield. After 5 repeated cultivation， the degradation ability of microbial consortia was detected by the clarity circle method on plate， and the degradation products were detected by HPLC. In addition， the enriched microbial consortia were collected by centrifugation. The genomic DNA were isolated from the microbial consortia and the 16S rRNA gene was amplified and sequenced based on Illumina Miseq sequencing platform. Besides， the the naphthalene dioxygenase genes were amplified with universal primers for sequencing and bioinformatics analysising. The 16S rRNA sequencing results showed that the enriched microbial consortia were divided into 5 phyla， 9 classes， 15 orders， 24 families， 31 genera and 33 species. In addition， a total of 11 naphthalene dioxygenase gene segments were obtained and GenBank accession numbers were KY304819-KY304829， which could be divided into 4 clusters by phylogenetic analysis. Through the HPLC and naphthalene dioxygenase gene molecular detection proved that naphthalene degrading microbial flora have been obtained through the liquid enrichment culture.

Key words： naphthalene degrading bacteria；high performance liquid chromatography；microbial consortia；naphthalene dioxygenase gene；Zhundong Oilfield

石油是一種重要的化石能源物質，在其帶來巨大經濟效益的同時，也對生態環境造成了嚴重影響，石油化工產品生產過程中的泄漏以及不完全燃燒進入環境造成的有機污染已有報道[1]。多環芳香烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指具有兩個或兩個以上苯環的一類碳氫化合物，是進入環境中的有機污染物危害最大的一類物質，污染物面積和濃度在逐年增加，已嚴重威脅到人類的身體健康[2]。該家族包括150多種成員，如萘、蒽、菲、芘等，美國環境保護署已將其中的16種多環芳烴列為優先考慮污染物[3]，其中較高分子量（四環以上）的PAHs由于難以降解，因此其毒性可以在環境當中持續存在。石油滲漏到環境后會破壞原有土壤理化性質，尤其會降低土壤的滲透性，其中所含多環芳烴還會降低土壤微生物多樣性，從而影響土壤酶活性，造成土壤肥力下降[4]。如果有機污染物滲漏至農田，其中多環芳烴還會隨食物鏈進行積累，引發人體組織器官的癌變甚至器官的衰竭[5]。

微生物降解被認為是去除PAHs環境友好且成本低廉的有效手段[6]。分子量過大的PAHs需要不同微生物進行共代謝降解[7]，而萘作為分子結構簡單的多環芳烴常被當作模式有機污染物進行研究，已獲得多株萘降解能力的菌株[8]。微生物降解萘的代謝過程中的關鍵酶萘雙加氧酶，其活性中心具有相對較小的結構上的保守性，加之能活化分子氧，因此它們的底物范圍較為廣泛，且不同菌株來源的萘雙加氧酶的底物范圍和催化性能的差異比較大[9]。萘雙加氧酶基因也常被作為微生物是否具有萘降解的能力，或者不同土壤微生物菌群降解萘的潛力進行分子檢測[10]。

萘雙加氧酶催化能力差異較大，因此篩選高效降解菌進行污染物的原位修復仍是未來工作的重點[11]。本研究采集新疆準東油田石油污染沙質土壤作為研究對象，沙質土壤中營養物質缺乏，原油滲漏后所含烴能給微生物提供足夠的碳源，沙質土壤中原核微生物多樣性往往大于背景土壤[12]。因此，從原油污染的沙質土壤中更容易篩選到降解能力較強的菌株，目前該區域多環芳烴降解菌株鮮見報道。本研究通過液體富集培養獲得萘降解微生物菌群，并通過16S rRNA測序分析及萘雙加酶基因片段的克隆，分析從準東油田獲得的萘降解菌群結構以及萘雙加氧酶基因的多態性，以期為高效降解菌的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 材料 樣本取自新疆準東油田采油區，采集了3份石油污染年限在5年以內的不同沙質土壤樣品。剝去表層雜物，采集的土樣裝入無菌聚丙烯塑料袋中，實驗室-4 ℃保存，等量混合3份土樣備用。

1.1.2 培養基 萘降解菌液體富集培養基為無機鹽基礎培養基（MBS），由大量（90 mL）和微量元素 （1 mL）兩部分組成。大量元素成分為1.0 g/L （NH4）2SO4，0.8 g/L K2HPO4、0.2 g/L KH2PO4、0.2 g/L MgSO4·7H2O、0.1 g/L CaCl2·2H2O、0.005 g/L FeSO4·7H2O；微量元素成分為0.039 9 g/L MnSO4·H2O、0.042 8 g/L ZnSO4·H2O、0.034 7 g/L （NH4）6Mo7O24·4H2O[13]、pH 7.0±0.2，121 ℃滅菌30 min。固體培養基添加1.5%的瓊脂粉。

1.2 方法

1.2.1 萘降解菌的富集培養 稱取10 g石油污染土壤加入91 mL的液體富集培養基中，加入0.05 g萘作為惟一碳源及能源物質，180 r/min、32 ℃避光培養7 d。培養結束后吸取10 mL液體富集培養液離心收集菌體，再加入滅菌培養基洗脫菌體，加入到新的液體培養基中（為了消除或減小最初石油污染土壤中所殘存的碳源物質），繼續培養7 d，重復5次，轉接過程為無菌操作。高效液相色譜檢測樣本為液體培養96 h后的樣本（外源添加萘肉眼不可見）。

1.2.2 萘降解菌降解能力的固體平板檢測 液體富集培養結束后，吸取0.1 mL液體培養基，涂布于固體培養基平板上（固體培養基冷卻后，再加入0.2 mL 0.5%的萘丙酮溶液，用玻璃涂布棒涂布均勻，無菌風吹干，涂布有萘的無機鹽固體培養基表面呈磨砂狀），置于32 ℃培養箱中倒置培養。

1.2.3 高效液相色譜法檢測萘降解產物 利用高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）檢測萘降解菌群的降解產物。在液體培養基中加入15 mL的乙酸乙酯充分振蕩，靜置5 min，吸取有機相于干凈的燒杯中，重復2次。將含降解產物的乙酸乙酯12 000 r/min離心3 min，將上清液轉移至干凈容器內，干燥后加1 mL的甲醇溶液進行溶解。測試條件：甲醇和水（體積比82∶18）為流動相，流動速度為1 mL/min，進樣量為10 μL，檢測波長為270 nm，C18柱，整個過程溫度40 ℃[14]。

1.2.4 萘降解菌群多樣性檢測 離心收集5 mL菌液當中的菌體，采用生工生物工程（上海）股份有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒提取萘降解菌基因組DNA。委托上海美吉生物醫藥科技有限公司利用Illumina Miseq測序平臺進行細菌16S rRNA基因序列的測定工作，測序引物為515F（5′-GTGCCA GCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTT TRAGTTT-3′）[15]。測序結果利用Usearch軟件將獲得的DNA序列劃分為不同的OTUs（Operational Taxonomic Units），將相似性高于97%以上的序列歸為同一個OTU。采用Qiime平臺使用silva數據庫對萘降解菌在屬的水平上統計每個樣品的群落組成[16]。

1.2.5 萘雙加氧酶基因片段的克隆分析

1）DNA提取及萘雙加氧酶基因片段PCR擴增。離心收集5 mL富集培養菌液當中的菌體，采用生工生物工程（上海）股份有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒提取萘降解菌基因組DNA。采用萘雙加氧酶基因（nah基因）的通用引物NAH-F（5′-CAA AARCACCTGATTYATGG-3′）、NAH-R（5′-AYRCG RGSGACTTCTTTCAA-3′），以微生物菌群總DNA為模板進行PCR擴增。PCR反應條件參照文獻[17]的方法進行。為了消除PCR單次擴增的偏向性，平行擴增3個重復，用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

2）萘雙加氧酶基因克隆文庫構建與RFLP分型篩選陽性克隆子。將凝膠回收產物與pUC18 T載體連接，轉E.coli DH5α感受態細胞，進行藍/白斑篩選。從文庫中隨機挑取96個白斑，構建準東油田液體富集培養萘降解菌群中萘雙加氧酶基因的克隆文庫。

提取克隆文庫質粒DNA作為模板，采用M13-F和M13-R引物對進行PCR擴增，反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，51 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min；4 ℃保溫。PCR擴增篩選的陽性克隆子PCR產物，用限制性內切酶Hha I、Rsa I和Hinf I進行酶切，酶切產物用2.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，將不同RFLP條帶相對應的克隆子送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序分析，測序并比對正確的DNA與氨基酸序列信息提交至GenBank數據庫。

3）系統發育分析。將測序獲得的萘雙加氧酶基因序列在GenBank中進行Blast同源性比對，下載相似性最高的萘雙加氧酶基因作為標準序列，用MEGA 5.0軟件采用鄰接法（Neighbor-Joining）進行聚類分析，并構建系統進化樹。利用該軟件對萘雙加氧酶氨基酸序列進行進化距離估計及分子鐘假設的檢驗[18]。

2 結果與分析

2.1 菌體萘降解能力固體平板檢測

每階段液體富集培養結束后，肉眼觀察可以明顯看出，隨著固體萘體積的縮小液體逐漸呈渾濁狀態，三角瓶壁有菌苔出現，而對照僅含有萘的無機鹽培養基，7 d后搖瓶中萘肉眼可見。吸取最后一次的富集培養液0.1 mL，均勻涂布于含萘固體培養基上，96 h后固體培養基中出現明顯的透明斑（圖1），推測是以萘為碳源的細菌在培養基上生長對萘進行吸收或分泌胞外酶降解萘，固體平板檢測結果顯示液體富集獲得了萘降解菌株。

2.2 萘降解產物的高效液相檢測

對第5次液體富集培養液再進行轉接，96 h后進行高效液相檢測，確認通過液體富集培養是否獲得了萘降解菌，結果見圖2、圖3。萘標準品的保留時間為4.591 min，而液體富集培養液提取物在7.5 min時出現一個大的吸收峰，6.7 min時出現一個小吸收峰。HPLC試驗結果證明，液體培養基中所添加的萘已被降解，產生了2個分子量小于萘的不同降解產物，而這2個組分的降解產物有待進一步研究及分析。

2.3 萘降解菌的分類學鑒定

采用RDP Classifier貝葉斯算法對97%相似水平的操作單元代表序列進行分類學分析，并在各個水平（門、綱、目、科、屬、種）統計樣品的群落組成。萘降解菌群均屬于真細菌域，分屬5門（Actinobacteria、Armatimonadetes、Bacteroidetes、Firmicutes、Proteobacteria）9綱15目24科31屬，共33種細菌。萘降解菌群在屬水平上的分類情況如表1所示。

從表1可以看出，菌株百分比達到1%的只有7個屬，分別為紅球菌屬（Rhodococcus）45.18%，申氏桿菌屬（Shinella）19.58%，產堿菌科中一個未分類的屬（Alcaligenaceae_unclassified）19.56%，根瘤菌屬（Rhizobium）9.58%，叢毛單胞菌科中一個未分類的屬（Comamonadaceae_unclassified）1.19%，金黃桿菌屬（Chryseobacterium）1.11%，Arcticibacter屬1.09%。其中近半數的降解菌屬于紅球菌屬。

2.4 同源性比對分析

搖瓶nah基因克隆文庫共獲得萘雙加氧酶基因片段11條，DNA序列信息與氨基酸序列信息提交至GenBank數據庫，GenBank注冊號為KY304819-KY304829。將獲得的nah基因在GenBank中進行同源比對，比對結果如表2所示。分析結果顯示，從準東油田石油污染土壤中以萘為惟一碳源的液體富集培養獲得的萘雙加氧酶基因豐度最高的僅3個類型，共占文庫89%以上。編號為Y-nah14和Y-nah85的克隆同源比對相似性為92%和85%，表明準東油田石油污染土壤中可能蘊含著獨特的萘降解菌株。

2.5 萘雙加氧酶基因系統發育分析

將獲得的11個萘雙加氧酶基因序列在GenBank中進行Blast相似性比對，將相似性較高的序列作為標準序列，利用MEGA 5.0軟件采用鄰接法聚類分析構建系統發育樹（圖4）。系統發育樹結果顯示，從準東油田石油污染土壤中以萘為惟一碳源的液體富集培養獲得的萘雙加氧酶基因分為4個類群。第1類群含有5條序列，第4類群含有4條序列，其余兩個類群各含有1條序列。第3類群和第4類群序列之間相似性低于91%外，其余類群兩兩之間相似性均低于83%。其中第1類群和第4類群各序列之間的相似性均高于98%。此外，萘雙加氧酶Blast同源比對得分最高的序列多來自于石油污染土壤中免培養細菌，僅一條序列來自于Pseudomonas（假單胞菌屬）菌株的萘雙加氧酶基因。比對來源于免培養細菌nah基因標準序列，其中2條來自大慶油田石油污染土壤，相似性均高于98%（KJ371806、KJ371655），而試驗獲得的nah基因卻與已發表的來源于克拉瑪依油田nah基因序列信息相似性均低于97%[19]。

2.6 萘雙加氧酶α亞基氨基酸序列分析

將萘雙加氧酶基因序列翻譯成氨基酸序列，使用ClustalX2軟件進行序列多重比對，可以看出獲得的11條萘雙加氧酶基因，僅編碼8條氨基酸序列，Y-nah2與Y-nah6，Y-nah33與Y-nah91和Y-nah1與Y-nah52編碼的萘雙加氧酶α亞基氨基酸序列相同（圖5）。

將所獲的萘雙加氧酶氨基酸序列進行分子鐘假設的檢驗，發現來源于準東油田石油污染土壤的萘雙加氧酶為同一起源，Y-nah1所在分支進化速度較快（圖6）。

3 結論

石油成分復雜，并隨產地不同其所含各種烴類的結構和所占比例相差很大，滲漏后會產生其獨特的有機污染物降解菌群。如果能從中篩選特定有機物降解菌群進行污染物的原位修復，可避免采用外來菌株受到土著微生物的競爭捕食作用，因此，篩選廣譜多底物降解高效菌仍是今后一段時間工作的熱點。新疆儲量豐富的石油、天然氣資源已在中國經濟建設中發揮重要作用，但在幾十年的原油開采過程中，難免會有原油污染物隨開采加工過程進入土壤。準東油田位于準噶爾盆地東部，采油區多與古爾班通古特沙漠重合。沙漠土壤微生態環境脆弱，因此原油污染極易改變其微生物菌群，并孕育特殊的污染物降解菌群，但目前鮮見針對新疆準東油田開展的原油污染土壤中芳香烴降解酶基因多態性以及石油污染土壤中不同污染物降解菌株分離的研究報道。

本研究選擇萘作為限制性培養因子，是因為萘相對稠環芳香烴類化合物，揮發性和極性較大，增加了其與菌株接觸的幾率；另外，苯環越少相對越容易降解，因而其相應的代謝菌株比較容易獲得。本研究結果可為進一步分離萘降解菌單菌株提供菌株分類信息以及功能基因序列信息，并為進一步富集培養獲得不同石油污染物降解菌提供方法上的借鑒。

液體培養基富集培養液狀態觀察、菌群降解能力固體平板檢測以及HPLC檢測結果均顯示，準東油田石油污染土壤當中的確含有萘降解菌株，且具有較高的降解能力。這些萘降解菌株是可以通過液體富集培養獲得的，并且可以通過固體平板獲得萘降解的單菌株，推測獲得的萘降解單菌株含有降解萘功能基因的完整基因簇，能獨立降解萘。從萘降解菌群多樣性測序結果來看，菌株相對含量百分比達到1%的有7個屬，而從液體富集培養基中克隆的萘雙加氧酶基因片段卻有11條，氨基酸序列為8條，這提示后續試驗應該將nah基因作為篩選單菌落的一個標準，從而更多地獲得萘降解單菌株。

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