葉綠素皂化反應條件的優化研究

張雪，郭宗明＊，李英，趙芳

（1.煙臺南山學院，山東煙臺 265713；2.龍口市檢驗檢測中心，山東煙臺 265700）

葉綠素皂化反應條件的優化研究

張雪1，郭宗明1＊，李英1，趙芳2

（1.煙臺南山學院，山東煙臺 265713；2.龍口市檢驗檢測中心，山東煙臺 265700）

葉綠素的皂化反應實驗中常出現絮狀渾濁、分層不清晰等異常現象。為避免這些異常現象的發生，本文運用單因素實驗和正交實驗設計方法研究葉綠素皂化反應的優化條件。研究結果表明，皂化反應優化條件為：葉綠素皂化反應的試劑加入量的最佳配比為葉綠素提取液1mL、乙醚4mL、蒸餾水3mL、30%KOH-甲醇4mL，皂化反應的效果最佳。

葉綠素；皂化反應；正交實驗

葉綠素是存在于綠色植物中的天然色素，其分子結構包括一個親水的頭部和一個親脂的尾部，親水頭部由四個吡咯環以氮原子與鎂原子構成的卟啉骨架。卟啉具有極性，親水，可以與蛋白質結合。尾部的葉綠醇是由四個異戊二烯單位組成的雙萜，是一個親脂的脂肪鏈，其決定了葉綠素的脂溶性。

葉綠素是葉綠酸的酯，葉綠酸是雙羧酸，一個羧基被甲醇酯化，另一個被葉綠醇酯化。葉綠素可以與堿發生皂化反應而生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，產生的鹽能溶于水[1]，用此法可將葉綠素與類胡蘿卜素分開。在實驗過程中，發現皂化反應的現象有差異[2]。皂化反應分層狀況不一，有的上層為黃色的乙醚溶液，下層為綠色的酒精溶液；有的兩層之間有一層淺色乳白色的溶液層或乳膠狀的薄層；有的分層效果非常好。呈現上下的黃綠兩層。為了較好解決皂化反應的存在不一致問題。開展了葉綠素皂化反應的實驗條件的優化研究。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

原料：新鮮的菠菜葉。試劑：無水乙醇、30%KOH-甲醇溶液、乙醚。

1.2 葉綠素的提取

取新鮮菠菜葉片洗凈、吸干，稱量5g葉片，剪碎后放入研缽中，加少量碳酸鈣和石英砂，2～3mL無水乙醇，研磨成糊狀，再加2～3mL無水乙醇，過濾得到色素提取液[3-4]。

1.3 皂化反應的單因素試驗設計

取1mL葉綠素提取液，以蒸餾水，甲醇，乙醚三種試劑分別作為單變量，按2、3、4、5mL分別加入試管進行實驗分析。觀察蒸餾水、甲醇、乙醚的加入量對皂化反應的影響。

1.4 皂化反應的正交試驗設計

在單因素分析的基礎上，采用二水平四因素的正交試驗設計[5]，研究試劑使用量對皂化反應的影響。正交試驗設計見表1。

表1 葉綠素皂化實驗正交試驗設計表

1.5 皂化反應效果的評價標準

以分層清晰度、渾濁層厚度、液層顏色這三個方面來判定葉綠素皂化反應的實驗效果，每項指標滿分為20分，分4個等級，每個等級分別為5、10、15、20分，具體見表2。

表2 葉綠素皂化實驗效果的評價標準

2 實驗結果與討論

2.1 單因素實驗結果

以葉綠素皂化反應出現分層、界限清晰，無渾濁層、上黃色下綠色為最佳判斷標準。單因素實驗結果見表3、表4和表5.結果顯示，蒸餾水、甲醇、乙醚三種試劑的加入量分別為3、4mL時皂化反應現象明顯。

表3 水的單因素實驗結果

表4 甲醇的單因素實驗結果

表5 乙醚的單因素實驗結果

表6 二水平四因素正交實驗結果

常世民對葉綠素皂化反應實驗中出現的乳化現象進行研究，提出加入幾滴1%～3%NaCl代替蒸餾水和用稀酸代替蒸餾水的改進方法。單因素實驗的結果表明，不需加入鹽或酸，只要把握好參與皂化反應的試劑的用量，就能達到很好的實驗效果。

2.2 正交實驗結果

根據正交試驗設計，做出16組皂化反應實驗。從分層清晰度、渾濁層厚度、液層顏色三方面對16組皂化反應的結果進行評價。由表6可知，四個因素中對皂化反應影響最大的是乙醚（B），其次是葉綠素提取液（A）和蒸餾水（C），影響最小的因素30%的氫氧化鉀-甲醇液（D）。從皂化反應的結果評價分值看，皂化反應的試劑加入量的最佳配比為A1B2C1D2（圖1），即葉綠素提取液1mL、乙醚4mL、蒸餾水3mL、30%KOH-甲醇4mL皂化反應效果最佳。將正交實驗結果評價得分為58分以上的幾組再次進行皂化反應，對皂化反應的實驗效果進行比較評價，確定皂化反應的試劑加入量的最佳配比為A1B2C1D2。

2.3 皂化反應優化條件下效果

皂化反應優化條件A1B2C1D2下，反應效果如圖1所示。

圖1 A1B2C1D2皂化反應結果圖

葉綠素與堿發生皂化反應生成醇（甲醇和葉綠醇）和葉綠酸的鹽，葉綠酸鹽的分子極性大，易容于水中，不能進入乙醚層中，而類胡蘿卜素在乙醚中的溶解度大于在醇溶液中。說明在葉綠素皂化反應后乙醚是促進形成液體分為上層（黃色）下層（綠色）的關鍵因素。正交實驗的結果證明，乙醚是影響葉綠素皂化反應的最主要因素，其次葉綠素提取液和蒸餾水，兩者對皂化反應的影響大致相同，而30%氫氧化鉀-甲醇對皂化反應的影響最小。從16組正交實驗的結果看，乙醚為4mL的皂化反應結果明顯好于乙醚為3mL的皂化反應結果。乙醚溶解類胡蘿卜素，加入適當多的乙醚能促進葉綠素與類胡蘿卜素很好地分離，達到理想的葉綠素皂化反應實驗效果。

3 結論

由單因素和正交實驗結果可以得知，葉綠素皂化實驗的效果與水、乙醚、甲醇三個因素密切相關。乙醚微溶于水的性質決定皂化反應實驗中胡蘿卜素色素與葉綠酸鹽的分離，但黃色、綠色分層清晰，乙醚的用量是關鍵因素。

[1]凃大正.植物生理學,修訂本[M].長春:東北師范大學出版社,1998.

[2]常世民.葉綠素皂化反應釋疑及改進方法[J].廊坊師范學院學報,2001,17(4):83-84.

[3]楊國恩,吳志平,李坤平,等.竹葉葉綠素的提取及其性質的穩定性[J].中南林學院學報,2005,25(3):106-110.

[4]吳榮金,林澤浩,陳鍵,等.鳳眼蓮葉葉綠素的提取及其性質的穩定性[J].儀器儀表與分析檢測,2007，(1):32-33,39.

[5]杜雙奎,李志西.食品試驗優化設計[M].北京:中國輕工業出版社,2011.

Study on the Optimization Condition of Chlorophyll Saponification Reaction

Zhang Xue1,Guo Zong-ming1*,Li Ying1,Zhao Fang2
(1.Yantai Nanshan University,Yantai Shandong 265713;2.Inspection and Testing Center of Longkou City,Yantai Shandong 265700)

It often occurs abnormal problems such as floc and blurred liquid layer in the experiment of the chlorophyll saponification reaction.In order to solve this question,we explored the optimization condition of chlorophyll saponification reaction based on one-factor at a time and orthogonal array design methods.The results prove that the best proportion of reagents used in the chlorophyll saponification reaction is conducted by chlorophyll extract for 1mL diethyl ether for 4mL,distilled water for 3mL and sodium hydroxide- methanol solution 30% for 4mL.

Chlorophyll;Saponification reaction;Orthogonal array design

O621.25

A

2096-0387（2017）05-0060-03

山東省教育科學研究課題項目（16SC100）。

張雪（1994—），女，河南焦作人，本科，研究方向：食品質量控制與安全管理。

郭宗明（1966—），男，江蘇徐州人，博士，副教授，研究方向：營養分析與檢測。