重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白聯(lián)合甲氨蝶呤治療銀屑病及其對白細胞介素17A和腫瘤壞死因子α的影響

仝云蕾 陳銘 龔瑜 張玲玲 于倩 王瑤 史玉玲

200072上海，同濟大學附屬第十人民醫(yī)院皮膚科（仝云蕾、龔瑜、張玲玲、于倩、王瑤、史玉玲），健康體檢科（陳銘）

重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白聯(lián)合甲氨蝶呤治療銀屑病及其對白細胞介素17A和腫瘤壞死因子α的影響

仝云蕾 陳銘 龔瑜 張玲玲 于倩 王瑤 史玉玲

200072上海，同濟大學附屬第十人民醫(yī)院皮膚科（仝云蕾、龔瑜、張玲玲、于倩、王瑤、史玉玲），健康體檢科（陳銘）

目的探討重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白（rhTNFR：Fc，商品名益賽普）聯(lián)合甲氨蝶呤對中重度斑塊型銀屑病患者血清和單個核細胞中白細胞介素（IL）17A和腫瘤壞死因子（TNF?α）的影響。方法2014年8月至2016年2月同濟大學附屬第十人民醫(yī)院皮膚科門診收治的30例中重度斑塊型銀屑病患者，分為益賽普組（15例）和益賽普+甲氨蝶呤組（15例），療程24周。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）和實時定量PCR法檢測兩組患者治療前后血清和外周血單個核細胞的IL?17A和TNF?α的濃度和mRNA表達水平。結果治療前益賽普+甲氨蝶呤組和益賽普組患者，血清IL?17A，TNF?α水平以及外周血PBMC中IL?17A，TNF?α mRNA的表達均顯著高于健康對照組（P＜0.05）；治療后，益賽普 + 甲氨蝶呤組血清IL?17A、TNF?α濃度（142.67± 14.82，70.07± 25.02）及外周血PBMC中IL?17A、TNF?α mRNA表達（1.12± 0.33，2.50± 1.04）與益賽普組血清IL?17A、TNF?α濃度（163.54±23.18，91.98±14.62）及外周血PBMC中IL?17A、TNF?α mRNA的表達（1.56±0.77，3.61±2.14）比較顯著下降（P＜0.05）。結論益賽普聯(lián)合甲氨喋呤治療銀屑病療效優(yōu)于單用益賽普治療，聯(lián)合治療可以縮短治療時間，提高療效，其作用機制可能與下調IL?17A、TNF?α的表達量有關。

銀屑病；受體，腫瘤壞死因子，Ⅱ型；重組融合蛋白質類；甲氨蝶呤；白細胞介素17；腫瘤壞死因子α

銀屑病是一種環(huán)境、遺傳、免疫等多因素誘導的炎癥性皮膚病，發(fā)病機制尚不明確。已有研究報道，其發(fā)病與多種炎癥因子參與有關，白細胞介素（IL）17和腫瘤壞死因子α（TNF?α）是銀屑病發(fā)病機制中的重要促炎性細胞因子［1］。銀屑病的治療多種多樣，生物制劑作為免疫靶向治療藥物顯示出良好的療效。重組人Ⅱ型腫瘤壞死因子受體-抗體融合蛋白（rhTNFR：Fc，商品名益賽普）作為一種腫瘤壞死因子拮抗劑，近年來已應用于臨床，且療效確切［2］，由于其價格昂貴及長期應用的經(jīng)濟負擔，使其在應用上受到限制，于是生物制劑與傳統(tǒng)藥物聯(lián)合治療銀屑病應運而生［3］，其中益賽普與甲氨蝶呤（MTX）的聯(lián)合已應用于類風濕性關節(jié)炎、強直性脊柱炎及銀屑病，能有效地抑制炎癥，改善病情［4］。我們觀察益賽普聯(lián)合MTX治療中重度斑塊型銀屑病的療效，檢測治療前后血清IL?17A，TNF?α的水平及外周血單個核細胞（PBMC）IL?17A mRNA、TNF?α mRNA的表達。

對象與方法

一、對象

2014年8月至2016年2月，同濟大學附屬第十人民醫(yī)院皮膚科門診就診30例中重度斑塊型銀屑病患者，均經(jīng)臨床或組織病理確診。采集30例患者的臨床資料和外周血標本，男20例，女10例，年齡25～73（51.93±14.72）歲，病程（19.40±10.27）年，銀屑病皮損面積和嚴重度指數(shù)（PASI）為（26.64±8.95）分。益賽普+MTX組15例，單用益賽普組15例。兩組性別、年齡、病期及癥狀體征等比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），具有可比性。健康對照組15例，均為健康獻血員，男9例，女6例，年齡18～60（37.47±12.72）歲。本研究通過本院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者和健康對照者均簽署知情同意書。

1.入選標準：年齡≥18歲；病程≥6個月；PASI評分＞10且皮損面積＞體表面積10%的中重度斑塊型銀屑病；接受過至少1種系統(tǒng)治療但療效不佳，研究者認為患者適合接受本方法治療。30例患者入組前2個月內未接受過系統(tǒng)治療，2周內未外用治療銀屑病藥物。

2.排除標準：其他類型銀屑病（紅皮病性、膿皰性、關節(jié)病性），或其他可能干擾病情評估的皮膚病；以前接受過生物制劑治療者；有藥物引起的銀屑病；篩選階段前6個月內患有機會性感染；孕婦、哺乳期婦女；患有活動性結核病史或近期與活動性結核病患者密切接觸史；患有嚴重的未控制的心血管、肝臟、肺和腎疾病、其他自身免疫性疾病、惡性腫瘤、HIV感染；研究者認為合并有不適合參加本研究的其他疾病。

二、方法

1.治療方案：益賽普+MTX組：皮下注射益賽普每周1次50 mg，連續(xù)24周；第1、2周口服MTX 7.5 mg/周，第 3、4 周口服 10 mg/周，第 5、6周口服2.5 mg/周，第7～24周口服15 mg/周。益賽普組：皮下注射益賽普每周1次50 mg，連續(xù)24周。益賽普由中信國健藥業(yè)有限公司生產（國藥準字S20050058）。MTX由上海信誼藥廠生產。

2.酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定血清IL?17A、TNF?α的含量：采集患者及健康人靜脈血4 ml，分離血清，用ELISA法檢測血清IL?17A、TNF?α水平（試劑盒由美國Multisciences公司提供），實驗步驟按照試劑盒說明書進行。采用多功能酶標儀測定450 nm處吸光度值，根據(jù)標準曲線讀取樣品濃度。

3.實時定量PCR（RT?PCR）檢測外周血單個核細胞（PBMC）中IL?17A、TNF?α mRNA表達：采集患者及健康人EDTA抗凝外周靜脈血4 ml，用Ficoll?Hypaque密度梯度離心法獲得PBMC，凍存于-80℃。用RT?PCR方法檢測外周血中IL?17A、TNF?α的mRNA水平。

（1）總RNA的提取：將分離的PBMC加入1 ml Trizol，按RNA抽提試劑盒說明提取總RNA。紫外分光光度法測定RNA濃度（ng/ul），計算A260/A280比值，鑒定RNA純度。

（2）根據(jù)日本TaKaRa公司反轉錄試劑盒提供的方法將總RNA反轉錄為cDNA，按10 μl的反應體系配制RT反應液，總RNA為500 ng，反轉錄cDNA置于-20℃冰箱保存。

（3）實時PCR反應：引物設計和引物合成均由上海捷瑞生物工程有限公司提供。IL?17：正向引物：5′?TTGATGCTCTCGCTCTTC?3′，反向引物：5′?CTTCCTCCTCTTCCTCCA?3′；TNF?α：正向引物：5′?TCCTTCAGACACCCTCAACC?3′，反向引物：5′?AGG CCCCAGTTTGAATCCTT?3′；內參照β肌動蛋白：正向引物：5′?AGAGCTACGAGCTGCCTGAC?3′，反向引物：5′?AGCACTGTGTTGGCGTACAG?3′。PCR反應體系為SYBR Premix EX TaqⅡ（2 ×）10 μl，ROX Reference DyeⅡ（50 ×）0.4 μl，F(xiàn)?primer（10 μmol/L）0.8 μl，R ?primer（10 μmol/L）0.8 μl，cDNA 2 μl，ddH20 6 μl。反應條件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃30 s、40個循環(huán)；得到每個標本不同指標的Ct值，根據(jù)公式2?ΔΔCt計算出IL?17A、TNF?α的mRNA相對表達量。

4.藥物不良反應監(jiān)測：兩組患者在治療前均進行結核菌素試驗，乙肝5項以及胸部CT檢查，排除結核和乙肝病毒的感染。治療前、治療第2周、第4周，以后每4周1次血尿常規(guī)，C反應蛋白和肝腎功能檢測。

5.療效評估標準：記錄兩組治療前后的PASI評分，并計算第24周時的PASI75應答率。

6.統(tǒng)計學處理：采用SPSS 20統(tǒng)計學軟件，計量資料以±s表示，兩組間采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

一、血清IL?17A、TNF?α的水平及外周血PBMC中IL?17A，TNF?α mRNA表達

益賽普組和益賽普+MTX組患者治療前血清IL?17A，TNF?α水平均顯著高于健康對照組（P＜0.05）；治療后血清IL?17A、TNF?α水平較治療前明顯下降（P＜0.05），但仍高于健康對照組；兩組患者治療前外周血PBMC中IL?17A，TNF?α mRNA表達均顯著高于健康對照組（P＜0.05）；治療后PBMC中IL?17A，TNF?α mRNA表達較治療前明顯下降（P＜0.05），但仍高于健康對照組。同時對益賽普組和益賽普+MTX組治療前后血清中IL?17A，TNF?α水平以及外周血PBMC中IL?17A，TNF?α mRNA表達水平進行了比較，發(fā)現(xiàn)治療前益賽普組血清中IL?17A，TNF?α水平以及外周血PBMC中IL?17A mRNA，TNF?α mRNA表達與益賽普+MTX組比較差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），而益賽普+MTX組治療后血清IL?17A、TNF?α水平及PBMC中IL?17A、TNF?α mRNA的表達與益賽普組治療后比較均降低（均P＜ 0.05），而兩組治療后血清中IL?17A、TNF?α水平及PBMC中IL?17A、TNF?α mRNA的表達仍高于正常健康組。見表1。

表1 健康對照組和銀屑病組治療前后血清IL?17A、TNF?α以及外周血單個核細胞中IL?17A、TNF?α mRNA的表達（±s）

表1 健康對照組和銀屑病組治療前后血清IL?17A、TNF?α以及外周血單個核細胞中IL?17A、TNF?α mRNA的表達（±s）

注：a：與健康對照組比較，P＜0.05；b：與治療前比較，P＜0.05；c：與益賽普組治療后比較，P＜0.05。IL：白細胞介素；TNF：腫瘤壞死因子

組別健康對照組益賽普組治療前治療后益賽普+MTX組治療前治療后例數(shù)15 15 IL?17A（pg/ml）119.98±32.03 TNF?α（pg/ml）64.80±47.88 IL?17A mRNA 0.99±0.03 TNF?α mRNA 1.01±0.06 196.22±31.85a 163.54±23.18ab 128.81±55.70a 91.98±14.62ab 5.63±3.61a 1.56±0.77ab 10.57±4.02a 3.61±2.14ab 15 201.54±28.47a 142.67±14.82abc 104.44±49.43a 70.07±25.02abc 5.93±2.44a 1.12±0.33abc 8.69±4.03a 2.50±1.04abc

二、治療前后患者PASI評分比較

益賽普+MTX組治療前PASI為22.97±7.09，治療后為5.31±2.35，治療前后PASI評分比較差異有統(tǒng)計學意義（t=13.84，P＜0.001），第24周PASI75應答率為80%；益賽普組治療前PASI評分為30.31±9.32，治療后為7.10±2.94，治療前后PASI評分比較差異有統(tǒng)計學意義（t=12.506，P＜0.001），第24周的PASI75應答率為67%。益賽普+MTX組與益賽普組相比，PASI評分下降明顯，且益賽普+MTX治療組第24周的PASI75應答率較益賽普組有顯著提高。因此，益賽普+MTX組與益賽普組相比，療效更顯著。

三、不良反應

益賽普+MTX組5例肝功能異常（肝酶輕度升高，隨訪肝功能未繼續(xù)升高，均完成治療療程），出現(xiàn)尿蛋白、尿糖異常、失眠各1例，1例出現(xiàn)發(fā)熱，白細胞升高，對癥處理后好轉。益賽普組出現(xiàn)眩暈、嗜睡、瘙癢、尿糖異常各1例，1例出現(xiàn)發(fā)熱，白細胞升高，在發(fā)熱期間對癥處理后好轉。總體來看，益賽普+MTX組的不良反應略高于益賽普組，但是患者均能耐受，不影響治療。

討 論

銀屑病的發(fā)病機制尚不清楚，越來越多的證據(jù)表明，免疫介導的炎癥性細胞因子是銀屑病炎癥過程中的關鍵因素。IL?17是Th17細胞分泌的代表性細胞因子，家族成員包括IL?17A～F6個，其中IL?17A有強大的致炎性，可促進機體產生各種趨化因子，促進炎癥細胞趨化，從而誘導表皮的角質形成細胞產生多種細胞因子及抗菌肽，加重局部的炎癥［5］，因此IL?17在銀屑病的發(fā)病中起著重要作用。同時IL?17可以誘導多種炎癥介質的釋放，也被認為是一種前炎癥因子［6］。已有相關報道，在銀屑病患者的血清中IL?17A的表達明顯高于正常人，與疾病的嚴重程度（PAS1評分）有相關性，提示Thl7細胞介導銀屑病的發(fā)生發(fā)展［7］。TNF?α是T細胞分泌的多種細胞因子之一，在尋常型銀屑病的發(fā)病過程中起著重要的促炎作用。TNF?α作為重要的早期炎癥細胞因子，能夠誘導刺激炎癥細胞產生并釋放炎性細胞因子，進而促使炎癥細胞及炎性因子的黏附及聚集在炎癥部位，從而參與炎癥的發(fā)生發(fā)展，但是TNF?α只有和其受體結合后才能發(fā)揮其生物活性，如果阻斷了TNF?α與受體的結合就會降低其生物活性［8］。已有報道，在銀屑病患者的血清中TNF?α水平及外周血PBMC中TNF?α mRNA的表達均明顯增高。

益賽普主要作用機制是通過和血中的腫瘤壞死因子（TNF）競爭性結合，阻斷TNF和細胞表面的TNF受體結合，從而降低其活性達到減輕炎癥反應的目的，改善銀屑病患者的癥狀和體征［9］。從益賽普的結構看，主要靶點是TNF?α，但是參與銀屑病發(fā)病的炎癥因子是個復雜的網(wǎng)絡，益賽普在治療銀屑病的過程中是否對其他炎癥因子有影響尚不明確［10］，有待進一步研究。MTX是一種治療銀屑病的藥物，具有免疫抑制和抗炎作用，主要是通過抑制二氫葉酸還原酶及甲酰基轉移酶的生物活性，從而抑制各種促炎性細胞因子及趨化因子的釋放，發(fā)揮抗炎作用［11］。雖然MTX療效確切，但長期應用的毒副作用限制了應用。越來越多文獻報道MTX與生物制劑聯(lián)合應用，一方面提高了生物制劑單用的療效，起效更快，另一方面提高了安全性［12］。本研究發(fā)現(xiàn)，MTX與益賽普聯(lián)合應用與單用益賽普相比療效更佳，PASI75的應答率明顯提高，臨床療效更加顯著。

本研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者血清中IL?17A及TNF?α水平及外周血PBMC中IL?17A、TNF?α mRNA的表達明顯升高，同時治療后血清中IL?17A及TNF?α水平及外周血PBMC中IL?17A、TNF?α mRNA的表達顯著降低。在TNF?α抑制劑治療中，抗藥物抗體（anti?drug antibodies，ADA）的產生是在治療中不希望出現(xiàn)的，然而幾乎所有的TNF?α抑制劑都可能會產生ADA［13］，免疫抑制劑的使用可以降低所有來源（嵌合、人源化）的抗TNF?α抑制劑ADA的發(fā)生率，因此，MTX可以作為抗TNF?α藥物ADA產生的基礎免疫抑制劑，生物制劑和免疫抑制劑聯(lián)用后療效增強可能與患者體內單克隆抗體暴露量增多有關［14］。抗TNF?α抗體清除率下降的可能機制是在免疫抑制劑存在的情況下，單克隆抗體的免疫原性下降了，從而ADA的產生下降。其他的可能機制還有單克隆抗體和藥物之間的相互作用，例如MTX下調Fc受體在單克隆細胞中的表達，可能會導致抗TNF?α抗體的分布改變。益賽普通過競爭性的結合TNF?α，從而抑制其生物活性，通過復雜的炎性因子網(wǎng)絡的相互作用從而減少IL?17A，IL?22，IL?23，TNF?α等細胞因子的產生，減輕炎癥的發(fā)生；同時甲氨蝶呤也可以通過抑制二氫葉酸還原酶及甲酰基轉移酶的生物活性，進一步抑制IL?17A、TNF?α等細胞因子的釋放，發(fā)揮抗炎作用，因此兩者聯(lián)合應用后IL?17A、TNF?α較單獨應用有明顯的下降，從而聯(lián)合治療更好地發(fā)揮了抗炎作用。

聲明 本文無藥廠資助，無利益沖突

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Recombinant human tumor necrosis factor receptor typeⅡ:IgG Fc fusion protein combined with methotrexate for the treatment of psoriasis and their effects on levels of interleukin?17A and tumor necrosis factor?α

Tong Yunlei,Chen Ming,Gong Yu,Zhang Lingling,Yu Qian,Wang Yao,Shi Yuling
Department of Dermatology,Tenth People′s Hospital of Tongji University,Shanghai 200072,China（Tong YL,Gong Y,Zhang LL,Yu Q,Wang Y,Shi YL）;Department of Physical Examination,Tenth People′s Hospital of Tongji University,Shanghai 200072,China（Chen M）

Shi Yuling,Email:shiyuling1973@tongji.edu.cn

ObjectiveTo evaluate the effect of recombinant human tumor necrosis factor receptor type Ⅱ:IgG Fc fusion protein（rhTNFR:Fc,trade name Etanercept）combined with methotrexate on levels of interleukin?17A（IL?17A）and tumor necrosis factor?α（TNF?α）in the serum and mononuclear cells of patients with moderate to severe plaque psoriasis.MethodsA total of 30 patients with moderate to severe plaque psoriasis were enrolled from Department of Dermatology of Tenth People′s Hospital of Tongji University between August 2014 and February 2016,and then were randomly and equally divided into Etanercept group and Etanercept+methotrexate group.The treatment lasted 24 weeks.Fifteen healthy blood donors served as healthy control group.Enzyme?linked immunosorbent assay（ELISA）and real?time quantitative PCR were performed to measure the serum levels and mRNA expression of IL?17A and TNF?α,respectively,in the patients of the above two groups before and after the treatment.ResultsBefore the treatment,the serum levels of IL?17A and TNF?α,as well as the mRNA expression of IL?17A and TNF?α in peripheral blood mononuclear cells（PBMCs）,were all significantly higher in all the patients than in the healthy controls（allP＜ 0.05）.After the treatment,compared with the Etanercept group,the Etanercept+methotrexate group showed significantly lower serum levels of IL?17A（142.67±14.82vs.163.54±23.18,P＜0.05）andTNF?α（70.07±25.02vs.91.98±14.62,P＜ 0.05）,aswellaslowermRNAexpressionofIL?17A（1.12±0.33vs.1.56±0.77,P＜0.05）and TNF?α in PBMCs（2.50±1.04vs.3.61±2.14,P＜0.05）.ConclusionEtanercept combined with methotrexate is superior to Etanercept alone in the treatment of psoriasis,and can reduce treatment duration and improve therapeutic effect,likely by down?regulating the expression of IL?17A and TNF?α.

Psoriasis;Receptors,tumor necrosis factor,type II;Recombinant fusion proteins;Methotrexate;Interleukin?17;Tumor necrosis factor?alpha

史玉玲，Email：shiyuling1973@tongji.edu.cn

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.09.004

國家自然科學基金（81673050、81301356）；上海市自然科學基金（16ZR1426800）

Fund programs:National Natural Science Foundation of China（81673050,81301356）;Shanghai Municipal Natural Science Foundation（16ZR1426800）

2016?12?21）

（本文編輯：吳曉初）