枸杞多糖對中波紫外線照射HaCaT細胞低氧誘導因子1α、血管內皮細胞生長因子表達的影響

張洪長 左立春 孫海才 律廣富 李娜 林喆

130117長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研究開發中心（張洪長、律廣富、李娜、林喆）；長春中德骨科醫院（左立春、孫海才）

枸杞多糖對中波紫外線照射HaCaT細胞低氧誘導因子1α、血管內皮細胞生長因子表達的影響

張洪長 左立春 孫海才 律廣富 李娜 林喆

130117長春中醫藥大學中醫藥與生物工程研究開發中心（張洪長、律廣富、李娜、林喆）；長春中德骨科醫院（左立春、孫海才）

目的探討枸杞多糖對中波紫外線（UVB）照射HaCaT細胞低氧誘導因子1α（HIF?1α）、血管內皮細胞生長因子（VEGF）的表達。方法將常規培養的HaCaT細胞，分為對照組和枸杞多糖給藥組（12.5、25.0、50.0、100.0 μg/ml濃度），各組在給藥4 h后同時進行不同強度UVB（0、20、40、60 mJ/cm2）照射，培養24 h。用CCK?8法檢測細胞生存率。酶生化法檢測細胞內超氧化物歧化酶（SOD）的活性；RT?PCR及Western印跡檢測HIF?1α、VEGF基因及蛋白的表達。結果對照組同照射劑量比，枸杞多糖（12.5、25.0、100.0 μg/ml濃度）各組不同程度提高UVB照射損傷細胞的生存率（P＜0.05），以50.0 μg/ml枸杞多糖組升高最明顯，差異有統計意義（P＜0.01）。枸杞多糖各給藥組SOD活性以50.0 μg/ml SOD活性升高最明顯，差異有統計學意義（P＜0.01）。隨著UVB照射劑量（20、40、60 mJ/cm2）增加，HIF?1α、VEGF基因、蛋白的表達也逐漸增高，與對照組相比，50.0 μg/ml枸杞多糖給藥組能夠有效降低細胞內HIF?1α、VEGF基因及蛋白的表達，差異有統計意義（P＜0.05）。結論枸杞多糖通過對HaCaT細胞內HIF?1α、VEGF基因及蛋白表達的影響，可能參與預防UVB照射損傷的過程。

紫外線；枸杞；多糖類；內皮生長因子；低氧誘導因子1α；HaCaT細胞

機體受低劑量UVB照射后，可產生大量氧自由基，引起強烈的脂質過氧化反應，導致細胞、組織損傷［1］，基因突變，從而有產生癌變的可能［2］。SOD是過氧化物的清除劑，是最有效的抗氧化劑和自由基清除劑［3］。低氧誘導因子1α（HIF?1α）是HIF轉錄復合體成員之一，與細胞衰老和腫瘤有密切的關系［4］，而UVB照射HaCaT細胞可增強HIF?1α及其下游的血管內皮細胞生長因子（VEGF）蛋白表達［5］。枸杞多糖是從枸杞子提取的有效成分之一，具有較強的生理活性，如清除機體自由基［6］，抗腫瘤［7］等。目前對枸杞多糖抗UVB照射［8］損傷HaCaT細胞的報道較多，但對影響HIF?1α、VEGF表達的相關報道不多見。本研究采用枸杞多糖處置HaCaT細胞、UVB照射后，觀察其對細胞生存率、SOD的活性及HIF?1α、VEGF基因蛋白表達的影響，以闡明枸杞多糖預防UVB照射所致皮膚癌發生的可能機制。

一、資料與方法

（一）資料：HaCaT細胞購于中南大學湘雅中心實驗室細胞庫。枸杞多糖（＞50%純度）購于成都克洛瑪生物科技有限公司。胎牛血清購于美國Thermo公司，DMEM培養基購于美國Gibco公司。CCK?8細胞增殖毒性檢測試劑盒、RNA?OUT總RNA提取試劑盒、總蛋白定量測試盒（BCA法）、SOD試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。HIF?1α、VEGF和β肌動蛋白引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。鼠抗人HIF?1α、VEGF單克隆抗體、鼠抗人β肌動蛋白、單克隆抗體均購自美國Novus公司。羊抗小鼠二抗購于北京康為世紀公司。

（二）方法：

1.枸杞多糖溶液的配制：稱取枸杞多糖原粉，溶解于DMEM培養液中，配制成1 mg/ml濃度的枸杞多糖試驗用液10 ml，無菌條件下，0.22 μm微孔濾膜過濾后4℃保存備用。

2.細胞分組與干預：將對數生長期的HaCaT細胞，接種于含有10%胎牛血清DMEM培養基的培養皿中，37℃、5%CO2的細胞培養箱內常規培養；分為對照組和枸杞多糖組（12.5、25.0、50.0、100.0 μg/ml濃度），給藥組在給藥4 h后與對照組同時進行UVB（0、20、40、60）mJ/cm2照射；照射后繼續給藥培養24 h。照射劑量（mJ/cm2）=照射強度（W/cm2）×照射時間（s）。

3.CCK?8法檢測細胞生存率：選擇生長良好的HaCaT細胞，以每孔5 × 105ml?1濃度的細胞懸液200 μl，接種于96孔板中；檢測時吸出培養基，每孔加入不含胎牛血清的DMEM培養液100 μl及10 μl CCK?8，CO2培養箱中孵育2 h，用酶聯免疫檢測儀測定450 nm波長下的吸光度（A）值，換算為細胞增殖率。細胞生存率=實驗組A值/無照射對照組A值×100%。

4.SOD活性檢測：將種于6孔板的HaCaT細胞2 ml（5×105/ml），吸去上清，用PBS沖洗3遍，加入0.2 ml RIPA裂解液，待細胞破碎完全，用刮刀將細胞刮下，移至微量離心管中，10 000×g離心30 min，收集上清液置-80℃冰箱待測。將收集好的細胞裂解上清液置于2℃冰箱內融化，分別按照SOD試劑盒的操作步驟進行實驗。

5.RT?PCR檢測HIF?1α、VEGF mRNA表達：將對數生長期的HaCaT細胞，以5×105/ml接種于6孔培養板中，選給藥的最佳濃度組（50.0 μg/ml），按3培養處置細胞后；用Trizol提取細胞總RNA，反轉錄合成cDNA，RT?PCR方法測定HIF?1α、VEGF mRNA的表達。以β肌動蛋白為內參照。PCR反應條件：94 ℃變性5 min（94 ℃、30 s；60 ℃、30 s；72 ℃、30 s）× 35個循環，72 ℃延伸5 min。HIF?1α正向引物：5′?TCCATGTGAC CATGAGGAAA?3′；反向引物5′?TATCCAGGCTGTGTCGACT G?3′，擴增產物片段長度338 bp。VEGF正向引物：5′?GGCC TCTGAAACCATGAACT?3′，反向 引 物：5′?ATGCTGCAGGAA GCTCATCT?3′，擴增產物片段長度385 bp。β肌動蛋白正向引物5′?AGTTGCGTTACACCCTTTC ?3′；反向引物5′?CCTTC ACCGTTCCAGTTT?3′，擴增產物片段長度152 bp。擴增產物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠圖像分析系統進行圖像采集與分析。以目的基因與β肌動蛋白mRNA電泳帶的灰度比值作為目的基因的相對表達量。實驗重復6次，取均值。

6.Western 印跡檢測HIF?1α、VEGF蛋白表達：將對數生長期的HaCaT細胞，以5×105/ml接種于6孔培養板中，選給藥的最佳濃度組（50.0 μg/ml）；PBS漂洗2次，加入細胞裂解液RIPA，冰上靜置15 min后收集裂解液，-80℃保存備用。將上述裂解產物反復凍融裂解3次，10 000×g離心30 min，按照BCA?200蛋白定量試劑盒說明書進行蛋白定量。取50 μg蛋白，經SDS?PAGE凝膠電泳分離后，轉移至PVDF膜上，用封閉液封閉后，分別加入單克隆抗體HIF?1α、VEGF抗體（1∶250），37℃作用2 h；TBST 洗滌3次，每次10 min；加入稀釋羊抗小鼠IgG（1∶5 000）二抗，室溫作用1 h；洗膜后加化學發光劑ECL反應1 min，曝光、沖洗后掃描蛋白條帶。以目的蛋白與β肌動蛋白蛋白條帶灰度比值作為目的蛋白相對表達量。

7.統計學方法：實驗數據采用SPSS 13.0統計軟件進行數據分析。各組細胞增殖率、SOD活性、HIF?1α及VEGF基因和蛋白表達水平以±s表示，多組間樣本均數比較采用單因素方差分析；兩兩比較采用t檢驗。

二、結果

1.HaCaT細胞生存率比較：CCK?8法檢測結果顯示，隨著照射劑量（20、40、60 mJ/cm2）增加，細胞的生存率逐漸下降；與對照組比較，各給藥組細胞的生存率均有升高，其中枸杞多糖12.5、25.0、100.0 μg/ml組與對照組比較，P＜ 0.05，枸杞多糖50.0 μg/ml組細胞生存率升高最明顯，P＜0.01，差異有統計學意義。見表1。

表1 對照組和枸杞多糖各組HaCaT細胞生存率比較（%，±s）

表1 對照組和枸杞多糖各組HaCaT細胞生存率比較（%，±s）

注：n=6。a：與對照組比，P ＜ 0.05；b：與對照組比，P ＜ 0.01

組別對照組枸杞多糖組（μg/ml）12.5 25.0 50.0 100.0照射劑量（mJ/cm2）0 100 20 86.4±1.3 40 67.2±0.8 60 49.7±0.4 100 100 100 100 87.7±0.6a 90.8±1.2a 92.7±2.0b 92.1±1.3a 69.8±1.4a 76.3±2.1a 82.7±1.6b 78.5±0.5a 52.6±1.2a 60.8±1.7a 71.2±1.1b 66.4±0.7a

2.SOD活性：與對照組比較，枸杞多糖各給藥組SOD活性均有增高，其中枸杞多糖12.5、25.0、100.0 μg/ml組與對照組比較，P＞0.05，差異無統計學意義。枸杞多糖50.0 μg/ml組的SOD活性升高最明顯，P＜0.01，差異有統計學意義。見表2。

表2 UVB照射后對照組和枸杞多糖各組HaCaT細胞的超氧化物激化酶（SOD）活性（±s）

表2 UVB照射后對照組和枸杞多糖各組HaCaT細胞的超氧化物激化酶（SOD）活性（±s）

注：n=6。a：與對照組比，P ＜ 0.01

組別（mJ/cm2）對照組枸杞多糖組（μg/ml）12.5 25.0 50.0 100.0 SOD 活性（U/mg）0 60.2±0.1 20 50.8±0.6 40 42.2±1.5 60 37.4±1.5 59.5±0.2 59.3±0.1 60.1±0.2 59.6±0.1 53.1±1.2 53.4±1.5 57.7±1.2a 55.4±1.0 39.5±1.2 43.5±1.4 52.3±0.7a 47.2±0.8 45.3±1.4 48.0±1.4 54.7±1.2a 50.4±0.2

3.RT?PCR HIF?1α、VEGFmRNA的表達：50 μg/ml給藥組 UVB（0、20、40、60 mJ/cm2）照射培養 24 h，對 HIF?1α、VEGFmRNA表達的影響與對照組比較，50 μg/ml給藥組UVB照射各組HIF?1α、VEGFmRNA 表達明顯降低（P＜0.05），見圖1。

圖1 對照組和枸杞多糖組UVB照射細胞中低氧誘導因子（HIF）?1α、血管內皮細胞生長因子（VEGF）mRNA電泳圖 A：對照組；B：枸杞多糖組

4.Western印跡檢測HIF?1α、VEGF蛋白：50 μg/ml給藥組UVB照射培養24 h，經Western印跡檢測分析，對照組隨著照射劑量（20、40、60 mJ/cm2）的增加，HIF?1α、VEGF蛋白呈上升趨勢，但50 μg/ml給藥組中HIF?1α、VEGF的蛋白表達與對照組相比明顯降低。經灰度分析顯示：對照組的HIF?1α、VEGF蛋白表達水平顯著高于50 μg/ml給藥組（P＜ 0.05），見表3。

表3 對照組和枸杞多糖組UVB照射細胞中HIF?1α、VEGF蛋白表達（±s）

表3 對照組和枸杞多糖組UVB照射細胞中HIF?1α、VEGF蛋白表達（±s）

注：n=6。a：與對照組比，P＜0.05。HIF：低氧誘導因子；VEGF：血管內皮細胞生長因子

組別對照組枸杞多糖組50.0 μg/ml HIF?1α/β肌動蛋白（mJ/cm2）VEGF/β肌動蛋白0 0.203±0.012 0.196±0.020 20 0.302±0.015 0.262±0.011a 40 0.583±0.014 0.425±0.015a 60 0.818±0.015 0.604±0.011a 0 0.205±0.011 0.210±0.015 20 0.341±0.016 0.284±0.021a 40 0.515±0.012 0.432±0.010a 60 0.785±0.012 0.577±0.011a

三、討論

日光中的紫外線（UV）依波長不同可分為：短波紫外線（UVC），中波紫外線（UVB）和長波紫外線（UVA）。UVB照射皮膚誘導DNA損傷、斷裂和腫瘤抑癌基因p53點突變，這與皮膚腫瘤發生發展有著密切的關系［9］。UVB及UVB引起的缺氧能夠引起HIF?1α的積聚和活性增高、可調節多種細胞許多基因的表達，包括血管內皮細胞生長因子（VEGF），轉鐵蛋白受體（TFR）等［10］。HIF?1α及其下游的VEGF可由UVB誘導激活，通過調節下游基因的轉錄和表達，刺激腫瘤新生血管生成、抑制腫瘤細胞凋亡、促進腫瘤細胞轉移，從而使腫瘤細胞適應缺氧微環境并不斷增殖、侵襲和轉移［11］。人類腫瘤活組織免疫組化分析表明在大部分腫瘤中HIF?1α表達明顯增高，并且和腫瘤VEGF表達及血管化作用相關［12］。HIF?1α、VEGF活性的喪失或獲得可以負相或正相的與腫瘤生長和血管發生相關［13］。

枸杞多糖是從枸杞子中提取的主要有效成分，具有較強的生理活性，有較好的抗照射、抗癌及抗氧化等作用［14］。我們將枸杞多糖作用HaCaT細胞，通過不同劑量UVB照射，來觀察枸杞多糖對UVB照射HaCaT細胞生存率、SOD活性及細胞內HIF?1α、VEGF基因、蛋白表達的影響。研究顯示，UVB可以造成體外培養的HaCaT細胞增殖活力降低，而枸杞多糖可以增加HaCaT細胞的增殖活力；表明枸杞多糖有抗UVB引起的HaCaT細胞損傷的能力。健康的生命體存在強大的防護機制，可對抗自由基的損害，SOD是最有效的抗氧化劑和自由基清除劑，SOD的活力高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。研究顯示，UVB照射致HaCaT細胞內SOD活性降低，說明UVB可通過抑制SOD，降低其清除活性氧族的能力；而加入枸杞多糖干預后卻可明顯的增高SOD活性，說明枸杞多糖有很好的抗氧化、抗照射作用，尤以枸杞多糖（50.0 μg/ml）組最為明顯。枸杞多糖抑制腫瘤的生長的作用機制說法不一，有認為通過激活機體的免疫系統而抗腫瘤［15］，還有資料表明，枸杞多糖的抗腫瘤作用與調節鈣離子濃度有關［16］。本研究發現，HaCaT細胞在UVB照射下，枸杞多糖可明顯抑制HIF?1α和VEGF基因、蛋白的表達，這可能是枸杞多糖抗UVB照射、防止皮膚腫瘤發生的分子機制之一。

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Effect ofLycium barbarumpolysaccharide on expression of vascular endothelial growth factor and hypoxia inducible factor?1α in ultraviolet B?radiated HaCaT cells

Zhang Hongchang,Zuo Lichun,Sun Haicai,Lyu Guangfu,Li Na,Lin Zhe
Center of Traditional Chinese Medicine and Bioengineering,Changchun University of Chinese Medicine,Changchun 130117,China（Zhang HC,Lyu GF,Li N,Lin Z）;Changchun Sino?German Orthopaedic Hospital,Changchun 130051,China（Zuo LC,Sun HC）

Lin Zhe,Email:linzhe1228@163.com

ObjectiveTo evaluate effects ofLycium barbarumpolysaccharide （LBP） on expression of vascular endothelial growth factor（VEGF）and hypoxia inducible factor?1α（HIF?1α）in ultraviolet B（UVB）?radiated HaCaT cells.MethodsConventionally cultured HaCaT cells were divided into control group and LBP groups,which were firstly treated with DMEM,12.5,25.0,50.0 and 100 μg/ml LBP solution respectively for 4 hours,and then were irradiated by UVB at different intensity of 0,20,40,60 mJ/cm2separately.After 24?hour continuing culture,CCK?8 assay was performed to determine the cell survival rate,and an enzymatic?biochemical method to estimate the activity of superoxide dismutase（SOD）.RT?PCR and Western blot analysis were conducted to measure the mRNA and protein expression of HIF?1α and VEGF respectively.ResultsCompared with the control group at the same UVB radiation dose,the 12.5?,25.0?and 100.0?μg/ml LBP groups showed different extents of increase in survival rates of UVB?radiated cells（P＜ 0.05）,and the 50.0?μg/ml LBP group showed the highest cell survival rate（P＜ 0.01）.Among all the LBP groups,SOD activity was highest in the 50.0?μg/ml LBP group（P＜ 0.01）.Along with the increase of UVB radiation dose,the mRNA and protein expression of HIF?1α and VEGF all gradually increased.Compared with the control group,the 50.0?μg/ml LBP group could effectively reduce the mRNA and protein expression of HIF?1α and VEGF in HaCaT cells（allP＜ 0.05）.ConclusionLBP may play a role in protecting cells from UVB radiation?mediated damage,likely by influencing the mRNA and protein expression of HIF?1α and VEGF in HaCaT cells.

Ultraviolet rays;Lycium barbarum;Polysaccharides;Endothelial growth factors;Hypoxia inducible factor 1α;HaCaT cells

林喆，Email：linzhe1228@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.09.012

吉林省科技廳科技發展計劃項目（20140414051GH）

Fund program:Science and Technology Development Project of Jilin Provincial Department of Science and Technology（20140414051GH）

2016?12?26）

（本文編輯：吳曉初）