基于新型量子點(diǎn)熒光微球的氯霉素免疫層析試紙條的制備和應(yīng)用

丁喬棋 李 麗 范文韜 呂亞楠 胡建華 閆麗萍 宋素泉

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京210095)

基于新型量子點(diǎn)熒光微球的氯霉素免疫層析試紙條的制備和應(yīng)用

丁喬棋 李 麗 范文韜 呂亞楠 胡建華 閆麗萍*宋素泉*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京210095)

以羧基化CdTe/ZnSe量子點(diǎn)熒光微球?yàn)闃?biāo)記物，通過(guò)1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺/N-羥基琥珀酰亞胺(EDC/NHS)活化法將氯霉素(CAP)單克隆抗體與量子點(diǎn)熒光微球偶聯(lián)制備熒光探針。氯霉素全抗原(CAP-HS-BSA)及羊抗鼠二抗分別噴涂硝酸纖維素膜，形成檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))和質(zhì)控線(xiàn)(C線(xiàn))，組裝成新型氯霉素量子點(diǎn)熒光微球免疫層析試紙條，建立了快速、定量檢測(cè)牛奶中CAP的方法。本研究開(kāi)發(fā)的量子點(diǎn)熒光微球試紙條可在15 min內(nèi)完成牛奶樣品中CAP的定量檢測(cè)，線(xiàn)性范圍為0.1～100.0 μg/L，檢出限為0.1 μg/L。牛奶樣品CAP的加標(biāo)回收率為93.3%～97.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.9%～6.9%之間。

氯霉素； 量子點(diǎn)微球； 免疫層析試紙條

2017-05-09投稿：2017-09-04接受

本文系國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(Nos. 2016YFD0501200, 2016YFD0501009)、中央高校基本業(yè)務(wù)費(fèi)(No.Y0201500195)、江蘇省自然基金面上項(xiàng)目 (No.BK20161452)、廣東省科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No. 2017B020202010)和江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目資助

* E-mail: yanliping@njau.edu.cn; suquan.song@njau.edu.cn

1 引 言

氯霉素(Chloramphenicol, CAP)是一種價(jià)格低廉、高效廣譜的抗生素，曾經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜牧業(yè)生產(chǎn)中。然而，由于其分子結(jié)構(gòu)中帶有毒性硝基基團(tuán)且半衰期較長(zhǎng)，極易殘留在畜禽體內(nèi)產(chǎn)生毒副作用，殘留的CAP還可以通過(guò)食物鏈危害消費(fèi)者健康[1,2]。目前,許多國(guó)家都禁止在畜牧生產(chǎn)中使用CAP，如歐盟規(guī)定氯霉素在肉、海鮮、雞蛋、牛奶、蜂蜜等食用動(dòng)物內(nèi)的最小執(zhí)行限量(MRPL)為0.3 μg/kg[3]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告中明確規(guī)定禁止使用CAP[4]。然而，CAP的濫用問(wèn)題仍非常嚴(yán)重，CAP殘留超標(biāo)時(shí)有發(fā)生，因此加強(qiáng)動(dòng)物性食品中CAP的監(jiān)測(cè)非常重要。

目前,檢測(cè)CAP的常用方法包括微生物測(cè)試法、ELISA法及液相色譜分析法等[5]。微生物法操作簡(jiǎn)便但靈敏度不高[6]；ELISA靈敏度較好，但常存在假陽(yáng)性，且耗時(shí)較長(zhǎng)[7]；色譜分析法具有良好的靈敏度、準(zhǔn)確性與重復(fù)性，但樣品前處理過(guò)程繁瑣、費(fèi)用高且對(duì)需要專(zhuān)門(mén)的操作人員[8]。而免疫層析技術(shù)成本低、檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求低且適合現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用，已廣泛用于食品安全的現(xiàn)場(chǎng)篩查[9]。目前常用的免疫層析技術(shù)的標(biāo)記物為膠體金[10]，通常通過(guò)肉眼觀察進(jìn)行定性分析，檢測(cè)結(jié)果受主觀影響大，不適于進(jìn)行定量分析。相比之下，采用熒光標(biāo)記的免疫試紙條顯示出更高的靈敏度，適于樣品的定量分析。如Song等[11]采用鑭系元素Eu(III)-BHHCT修飾的熒光納米材料二氧化硅為探針，建立了豬尿中鹽酸克倫特羅的免疫層析檢測(cè)方法，檢出限為3.7 μg/L，靈敏度高于膠體金免疫層析試紙條。

量子點(diǎn)(Quantum dots， QDs)是目前常用的一種熒光標(biāo)記物，是由II～VI族或III～V族元素組成的新型熒光納米材料。與傳統(tǒng)有機(jī)染料相比，QDs具有一元激發(fā)多元發(fā)射、激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、光穩(wěn)定性好和抗漂白能力強(qiáng)等特點(diǎn)，因此采用量子點(diǎn)標(biāo)記的免疫層析試紙條具有相對(duì)較高檢測(cè)的靈敏度[12～14]，而將大量QDs包裹于聚合物材料制備得到的量子點(diǎn)微球(Quantum dot submicrobeads, QBs) 則可表現(xiàn)出更高的熒光強(qiáng)度和更好的光學(xué)穩(wěn)定性[15,16]。目前，以QBs為探針的氯霉素免疫層析試紙條尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用CdTe/ZnSe QBs標(biāo)記的抗CAP單克隆抗體為指示物，開(kāi)發(fā)出一種特異性檢測(cè)CAP的QBs熒光免疫層析試紙條，并應(yīng)用于實(shí)際牛奶樣品中CAP的檢測(cè)，顯示出良好的實(shí)用性。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

HSC-24A氮吹儀(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司); Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad公司); 硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維素膜、濾紙(美國(guó)Millipore公司); 表面羧基化修飾的CdTe/ZnSe量子點(diǎn)微球(QBs，上海艾信生物科技公司)，平均粒徑為174 nm，激發(fā)波長(zhǎng)為365 nm時(shí)的最大發(fā)射波長(zhǎng)為610 nm; 氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品(北京百靈威科技公司); 胎牛血清蛋白(BSA)、羊抗鼠二抗、2-(N-嗎啡啉)乙基磺酸(MES)、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)(北京索萊寶生物科技有限公司); 琥珀酸酐(HS, 上海源葉生物公司); 吡啶(南京化學(xué)試劑股份有限公司); 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(碳二亞胺，EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽(Sulfo-NHS)(上海麥克林生化科技有限公司); CAP單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室免疫合成，效價(jià)為1×105。氯霉素ELISA檢測(cè)試劑盒(上海生工生物工程公司)。

2.2氯霉素全抗原的制備

采用EDC法制備氯霉素全抗原[17]，具體過(guò)程如下：稱(chēng)取HS 930 mg置于平底燒瓶，加入8 mL丙酮，1.5 mL吡啶，60℃水浴加熱攪拌至澄清，記為A液; 稱(chēng)取2 g CAP，溶于5 mL丙酮中，記為B液; 將B液逐滴加到A液中，60℃回流2 h后加丙酮并吹干。體系中加入30 mL乙酸乙酯和10 mL 0.1 mol/L HCl，振蕩除去除酸層，用蒸餾水洗兩次。隨后向乙酸乙酯層中加入10% (w/w)NaHCO3，攪拌使其溶解，用濃HCl調(diào)至pH 3，得到黃色粘稠的半抗原氯霉素琥珀酸酯(CAP-HS)。CAP-HS經(jīng)高效液相色譜法(HPLC)鑒定后，凍干保存。稱(chēng)取150 mg CAP-HS，溶于2.5 mLN,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，依次加入適量MES緩沖溶液、EDC溶液和Sulfo-NHS溶液后，室溫下攪拌反應(yīng)3 h，隨后加入20 mg/mL BSA，室溫避光攪拌反應(yīng)3 h，然后4℃下攪拌過(guò)夜。最后用0.05 mol/L硼酸緩沖液透析純化，得到偶聯(lián)物CAP-HS-BSA。HPLC分析條件為：流動(dòng)相為甲醇-乙腈-乙酸銨溶液(pH 6.8， 0.05 mol/L)(0.2∶19.8∶80，V/V)，流速為0.5 mL/min，分析溫度30℃，SPD-20A紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)276 nm。

2.3量子點(diǎn)微球標(biāo)記氯霉素單克隆抗體

采用EDC-NHS法[18]偶聯(lián)QBs和CAP抗體：將10 mg QBs 加入到4 mL MES(0.1 mol/L，pH 5.5)緩沖液中入，混勻，20000 r/min離心15 min，棄上清液，加入1 mL MES緩沖液重懸。體系中分別加入10 mg/mL的EDC和sulfo-NHS溶液，37℃振蕩反應(yīng)1 h后，20000 r/min離心15 min，沉淀加入1 mL HEPES緩沖液(0.05 mol/L，pH 7.4)重懸。將CAP抗體加入到上述溶液中，37℃反應(yīng)2 h，然后加入含有10% BSA的PBS溶液封閉2 h，得到量子點(diǎn)熒光微球標(biāo)記的CAP單抗(簡(jiǎn)稱(chēng)QBs探針)， 4℃儲(chǔ)存，備用。

2.4QBs免疫標(biāo)記快速檢測(cè)試紙條的組裝及結(jié)果判讀

QBs熒光試紙條由樣品墊、結(jié)合墊、NC膜、吸水紙及PVC底板5部分組成，如圖1A所示。將適當(dāng)濃度的氯霉素全抗原及羊抗鼠二抗噴涂在NC膜上，分別作為檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))和質(zhì)控線(xiàn)(C線(xiàn))，結(jié)合墊上包被QBs探針。將NC膜、結(jié)合墊、樣品墊及吸水紙依次粘貼在PVC底板上，相互重疊0.2 mm。組裝好后切成 4 mm條狀試紙條，置于錫箔袋中, 加入干燥劑密封保存，備用。使用時(shí)，將待測(cè)樣品滴加到樣品墊上，樣品在虹吸作用下緩慢向吸水紙方向遷移。當(dāng)樣品中沒(méi)有CAP時(shí)，QBs探針就會(huì)與包被在T線(xiàn)上的CAP全抗原結(jié)合而出現(xiàn)熒光條帶，剩余的QBs探針繼續(xù)向前移動(dòng)，被C線(xiàn)上的二抗捕獲，C線(xiàn)也發(fā)出熒光; 當(dāng)樣品液中含有CAP時(shí)，結(jié)合墊上QBs熒光探針會(huì)和CAP結(jié)合，因此在T線(xiàn)處與CAP全抗原結(jié)合的QBs探針的量就會(huì)減少，T線(xiàn)處熒光強(qiáng)度變?nèi)趸蛳В碩線(xiàn)的熒光強(qiáng)度和CAP的量成反比。無(wú)論樣品中是否含有CAP，C線(xiàn)都應(yīng)出現(xiàn)熒光條帶，否則試紙條結(jié)果判定為無(wú)效。反應(yīng)后的試紙條可通過(guò)Gel Doc XR成像系統(tǒng)讀取C線(xiàn)和T線(xiàn)上的熒光強(qiáng)度值(C值和T值)，用于定量檢測(cè)。試紙條結(jié)果示意圖如圖1B所示。

圖1 QBs熒光試紙條檢測(cè)氯霉素的原理圖。(A)試紙條組裝結(jié)構(gòu)圖; (B)試紙條結(jié)果示意圖Fig.1 Schematic illustration of quantum dot submicrobeads (QBs)-based immunochromatographic test strip (ICST) for chloramphenicol (CAP) detection: (A) structure of QBs-based ICTS; (B) schematic diagram of CAP detection by QBs-based ICTS

2.5QBs熒光試紙條性能評(píng)價(jià)

在優(yōu)化條件下，采用本試紙條對(duì)含有不同濃度CAP的牛奶樣品進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)讀取試紙條的T值和C值，每個(gè)濃度重復(fù)3次，并以CAP的濃度為橫坐標(biāo)，以B/B0(不同CAP濃度測(cè)得的T/C值與CAP=0時(shí)測(cè)得的T/C值的比值)為縱坐標(biāo)，繪制擬合曲線(xiàn)。

考察結(jié)構(gòu)類(lèi)似物氟苯尼考、甲砜霉素、青霉素和萊克多巴胺(1000 μg/L)在試紙條上的顯色情況，以PBS作為空白對(duì)照，分析試劑條的特異性。制備的熒光試紙條封閉在含有干燥劑的鋁箔袋中，37℃下保存，2周后隨機(jī)取出數(shù)根試紙條，測(cè)定梯度濃度的CAP標(biāo)準(zhǔn)溶液，分析試紙條的穩(wěn)定性。

2.6實(shí)際牛奶樣品分析

通過(guò)在陰性牛奶中的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)QBs熒光試紙條的準(zhǔn)確性以及精密度，加標(biāo)濃度為0.1和10 μg/L。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)開(kāi)發(fā)的QBs熒光試紙條的實(shí)用性，研究分析了30份加標(biāo)牛奶樣品(10份牛奶加標(biāo)濃度為0.1 μg/L，10份牛奶加標(biāo)濃度為10 μg/L，其余10份為陰性對(duì)照)，并將實(shí)驗(yàn)結(jié)果與商品化ELISA試劑盒的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。

3 結(jié)果與分析

3.1半抗原CAP-HS和全抗原CAP-HS-BSA的鑒定

采用HPLC分析半抗原CAP-HS的合成效果。結(jié)果表明，CAP色譜峰保留時(shí)間為8.0 min(圖2A)，CAP-HS的保留時(shí)間為9.5 min(圖2B)。BSA(500 μg/mL)、CAP-HS-BSA(500 μg/mL)及CAP-HS(50 μg/mL)在220～340 nm范圍內(nèi)的紫外光譜圖如圖2C所示，CAP-HS-BSA和BSA在280 nm左右均有一個(gè)吸收峰，但是相同蛋白濃度的CAP-HS-BSA在280 nm的吸光值是BSA吸光值的數(shù)倍，這是由于BSA與CAP-HS偶聯(lián)后吸光值疊加的緣故，因此可以初步判定CAP-HS與BSA偶聯(lián)成功。SDS-PAGE凝膠電泳分析(圖2D)也顯示，CAP-HS-BSA的電泳條帶滯后于蛋白標(biāo)準(zhǔn)品BSA，說(shuō)明全抗原CAP-HS-BSA合成成功。

圖2 氯霉素半抗原CAP-HS及全抗原CAP-HS-BSA鑒定。(A) CAP標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖; (B) CAP-HS高效液相色譜圖; (C) CAP-HS-BSA，CAP-HS 以及 BSA的紫外光譜圖; (D) CAP-HS-BSA與BSA的SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Identification of CAP-HS and CAP-HS-BSA. (A) HPLC analysis of CAP; (B) HPLC analysis of CAP-HS; (C) UV spectra of CAP-HS-BSA, CAP-HS and BSA; (D) SDS-PAGE electrophoretogram of CAP-HS-BSA and BSA. HS, succinic anhydride; BSA, bovine serum albumin; SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

3.2QBs熒光探針制備條件的優(yōu)化

本研究通過(guò)將適量的QBs熒光探針溶液滴加在試紙條的結(jié)合墊上(試紙條的NC膜只包被有C線(xiàn))，根據(jù)C線(xiàn)的熒光情況選出制備QBs熒光探針的最佳條件。當(dāng)pH 7.5時(shí)，C線(xiàn)上QBs探針-二抗偶聯(lián)物的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，隨著pH值升高，C線(xiàn)熒光強(qiáng)度下降(見(jiàn)圖3A)，原因可能是pH值過(guò)高導(dǎo)致蛋白變性，從而導(dǎo)致QBs與單抗偶聯(lián)效率降低[19]。在其它條件相同的情況下，當(dāng)加入EDC和Sulfo-NHS偶聯(lián)劑的量不足時(shí)， QBs與CAP抗體偶聯(lián)不完全，當(dāng)偶聯(lián)劑的加入量為150 μL時(shí)，QBs探針-二抗偶聯(lián)物的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)(圖3B)。考察了QBs與抗體的質(zhì)量比對(duì)試紙條的熒光效果的影響(圖3C)。結(jié)果表明，當(dāng)QBs與抗體(1 mg/mL)的質(zhì)量比為7.5∶1.0時(shí)，獲得的QBs探針與二抗作用熒光效果最好。由圖3D可見(jiàn)，QBs與抗體偶聯(lián)前后QBs的峰型保持對(duì)稱(chēng)，半峰寬不變，且均無(wú)拖尾現(xiàn)象，表明二者粒徑分布均勻，分散性好，熒光性能良好。另外，QBs和CAP單抗結(jié)合后表現(xiàn)出更高的熒光強(qiáng)度，其熒光值由原來(lái)的264.128 a.u升高至284.546 a.u。

圖3 QBs熒光探針制備條件的優(yōu)化。(A)pH的影響; (B)偶聯(lián)劑EDC-NHS劑量的影響; (C)抗體量的影響; (D)QBs偶聯(lián)前后熒光光譜圖。Fig.3 Optimization of synthesis conditions of QBs-probe. (A) Effect of pH; (B) Effect of dosage of coupling agent; (C) Effect of the dosage of CAP monoclonal antibodies (mAb); (D) Fluorescence spectra of CdTe/ZnSe QBs and CdTe/ZnSe QBs-mAb/CAP. EDC, 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide; NHS, N-Hydroxysuccinimide

3.3實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

3.3.1NC膜、QBs探針濃度以及測(cè)試時(shí)間的選擇比較了兩種NC(Satorius CN140 NC膜和TEST G-140 NC膜)組裝的試紙條的檢測(cè)效果(圖4A, 4B)。結(jié)果表明，加入0.1～1.0 μg/L CAP標(biāo)準(zhǔn)品后15 min，隨CAP濃度的增加，前者測(cè)得 T/C值呈明顯的梯度下降趨勢(shì)，且熒光強(qiáng)度更亮; 而由后者組裝的試紙條則變化不明顯。因此，本研究采用Satorius CN140 NC膜組裝CAP熒光試紙條。

使用2倍稀釋的QBs探針組裝的試紙條(噴涂量2 μL/cm)檢測(cè)含有CAP的樣品時(shí)，獲得的T/C值明顯高于3倍稀釋的QBs探針，因此本研究最終選擇2倍稀釋的QBs探針包被試紙條的結(jié)合墊(見(jiàn)圖4C)。

免疫層析試紙條的顯色是抗原抗體免疫學(xué)動(dòng)態(tài)反應(yīng)過(guò)程，為了優(yōu)化反應(yīng)時(shí)間，本研究考察了試紙條檢測(cè)1 μg/L CAP濃度時(shí)T/C值隨時(shí)間的變化，加入待測(cè)樣品后，通過(guò)成像系統(tǒng)每隔5 min記錄試紙條T線(xiàn)和C線(xiàn)熒光強(qiáng)度(圖4D，插圖為不同免疫反應(yīng)時(shí)間下的S/N值)。結(jié)果表明，在30 min內(nèi)，空白對(duì)照組和陽(yáng)性組的T/C值變化不明顯，在15 min時(shí)，S/N值(相同時(shí)間點(diǎn)下對(duì)照組和陽(yáng)性組的T/C值的比值)達(dá)到最大，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，S/N值逐漸降低， NC膜上的非特異性結(jié)合增強(qiáng)使背景顏色加深，故選擇15 min為試紙條的最佳分析時(shí)間。

圖4 QBs試紙條制備條件的優(yōu)化。(A) 兩種NC膜的顯色效果; (B) 兩種NC膜上CAP對(duì)應(yīng)的T/C值; (C) QBs優(yōu)化圖，曲線(xiàn)a和b分別為QBs探針2倍和3倍稀釋后測(cè)試氯霉素溶液所對(duì)應(yīng)的T/C值; (D)試紙條的T/C值隨反應(yīng)時(shí)間的變化圖，插圖為不同反應(yīng)時(shí)間下的S/N值，CAP濃度為 1 μg/L。Fig.4 Optimization of immunochromatographic strip test (ICST). (A) Chromogenic result of two kinds of nitrocellulose (NC) membranes. (B) Fluorescence intensity ratio of test line (T line) and C-line (C line) (T/C value) of ICST with two kinds of NC menmbranes . (C) Effect of concentration of QBs-probe on T/C value of ICST. (D) Effect of immunoreaction time on T/C value of ICST, Inset is the chang of signal to noise ration (S/N) value along with immunoreaction time. Concentraion of CAP is 1 μg/L

3.3.2T線(xiàn)抗原及C線(xiàn)二抗噴涂濃度的優(yōu)化由表1可知，固定C線(xiàn)噴涂的二抗含量，試紙條T線(xiàn)的熒光強(qiáng)度隨T線(xiàn)上抗原的濃度增加而加強(qiáng)，T/C值也隨著抗原濃度的加大而增加; 當(dāng)固定T線(xiàn)上抗原的量為0.6 mg/mL時(shí)，試紙條C線(xiàn)的熒光強(qiáng)度隨著二抗?jié)舛鹊募哟蠖鰪?qiáng)。第4、5和8、9組中，雖然T線(xiàn)和C線(xiàn)的熒光強(qiáng)度隨著抗原或二抗的濃度增加而增加，但抑制率偏低; 第6組中，包被的二抗?jié)舛葹?.2 mg/mL時(shí)，檢測(cè)到C線(xiàn)值偏低; 而第7組實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)T線(xiàn)抗原的噴涂量濃度為0.6 mg/mL、C線(xiàn)上二抗的噴涂濃度為0.4 mg/mL時(shí)，試紙條T線(xiàn)和C應(yīng)的熒光強(qiáng)度值最佳，且T/C值也較高，CAP陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)中競(jìng)爭(zhēng)抑制率為42%，因此選用該組濃度噴涂試紙條的T線(xiàn)和C線(xiàn)。

3.4QBs試紙條的檢測(cè)性能

采用CAP陰性的牛奶樣品配制CAP系列標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)QBs試紙條的靈敏度及檢測(cè)范圍。由圖5

表1 T線(xiàn)抗原及C線(xiàn)二抗噴涂濃度的優(yōu)化(n=3)

Table 1 Optimization of concentration of CAP-HS-BSA sprayed on T-line and secondary antibody on C-line (n=3)

組別Groups抗原噴涂濃度ConcentrationofCAP?HS?BSA(mg/mL)二抗噴涂濃度ConcentrationofGaMIgG(mg/mL)T線(xiàn)熒光強(qiáng)度FLintensityofT?lineC線(xiàn)熒光強(qiáng)度FLintensityofC?lineT/C值T/Cvalue競(jìng)爭(zhēng)抑制率1?(B/B0)Inhibitionrate(1?B/B0)10．21437±1427540±330．0159±0．120．46±0．0220．41485±7429312±420．0165±0．060．44±0．0630．61497±3224997±100．0199±0．150．46±0．0340．81508±2826210±720．0194±0．090．34±0．11511607±2221102±120．0288±0．240．30±0．0860．60．2412±112342±530．1761±0．180．38±0．0570．60．4440±4510182±490．0432±0．320．42±0．1480．60．6265±816442±360．0181±0．140．14±0．0490．60．8445±2820460±270．0170±0．060．27±0．07注：CAP濃度為0．1μg/L，B和B0分別為CAP存在和不存在時(shí)的T/C值。Note：ConcentrationofCAPis0．1mg/mL．BandB0areT/CvaluesinthepresenceandabsenceofCAP，respectively．GaMIgG，goatanti?mouseimmunoglobulin

可知，隨著牛奶中CAP含量增加，T線(xiàn)的熒光強(qiáng)度則逐漸變淺直至完全消失，當(dāng)CAP的濃度為0.1 μg/L時(shí)，試紙條T線(xiàn)的熒光強(qiáng)度明顯弱于陰性對(duì)照組的T線(xiàn)，因此以0.1 μg/L為試紙條的檢出限(圖5A)。從圖5B可知，檢測(cè)CAP的濃度范圍為0.1～100.0 μg/L，QBs熒光試紙條的擬合曲線(xiàn)為lgy=0.8103-0.6115lgx，R2=0.9915。

圖5 試紙條的性能評(píng)價(jià)。(A)試紙條靈敏度實(shí)驗(yàn)，1～9 CAP濃度分別為：0、 0.1、 0.5、 1.0、 5.0、 10.0、 25.0、 50.0和100.0 μg/L; (B)試紙條的擬合曲線(xiàn)。Fig.5 Evaluation of property of ICST. (A) Sensibility of CAP ICST, the concentration of CAP from 1-9 is 0, 0.1, 0.5, 1.0, 5.0, 10.0, 25.0, 50.0 and 100.0 μg/L, (B) Calibration curves of ICST

3.5熒光免疫試紙條的特異性和穩(wěn)定性

分別選擇氟苯尼考、甲砜霉素、萊克多巴胺、青霉素4種抗生素(濃度為1000 μg/L)評(píng)價(jià)QBs熒光試紙條的特異性，以PBS作為空白對(duì)照。結(jié)果顯示，當(dāng)試紙條上滴加4種抗生素時(shí)，其T線(xiàn)和C線(xiàn)熒光條帶與空白對(duì)照組基本相同，T/C值檢測(cè)結(jié)果也證明四種抗生素在試紙條上無(wú)交叉反應(yīng)。通過(guò)37℃加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)考察試紙條的穩(wěn)定性，結(jié)果表明，在2周的保存期內(nèi)，雖然試紙條的T線(xiàn)和C線(xiàn)熒光強(qiáng)度值有所減弱，但試紙條的T/C值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.3%～7.0%，檢測(cè)性能未發(fā)生明顯變化。因此，本研究制備的QBs熒光試紙條具有良好的特異性和穩(wěn)定性。

3.6實(shí)際樣品分析

陰性牛奶樣品兩個(gè)濃度水平(0.1和10.0 μg/L)的加標(biāo)回收率分別為97.9%和93.3%，RSD<7%(n=5)。因此，本研究制備的QBs熒光試紙條具有良好的特異性和穩(wěn)定性，其準(zhǔn)確性和精密度可以滿(mǎn)足快速定量篩查的需求。

采用CAP QBs熒光試紙條檢測(cè)30個(gè)牛奶樣品的結(jié)果表明，20份加標(biāo)樣品中， 19份樣品的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性; 10份陰性樣品的檢測(cè)結(jié)果皆為陰性，而且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與商品化ELISA檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果一致。與ELISA方法相比，QBs熒光試紙條法操作更為簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間僅需15 min。與常規(guī)膠體金試紙條法(LOD: 0.2～2.0 μg/L)[20,21]相比，CAP QBs熒光試紙條具有更高的檢測(cè)靈敏度和更強(qiáng)的特異性，可實(shí)現(xiàn)目的分子的定量分析，顯示出良好的應(yīng)用前景。

1 Fraunfelder F T, Bagby G C, Kelly D J.Am.J.Ophthalmol.,1982, 93(3): 420-422

2 Kucers A.J.Antimicrob.Chemother.,1980, 6(1): 1-4

3 Samanidou V, Kehagia M, Kabir A, Furton K G.Analy.Chim.Acta,2016, 914: 62-74

4 WU Li-Yuan.TheChineseLivestockandPoultryBreeding,2014, 10(4): 43-44

吳麗媛. 中國(guó)畜禽種業(yè),2014, 10(4): 43-44

5 YANG Cheng-Dui, SONG Li-Hui, MAO Li-Ha, LIU Mi-Xin.ChineseJ.Anal.Chem.,2004, 32(7): 905-907

楊成對(duì), 宋莉暉, 毛利哈, 劉密新. 分析化學(xué),2004, 32(7): 905-907

6 Schwarm E F, Dabner C, Wilson J W, Boghosian M P.J.Pharmaceut.Sci.,1966, 55(7): 744-745

7 Anna Y K, Jeanne V S, Alexey M. Egorov.FoodAgri.Immunol.,2000, 12: 115-120

8 ZHANG Xiao-Jun, ZHENG Bin.ChineseJournalofAnalysisLaboratory,2010, 29(6): 115-118

張小軍, 鄭 斌. 分析試驗(yàn)室,2010, 29(6) : 115-118

9 Huang X, Aguilar Z P, Xu H, Lai W, Xiong Y.Biosens.Bioelectron.,2016, 75: 166-180

10 Sakamoto S, Yusakul G, Nuntawong P, Kitisripanya T, Putalun W, Miyamoto T, Tanaka H, Morimoto S.J.Chromatogr.B,2017, 1048: 150-154

11 Song C, Zhi A, Liu Q, Yang J, Jia G, Shervin J, Tang L, Hu X, Deng R, Xu C, Zhang G.Biosens.Bioelectron.,2013, 50: 62-65

12 Wang C, Hou F, Ma Y.Biosens.Bioelectron.,2015, 68: 156-162

13 Taranova N A, Berlina A N, Zherdev A V, Dzantiev B B.Biosens.Bioelectron.,2015, 63(2): 255-261

14 Di Nardo F, Anfossi L, Giovannoli C, Passini C, Goftman V V, Goryacheva I Y, Baggianic C.Talanta,2016, 150: 463-468

15 DUAN Hong, CHEN Xue-Lan, JIANG Hu, SHEN Jun, DONG Sheng-Ming, XIONG Yong-Hua, Andrew Wang.ChineseJ.Anal.Chem.,2015， 43(3): 338-343

段 宏, 陳學(xué)嵐, 江 湖, 沈 駿, 董勝明, 熊勇華, Andrew Wang. 分析化學(xué),2015, 43(3): 338-343

16 ZHOU Yao-Feng,XIONG Si-Cheng, JIANG Hu, DUAN Hong, XIONG Yong-Hua.ChineseJ.Anal.Chem.,2015, 43(12): 1837-1843

周耀峰, 熊斯誠(chéng), 江 湖, 段 宏, 熊勇華. 分析化學(xué),2015, 43(12): 1837-1843

17 Campbell G S, Mageau R P, Schwab B, Johnston R W.Antimicrob.AgentsChemother.,1984, 25(2): 205-211

18 Kolosova A Y, Samsonova A M.FoodAgri.Immunol.,2000, 12(2):115-125

19 WANG Hong-Jiang, LIU Ting, XIE Ji, LI Wan-Yuan, GUO Ai-Ling, CAI Zhao-Xia.ChineseJ.Anal.Chem.,2010, 38(5): 632-637

王洪江, 柳 婷, 謝 躋, 栗婉媛, 郭愛(ài)玲, 蔡朝霞. 分析化學(xué),2010, 38(5): 632-637

20 XU Sheng-Nan,YU Qiong-Wei, YUAN Bi-Feng, FENG Yu-Qi.JournalofAnalyticalScience,2016, 32(4): 471-474

許勝男, 余瓊衛(wèi), 袁必鋒, 馮鈺锜. 分析科學(xué)學(xué)報(bào),2016, 32(4): 471-474

21 XIAO Zhi-Li, ZENG Wen-Liang, WANG Hong, SHEN Yu-Dong, SUN Yuan-Ming, YANG Jin-Yi.Food&Machinery,2013, 29(4): 54-58

肖治理, 曾文亮,王 弘, 沈玉棟,孫遠(yuǎn)明,楊金易. 食品與機(jī)械,2013, 29(4): 54-58

This work was supported by the National Key R&D Program (Nos. 2016YFD0501200, 2016YFD0501009), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. Y0201500195), the Natural Science Foundation of Jiangsu Province (No. BK20161452), the Key Program of Science and Technology Planning of Guangdong Province, China (No. 2017B020202010), and the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (Jiangsu, China).

DevelopmentofQuantumDotSubmicrobeads-based
FluorescentImmunochromatographicTestStripfor
RapidDetectionofChloramphenicol

DING Qiao-Qi, LI Li, FAN Wen-Tao, LYU Ya-Nan, HU Jian-Hua, YAN Li-Ping*, SONG Su-Quan*
(CollegeofVeterinaryMedicine,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China)

A fluorescent immunochromatographic test strip based on the quantum dots submicrobeads (QBs) was developed for quantitative detection of chloramphenicol (CAP). In this method, monoclonal antibody of CAP and OBs complex fluorescent probe was first prepared using 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide/N-hydroxysuccinimide coupling approach, then complete antigen CAP-HS-BSA was synthesized and sprayed on nitrocellulose membrane as test line (T line). Similarly, goat anti-mouse antibody was sprayed as control line (C line). The time required for the analysis was 15 min, and the limit of detection (LOD) for CAP was 0.1 μg/L, with a working range of 0.1-100 μg/L. In spiked milk samples, the test strip demonstrated high recoveries in the range from 93.3% to 97.9% with relative standard deviations of less than 7%.

Chloramphenicol; Quantum dot submicrobeads; Immunochromatographic test strip

9 May 2017; accepted 4 September 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.170300