納米基因擴增技術及其應用

桑付明 李 鑫 劉 佳

(哈爾濱工業大學(威海)海洋科學與技術學院， 威海 264209)

納米基因擴增技術及其應用

桑付明*李 鑫 劉 佳

(哈爾濱工業大學(威海)海洋科學與技術學院， 威海 264209)

聚合酶鏈式反應(PCR)是20世紀80年代中期發展起來的一種應用廣泛的體外DNA擴增技術，但目前該技術仍然存在著一些問題，如特異性差、靈敏度低和假陽性等。近年來，隨著納米科技的發展，一些納米粒子如金屬納米粒子、碳納米材料、量子點和納米金屬氧化物等被引入到PCR反應體系中，即納米基因擴增技術(NanoPCR)。該技術大幅度提高了PCR的擴增效率、選擇性、靈敏度和特異性，推動了生物學技術的發展，具有非常重要的理論意義和應用價值。本文綜述了近年來納米基因擴增技術的主要研究進展、反應機理，并探討了其應用研究。

納米基因擴增技術； 納米材料； 特異性； 擴增效率； 熱啟動;評述

2017-02-17收稿； 2017-09-04接受

本文系國家自然科學基金(No. 21407035)、山東省自然科學基金(No. ZR2014BM021)和威海市大學共建項目(No. 2014XGJ15)資助

* E-mail: sangfuming@hitwh.edu.cn

1 引 言

聚合酶鏈式反應(PCR)是美國的Mullis于1985年提出的可以在體外進行特定DNA復制的技術[1]。PCR技術操作簡單省時，可將微量的目的基因片段在短時間內擴增到數百萬倍，已廣泛用于基因克隆[2]、DNA測序[3]、基因分析[4]、基因芯片[5]及法醫學[6]等領域。盡管PCR技術發展已經很成熟，但在實際操作中，始終存在一些問題，如假陰性、假陽性、產物特異性差、擴增效率低甚至不擴增，以及富含GC堿基對的DNA很難通過PCR擴增得到產物[7]等情況，限制了PCR技術的進一步發展及其更廣泛的應用，因此如何提高PCR技術的特異性、靈敏度及穩定性至關重要[8]。目前，采用較多的方法是使用PCR增效劑，如二甲亞砜(DMSO)、甘油、甲酰胺和甜菜堿等[9～11]。這些增效劑有利于減少DNA的二級結構并降低GC富集區的熔點及解鏈溫度，有助于模板完全變性，促進模板與引物的特異性結合，因此在一定程度上提高了PCR的擴增效率和特異性，但其擴增結果仍然不理想，未完全解決PCR中存在的上述難題。

近年來，納米材料由于其獨特的化學、物理特性，例如大的比表面積、小尺寸效應等，受到研究者的廣泛關注，并逐步滲透到生命領域，推動了生命科學技術的發展。一些納米材料如納米金[12]、量子點(Quantum dots, QDs)[13]、碳納米管[14]等被應用到PCR擴增中，形成了納米基因擴增技術(NanoPCR)。該技術顯著地提高了PCR的特異性、擴增效率及靈敏度，并加快了PCR反應進程，已成為當前的研究熱點。本文主要從各種納米材料對PCR擴增技術的影響、機理探討及其應用3個方面分別進行概述。

2 納米材料對PCR擴增體系的影響

納米材料晶粒極小，比表面積大，因而具有許多特殊的性質，如表面效應、量子效應等，但不同的納米材料又有不同的特性，如水溶性、生物相容性及熱穩定性等[15]，因此對PCR體系的影響也不相同。

2.1納米金對PCR體系的影響

Li等[12]首先用檸檬酸鈉為穩定劑制備粒徑為10 nm的納米金，作為PCR增效劑進行實驗。當納米金濃度為0.4～0.8 nmol/L時，提高了兩輪再擴增體系的特異性，明顯抑制了非特異性片段的擴增(圖1)。但當納米金濃度超過1.0 nmol/L時，過量的納米金對PCR產生抑制作用。另外，即使在較低的退火溫度(25 ～40℃)下，PCR擴增特異性仍然非常高，即納米金拓寬了PCR的退火溫度。隨后，Pan等[16]以多輪PCR為研究體系，發現加入納米金后，經過六輪擴增，仍然可得到特異性強的目標條帶，而普通PCR體系(未加入納米金)擴增到第四輪時就不能得到目標條帶，這進一步證實了納米金可以提高PCR擴增的特異性。Vu等[17]以多重PCR為研究體系，研究納米金對PCR擴增的影響。他們認為納米金不能直接提高PCR特異性，而是更有利于體系中小片段DNA的擴增，對大片段DNA的擴增起抑制作用；另外，他們推測AuNPs的這種作用源于其良好的表面效應而非熱傳導效應，且納米金與DNA聚合酶吸附作用更強，導致體系中聚合酶的實際濃度降低，促進了小片段的擴增。

Li等[18]研究了0.7 nmol/L 納米金(13 nm)對PCR擴增的影響，發現納米金可以顯著提高PCR擴增效率，縮短反應時間。他們對不同的PCR體系、不同DNA聚合酶及不同長度的DNA片段分別進行研究，發現對于普通PCR，其靈敏度可以提高5～10倍，而對于實時定量PCR，至少可以提高104倍。Li等[18]將納米金的這些作用歸于其良好的熱傳導性，可以有效改善PCR體系的升降溫速率。納米金有助于雙鏈DNA的解鏈，利用這一點，Yang等[19]研究發現，加入納米金可以促進高GC模板GNAS1啟動子區域(～84%GC)的擴增。Girilal等[20]則從生物合成的角度出發，用嗜熱脂肪土芽孢桿菌的無細胞提取物來合成納米金。該方法合成的納米金具有良好的熱傳導效應和熱穩定性，可以縮短PCR的反應時間，提高其特異性、擴增效率。

圖1 納米金(0.4 nmol/L，10 nm)對PCR特異性的影響。λ-DNA為模板，目標片段長度283 bp。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。M: maker。泳道1和泳道2：無納米金的PCR結果；泳道3和泳道4：添加納米金的PCR結果[12]Fig.1 Effect of gold nanoparticles ( 10-nm AuNPs, 0.4 nmol/L) on the specificity of polymerase chain reaction (PCR).PCR was performed by employing a 283-bp target sequence from a λ-DNA template, and PCR products were analyzed by agarose gel electrophores (1.5%). Lane M is marker; lanes 1 and 2 show the results of PCR performed in the absence of AuNPs; lanes 3 and 4 show the results of PCR performed with AuNPs. bp=base pair[12]

不同表面修飾的納米金與PCR組分的相互作用不同，因而其對PCR的影響也不同。Cao等[21]研究發現聚酰胺胺(PAMAM)樹狀大分子(G5-NH2)可以提高PCR的特異性，隨后Chen等[22]采用氨基末端聚酰胺胺(PAMAM)樹狀大分子(G5-NH2)包裹納米金(Au-DENPs)， 并將其應用到PCR體系中。研究結果表明，Au-DENPs能夠有效地提高PCR的特異性及擴增效率。當Au原子與G5-NH2摩爾比例為100∶1時，檢出限可達0.37 nmol/L。作者認為包含有納米金的樹形大分子可以保持3D球形形態，能更好地與PCR組分進行相互作用。該課題組[23]還進一步探究不同末端聚酰胺胺(PAMAM)樹狀大分子(G5-NH2)包裹納米金(Au-DENPs)對于PCR體系的影響，發現氨基和羥基末端修飾的納米金更加有效，所需濃度最低。

2.2量子點對PCR反應的影響

量子點作為一種新型熒光無機納米材料，具有發光波長可調性、發光效率高和發光峰窄等特點，受到廣泛關注，例如單分子檢測、細胞成像、腫瘤靶向和診斷等應用[24]。另外，量子點具有優異的理化性質及生物相容性，被用于PCR擴增中，包括硫基乙酸修飾CdTe量子點和硫基乙酸修飾的CdSe以及CdSe/ZnS量子點等[25～27]。

Wang等[25]考察了在不同退火溫度和不同長度模板DNA條件下，羧基修飾的CdTe量子點對PCR體系特異性的影響。通過與納米金結果對比發現，量子點可以顯著提高PCR體系的特異性，但當CdTe量子點濃度超過最佳濃度時會產生抑制作用。特別對于短DNA片段，量子點的效果更加顯著。和納米金類似，采用量子點的PCR體系，在退火溫度范圍為30～45℃時仍可得到特異性強的擴增產物。

Ma等[26]采用硫基乙酸修飾量子點，發現在低退火溫度下(25～45℃)，仍可大幅度提高PCR體系產率和特異性。通過對不同表面修飾的量子點的研究，他們指出，量子點提高PCR特異性的原因是基于量子點核自身結構與DNA聚合酶作用，而不是其表面狀態。Liang等[27]以多重PCR為研究模板，采用粒徑4.5 nm的CdTe QDs進行研究，證實QDs可以減少多重PCR體系中非特異性的擴增，因而顯著提高擴增的特異性，進一步證實了以前的研究結果。 本課題組的研究發現，量子點可以加快PCR的擴增速率，將擴增時間由143 min降到46 min[28]。

圖2 基于量子點的熱啟動及其與熱啟動酶結果的對比。 PCR體系在50℃下分別預溫浴不同時間(0-1 h)； 引物分別為 (A) B9-10； (B) B17-18； (C) A99-100；1.2 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測。 M: MW DL2000[29]。Fig.2 Confirmation of hot-start (HS) effects by three pairs of primers with three test models after incubation for different time (0-1 h). (A) B9-10; (B) B17-18; and (C) A99-100. PCR products were analyzed by agarose gel electrophoresis (1.2%). Lane M: MW DL2000[29].

熱啟動PCR是實現可重復性好、靈敏度高、特異性強的基因擴增的一種非常重要的技術。該技術利用各種物理、化學方法控制PCR反應的必須組分，如DNA聚合酶和Mg2+等來影響PCR的進行，從而有效的抑制非特異性產物以及引物二聚體的形成，提高引物和模板結合的效率。目前應用廣泛的是商品化的熱啟動酶，但其價格昂貴，不適合大量實際樣本的常規檢測。最近，本課題組發現，量子點可以動態調控常規PCR中高保真聚合酶(Pfu酶)的活性，實現類似“熱啟動”的高效DNA體外復制過程[29]。加入了量子點的PCR反應體系在50℃分別溫育不同時間(0～1 h)，仍然得到特異性的擴增，且結果可以與商品化的熱啟動酶相媲美，而對照(未加量子點)實驗則出現了大量非特異性擴增片段(如圖2)。

隨后，本研究組將該技術應用于熒光定量PCR，構建了基于量子點的高通量熒光定量PCR體系[30]。分別以質粒 DNA和PCR 產物為模板，PCR反應液在50℃溫育1 h， 即使是在再輪擴增體系中，仍得到特異性強的擴增(圖3)，而對照實驗得到的都是二聚體以及非特異性擴增。實驗中還發現，CdTe量子點對基于高保真聚合酶的PCR體系效果明顯，而普通Taq聚合酶則沒有明顯效果。實驗初步證實了量子點與普通Taq聚合酶的非特異性吸附相互作用弱于其與高保真聚合酶之間的作用，所以對于普通Taq聚合酶沒有明顯效果。在低溫下量子點和聚合酶結合從而降低酶的活性，抑制了非特異性片段的擴增；在高溫時，二者分離，聚合酶的活性恢復，因而量子點起到了很好的熱啟動效果。不過考慮到PCR體系的復雜性，量子點影響PCR的機理還有待進一步的探究。相對于其它熱啟動技術, 該技術具有簡單、成本低、重復性好、普適性好、易于推廣等優點，可以應用于大量實際樣品的高通量擴增。

2.3碳納米管對PCR反應體系的影響

碳納米管具有導電性好、比表面強度高、機械強度高[31]、韌性高等優點，廣泛的應用于生物傳感器、DNA納米科技等方面，且該材料具有良好的表面性能和高熱傳導效率，因而碳納米管在PCR擴增中也得到較多的應用。

Cui等[32]首先提出單壁碳納米管(SWNTS)可以提高PCR的產率，但其濃度超過3 μg/mL時反而會起抑制作用。此外，研究還發現，即使沒有Mg2+，SWNTS可以替代Mg2+的作用，保證DNA聚合酶的正常催化聚合活性。

為了滿足實驗分析需要，DNA樣品通常需要重復擴增多次。在實際PCR操作中，也會采用上一輪擴增的結果來作為下一輪擴增的模板DNA，因此當遇到DNA擴增效果不好、產率低的現象，便會導致重復擴增次數增加，產物特異性降低。基于這樣的考慮，Zhang等[33]提出碳納米管的懸浮體有助于這樣的重復PCR擴增以及長片段PCR擴增。實驗結果表明，當體系加入碳納米管后，PCR進行到第六輪擴增后仍可得到目標產物，同時還發現，該粒子還可提高長片段PCR的擴增效率。 Zhang等[34]以長度為14.3 kb的長DNA片段作為模板，發現0.8～1.6 mg/mL多壁碳納米管(MWCNTs)可以提高PCR

圖3 基于量子點的熱啟動在實時定量PCR中的應用。模板為人類基因組的長度為963 bp的PCR產物，熒光染料是EvaGreen，PCR體系在50℃中預溫育1 h，采用Pfu聚合酶。(A)Pfu擴增曲線; (B)Pfu+QDs擴增曲線; (C)Pfu標準曲線; (D)Pfu熔解曲線; (E)Pfu+QDs熔解曲線;(F)Pfu+QDs標準曲線; (G)上述結果的瓊脂糖凝膠電泳圖(1.2%)。Lane M: MW DL2000[30]。Fig.3 Real time PCR analysis of the second round amplification of a 96.3 bp target from human genomic DNA after 1 h preincubation at 50℃ using the EvaGreen detection system. Pfu DNA polymerase was used as polymerase. (A) Linear amplification data for control without QDs; (B) linear amplification data with QDs; (C) standard curve for control without QDs; (D) melting curve analysis for control without QDs; (E) melting curve analysis with QDs; (F) standard curve with QDs; (G) agarose gel (1.2%) electrophoresis of real time PCR products for different template dilutions. Lane M: MW DL2000[30].

體系的產率和特異性，其最佳濃度為0.8 mg/mL。 另外納米碳粉也對PCR體系產生促進作用，并且由于其尺寸和表面性能，濃度不同會產生不同的影響。Quaglio等[35]將MWCNTs與PDMS相結合，這種復合納米材料具有良好的熱傳導性和熱穩定性，運用到PCR體系中提高了PCR的擴增效率，整體時間比之前減少了75%，因此通過改變復合碳納米管含量，可以更精確的控制生物反應的流程效率。

2.4氧化石墨烯與還原石墨烯納米材料對PCR反應體系的影響

石墨烯(GO)是碳原子以SP2雜化方式形成的一種單原子層厚度的準二維的納米材料，具有高比表面積、良好的穩定性和生物相容性等，在生物醫學等領域得到了廣泛的應用[36,37]。另外，其還具有良好的傳熱、導電以及與單鏈DNA及蛋白質相結合的特性等，因而廣泛應于于PCR擴增中[38,39]。

Jia等[37]首先發現當在PCR中添加12 mg/mL～60 mg/mL的GO時，可以提高 PCR擴增的特異性，而GO濃度低于12 mg/mL時對PCR體系沒有影響，GO濃度高于70 mg/mL時則會產生抑制作用。還原石墨烯(rGO)對于PCR體系的最佳添加濃度為0.8 mg/mL，在添加濃度超過12 mg/mL時則會產生明顯的抑制作用。對于多輪PCR的擴增，rGO作用更加明顯，經過8輪擴增后仍然得到特異性的擴增，可能由于GO和rGO相比，其負電位較強，和DNA分子之間的斥力更大，因此效果不如rGO。

石墨烯良好的熱傳導性可以提高PCR的選擇性和特異性。Abdul等[39]研究也證明了GNFs可以提高PCR的導熱系數，且效果主要取決于GNFs的濃度。當加入GNFs過量時，會起到抑制作用。同時，粒子的大小也是關鍵因素，影響其表面積，當表面積增大時，PCR的產率也會提高。實驗通過流體力學(CFD)模型模擬是否添加GNFs的對照實驗，其結果也說明了GNFs優良的熱導效應是增強PCR效率的主要原因。

2.5金屬氧化物納米材料對PCR體系的影響

TiO2和SiO2等金屬氧化物納米粒子對于PCR體系的影響也比較明顯。Abdul等[40]研究發現，將粒徑為25 nm的TiO2加入到不同DNA模板來源(如質粒DNA，基因DNA，互補DNA)的PCR體系中，擴增效率和空白對照組相比高2.9～6.9倍，且通過減少每個循環周期的時間，最終所用時間是原來的一半，其最佳使用濃度為0.4 nmol/L。TiO2良好的熱傳導效應，加速了模板DNA的變性，從而縮短反應時間。Wan等[41]也研究了TiO2在PCR中的作用，并與其它納米材料進行比對。實驗發現，當TiO2濃度達到0.8 μg/mL時會對體系產生抑制作用，當濃度達到5 μg/mL時，反應被完全抑制。實驗還證明了當TiO2與銀納米粒子結合時，其促進效果更加顯著。Lenka等[42]分別在普通 PCR、q-PCR(實時定量PCR)、RT-PCR(反轉錄PCR)中，對粒徑為7 nm的TiO2所產生的作用進行探究，發現在普通PCR體系中，0.2 nmol/L TiO2可實現目標DNA在極低模板濃度下的擴增，并且和前人的結果對比，發現加入小粒徑的TiO2的PCR產率是大粒徑(25 nm)的3倍甚至更高，但在q-PCR、RT-PCR中，則沒有明顯效果。

Park等[43]將聚多巴胺包覆的SiO2(PDA silica)和碳化的聚多巴胺包覆的SiO2(C-PDA silica)納米粒子分別加入到PCR反應體系中，考察它們對PCR體系的作用。研究發現C-PDA粒子表面可以提供多個接觸點用來結合引物和聚合酶，增加了體系穩定性，而碳化的聚多巴胺包覆的SiO2效果最突出。由此可見，復合納米材料可以不同程度改善PCR體系的環境，使其更有利于反應的進行。

Ma等[44]認為磁性納米粒子具有良好的磁化強度、超順磁性，相對于其它納米材料，其表面更容易功能化，他們對粒徑為8～10 nm的表面修飾了羧基的Fe3O4納米材料進行研究，研究結果表明，其可以提高PCR的靈敏度，檢出測限可達到4.26 amol/L。

3 納米PCR中納米材料的作用機理

引物錯配和非特異性擴增嚴重影響了PCR擴增的靈敏度和特異性，而納米材料通常具有良好的表面性能、熱傳導作用以及與單鏈DNA和蛋白質特異性結合等特性，廣泛地應用于納米基因擴增中，并極大地提高其擴增特異性、靈敏度和產率。但是由于PCR體系自身的復雜性，目前對于納米PCR的機理仍然不是很清楚。根據目前的研究結果，推測納米材料優化PCR主要基于以下兩個方面。

3.1納米材料的表面作用

納米材料表面積大，表面效應強，其作用主要可以分為兩方面：一方面與引物或模板DNA作用，另一方面則是與體系中的聚合酶相互作用。

Li等[45]利用納米金團聚所產生的顏色變化設計了雜交試驗，根據實驗結果提出，納米金對于單鏈DNA(ssDNA)作用更強。Li等[11]也采用納米金進一步驗證了以上結論，并提出納米金與單鏈結合蛋白(SSB)作用類似。首先雙鏈DNA(dsDNA)由于磷酸基團暴露在外面，與單鏈DNA(ssDNA)相比，堿基暴露程度小，由于靜電效應，納米金更容易與ssDNA結合。在粒徑1～50 nm范圍內，ssDNA相對dsDNA更加柔軟， 易于纏繞在納米金的表面。SSB或者納米金選擇性地結合ssDNA，阻礙引物和模板的錯配，降低了體系錯配的可能性，減少了非特異性的擴增。

除DNA以外，PCR反應體系中還包含蛋白質等。 Yi等[46]觀考察了有無羧基化的多壁碳納米管和單壁碳納米管對于PCR體系的影響，研究結果表明，納米材料會與體系內的限制性內切酶、DNA聚合酶相互作用，從而降低甚至抑制酶的活性，基于此提出了蛋白質和納米材料相互作用機理。Mi等[47]認為納米金可以動態調節DNA聚合酶活性，起到類似熱啟動PCR 的作用，有效抑制非特異性擴增。實驗中還發現，在較低溫度時，納米金會降低高保真Pfu聚合酶的活性，即使在30～60℃溫育1 h后，仍然可以得到特異性很高的單一目標產物。 本研究組的研究也發現量子點具有類似的熱啟動效應[29]，初步認為這種類似熱啟動的效應主要源于量子點和高保真聚合酶Pfu的相互作用，使得擴增結果更加準確可信，此外，還可以減少實驗成本，對于未來研究具有重要意義。

Lou等[48]利用納米金進一步驗證了以上的結論，并從PCR作用流程進行了深層次探究。首先，他們證明了納米粒子可以作用于體系中的聚合酶，通過良好的表面性能與聚合酶結合從而改變聚合酶的有效濃度。其次，他們更深入地探究了納米材料對于錯配過程的影響， 發現納米材料的加入會使得錯配體系溫度更低。實驗結果表明，1 nmol/L 納米金可以使正反向錯配體系的退火溫度降低1.0℃和1.7℃，而完全匹配體系則減少0.3℃和1.0℃，通過增加引物完全匹配和錯配之間的退火溫度差增強PCR體系的特異性。 他們還提出了納米材料表面與PCR產物結合，在變性時促進其分解的機理。

Bai等[49]采用氨基修飾的二氧化硅磁性納米材料(ASMNPs)對納米PCR反應機理進行了更全面的研究。首先，他們認為納米材料表面的活性基團會結合PCR中的DNA聚合酶、Mg2+、引物或DNA模板等，所以當加入過量時，會降低反應速率，抑制PCR的進行。其次，納米材料并不會抑制因錯配而導致的非特異性擴增，而是低濃度的納米粒子會抑制長片段的擴增，高濃度的納米粒子則會抑制小片段的擴增，即納米粒子的表面性能對PCR產生顯著的影響。因此，了解每種納米材料的表面特征，對于優化其在PCR上的作用有很大的幫助。

3.2納米材料的熱傳導性

納米材料良好的熱傳導性在PCR體系不同溫度變化的循環過程中也可能會起到重要的作用。Li等[18]通過改變PCR體系、DNA聚合酶、模板DNA的長度等探究其作用機理，提出納米材料良好的熱傳導性能，可以有效的改善PCR體系升/降溫速率，從而縮短反應時間，使體系的反應效率明顯增加。實驗結果發現，納米金可使PCR的靈敏度提高5～10倍，對于q-PCR的靈敏度可以提高104倍。Lin等[50]提出金納米粒子通過提高體系的熱傳導性，來提高熱循環效率，因而提高PCR體系的特異性和擴增效率。納米金促進DNA模板解鏈，同時大幅度提高引物、DNA片段與模板發生錯配的解離速率，縮短了反應時間，從而提高PCR的特異性和效率。Xun等[51]制備了表面修飾mPEG2000的CdSe/ZnS量子點(QD590-mPEG2000)，該量子點可在體系進行40個熱循環后仍保持穩定，熒光信號沒有降低，同時也保證了該材料在PCR體系中與其它成分的兼容性，作用不會受到影響，進一步證實了納米材料的熱傳導性對于體系的調節起到不可忽視的作用。Abdul等[39]證明GNFs可以提高PCR體系的導熱系數，進而提高PCR的擴增效率及其特異性，其中GNFs的尺寸大小起到了關鍵性作用。

4 納米PCR的應用及展望

NanoPCR具有高靈敏度、高特異性及高選擇性等優點，目前該技術在病毒檢測、基因測序中應用廣泛。 Ma等[52]利用NanoPCR技術來檢測和區分野生型和基因缺失型偽狂犬病病毒(PPV)，從病毒中選取3組引物進行特異性擴增，分別得到431 bp(gB)、316 bp(gE)和202 bp(gG)3組產物。實驗結果表明，當采用這種純化質粒構建的帶有特殊基因片段產物，其靈敏度是傳統PCR的100～1000倍。

Cui等[53]利用該技術實現了對豬細小病毒(PPV)的檢測，對該病毒有良好的靈敏度和選擇性，成功實現對109份試劑樣品的檢測，對于研究PPV有重要意義，同時也為研究其它病毒提供了新的思路。

Wang等[54]利用NanoPCR技術對豬的博卡病毒檢測(PBoV)進行檢測，與普通PCR技術相比，靈敏度為原來的100倍，最低檢測限為6.70×101個拷貝。而Yuan等[55]則首次利用NanoPCR技術對豬流行性腹瀉病毒(PEDV)的RNA基因組進行檢測，靈敏度是常規RT-PCR的100倍， PEDV RNA最低檢測限為2.7×10ng/μL，這項研究可以應用于臨床診斷和PEDV的現場實時監測。他們還利用這項技術對鴨坦布蘇病毒(DTMUV)進行檢測56]，靈敏度提高了10倍，最低RNA檢測拷貝數為1.8 ×102/μL。該課題組還進行腦心肌炎病毒(EMCV)方面的檢測[57]，在保證體系與樣品中其它病毒無交叉作用條件下，實現了最低檢測RNA拷貝數為1.2 ×102/μL，同時這也是nanoPCR技術在該病毒研究領域的首次應用。而Elhusseini等[58]則采用粒徑為15 nm的納米金加入到PCR體系中，將馬皰疹病毒1型(EHV-1)的檢出限從104～105個降到102個DNA拷貝，并改善了原檢測體系出現假陰性的問題。

在人類病毒研究方面，沙門氏菌在很多發展中國家依舊是對健康有嚴重威脅的病毒，對于這樣的傷寒類病毒多采用血樣檢測，靈敏度和對病毒的選擇性都有待提高。Rehman等[59]采用磁性納米粒子對PCR技術進行改進，降低了基于VNTRs的傷寒桿菌PCR檢測的非特異性，促進了該技術的發展。

細菌氣溶膠含量微小，且成分復雜，其定量檢測一直是難點。Xu等[60]利用TiO2納米粒子結合銀納米粒子引入PCR中來檢測空氣中的細菌氣溶膠。通過檢測大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的數量，發現將兩種納米粒子混合后的效果明顯高于單個納米粒子，最低檢測濃度可達到40 pg/μL，靈敏度約為傳統PCR的500倍。

NanoPCR技術的發展為生物分子的研究開辟了一個新的思路和方向，相比傳統PCR技術，當體系中添加入納米材料時，通過其優良的表面性能和熱傳導效應，可以有效縮短反應時間，提高擴增效率和體系特異性，進而提高檢測靈敏度。NanoPCR在實際研究尤其是在病毒檢測方面具有重要的應用價值和意義，為人類病毒的研究發展提供了新的可能，在未來生物醫學領域具有良好的應用前景。另一方面，由于PCR反應體系的復雜性以及納米材料的自身特點等原因，NanoPCR的反應機理仍然不清楚，因此詳實的探究NanoPCR的反應機理非常重要，而開發更多無毒高效的納米材料并將其應用PCR技術中是未來重要的研究方向。

1 Mullis K B, Faloona F A.MethodsEnzymol.,1987, 155: 335-350

2 Filteau M J, Lagace G. LaPointe G, Roy D G.Syst.Appl.Microbiol.,2010, 33(3)：165-173

3 Tiba M R, Moura d C, Carazzolle M F, Leite D d S. Braz.J.Infect.Dis.,2011, 15(2): 144-150

4 Jung Y L, Jung C, Parab H, Park H G.ChemBioChem,2011, 12(12): 1387-1390

5 Huber M, Mündlein A, Dornstauder E, Schneeberger C, Tempfer C B, Mueller M W, Schmidt W M.Anal.Biochem.,2002, 303(1): 25-33

6 Kasai K, Nakamura Y, White R.J.ForensicSci.,1990, 35(5): 1196-1200

7 Zhang Z Z, Yang X, Meng L Y, Liu F, Shen C C, Yang W G.BioTechniques,2009, 47(3): 775-779

8 HE Qi-Di, HUANG Dan-Ping, HUANG Guan, CHEN Zuan-Guang.ChineseJ.Anal.Chem.,2016, 44(4): 542-550

何啟迪, 黃丹萍, 黃 冠, 陳纘光. 分析化學,2016, 44(4): 542-550

9 Varadaraj K, Skinner D M.Gene,1994, 140(1): 1-5

10 Henke W, Herdel K, Jung K, Schnorr D, Loening S A.NucleicAcidsRes.,1997, 25(19): 3957-3958

11 Chou Q, Russell M, Birch D E, Raymond J, Bloch W.NucleicAcidsRes.,1992, 20(16): 4371

12 Li H K, Huang J H,Lv J H, An H, Zhang X D,Zhang Z Z, Fan C H, Hu J.Angew.Chem.Int.Ed.,2005, 44(32): 5100-5103

13 Wang L B, Zhu Y Y, Jiang Y, Qiao R R, Zhu S F, Chen W, Xu C L.J.Phys.Chem.B,2009, 113(21): 7637-7641

14 Cui D X, Tian F R, Kong Y, Titushikin I, Gao H J.Nanotechnology,2004, 15(1): 154-157

15 Nel A E, M?dler L, Velegol D, Xia T, Hoek E M V, Somasundaran P, Klaessig F , Castranova V, Thompson M.Nat.Mater.,2009, 8(7): 543-557

16 Pan J K, Li H K, Cao X Y, Huang J H, Zhang X D, Fan C H,Hu J.J.Nanosci.Nanotechnol.,2007, 7(12): 4428-4433

17 Vu B V, Litvinov D,Willson R C.Anal.Chem.,2008, 80(14): 5462-5467

18 Li M, Lin Y C, Wu CC, Liu H S.NucleicAcidsRes.,2005, 33(21): e184

19 Yang W C, Li X H, Sun J L, Shao Z F.ACSAppl.Mater.Interfaces,2013, 5(22): 11520-11524

20 Girilal M, Mohammed Fayaza A, Mohan Balaji P, Kalaichelvana P T.ColloidsSurf.B,2013, 106(6): 165-169

21 Cao X Y, Shi X Y, Yang W C, Zhang X D, Fan C H, Hu J.Analyst,2009, 134(1): 87-89

22 Chen J J, Cao X Y, Guo R, Shen M W, Peng C, Xiao T Y, Shi X Y.Analyst,2011, 137(1): 223-228

23 Cao X Y, Shen M W, Zhang X D, Hu J, Wang J H, Shi X Y.Electrophoresis,2012, 33(16): 2598-2603

24 Walling M A, Novak J A, Shepard J R E.Int.J.Mol.Sci.,2009: 10(2): 441-491

25 Wang L B, Zhu Y Y, Jiang Y, Qiao R R, Zhu S F, Chen W, Xu C L.J.Phys.Chem.B,2009, 113(21): 7637-7641

26 Ma L, He S B, Huang J, Cao L, Yang F, Li L J.Biochimie,2009, 91(8): 969-973

27 Liang G F, Ma C, Zhu Y L, Li S C, Shao Y H, Wang Y, Xiao Z D.NanoscaleRes.Lett. ,2011, 6(1): 1-7

28 Sang F M, Yang Y, Zhao H X, Ma M R, Zhang ZZ.J.Exp.Nano.,2015, 10(6): 476-482

29 Sang F M, Yang Y, Wang JJ, Huang X Y, Ren J C, Zhang Z Z.J.Exp.Nano.,2014, 9(10): 1051-1063

30 Sang F M, Yang Y, Yuan L, Ren J C, Zhang Z Z.Nanoscale,2015, 7(38): 15852-15862

31 Hüttel A K, Steele G A, Witkamp B, Poot M, Kouwenhoven L P, Zant H S J.NanoLett.,2009, 9(7): 2547-2552

32 Cui D X,Tian F R, Kong Y, Titushikin I, Gao H J.Nanotechnology,2004, 15(1): 154-157

33 Zhang Z Z, Wang M C, An H J.Nanotechnology,2007, 18(35): 355706

34 Zhang Z Z, Shen C C, Wang M C, Han H, Cao X H.BioTechniques,2008, 44(4): 537-545

35 Quaglio M, Bianco S, Castagna R, Cocuzza M, Pirri C F.Microelectron.Eng.,2011, 88(8): 1860-1863

36 Daniel R, Dreyer R S. Ruoff. Christopher W B.Angew.Chem.Int.Ed.,2010, 49(49): 9336-9345

37 Cai W W, Piner R D, Stadermann F J, Park S J, Shaibat M A, Ishii Y, Yang D X, Velamakanni A, An S J, Stoller S M, An J H, Chen D M, Ruoff R S.Science,2008, 321(5897): 1815-1817

38 Jia J, Sun L P, Hu N, Huang G M, Weng J.Small,2012, 8(13): 2011-2015

39 Abdul K R, Kafafy R M, Salleh H M, Faris W F.Nanotechnology,2012, 23(45): 455106

40 Abdul K R, Sonawane P J, Sasi B K, Sahu B S, Pradeep T, Das S K, Mahapatra N R.Nanotechnology,2010, 21(25): 255704

41 Wan W J, Yeow J T W, Dyke M I V.IEEECNanotechnol.,2009, 9: 458-461

42 Lenka G, Weng W H.Dig.J.Nanomater.Bios.,2013, 8(4): 1435-1445

43 Park J Y, Back S H, Chang S J, Lee S J, Lee K J, Park T J.ACSAppl.Mater.Interfaces,2015, 7(28): 15633-15640

44 Ma W, Yin H H, Xu L G, Wang L B, Kuang H, Xu C L.Chem.Commun.,2013, 49(47): 5369-5371

45 Li H X, Rothberg L.Proc.Natl.Acad.Sci.,2004, 101(39): 14036-14039

46 Yi C Q, Fong CC, Chen W W, Qi S J, Tzang C H, Lee S T, Yang M S.Nanotechnology,2007, 18(2): 1055-1060

47 Mi L J, Wen Y Q, Pan D, Wang Y H, Fan C H, Hu J.Small,2009, 5(22): 2597-2600

48 Lou X H, Zhang Y.ACSAppl.Mater.Interfaces,2013, 5(13): 6276-6284

49 Bai Y L, Cui Y, Paoli G C, Shi C L, Wang D P, Shi X M.ACSAppl.Mater.Interfaces,2015, 7(24): 13142-13153

50 Lin Y, Li J, Yao J, Liang Y, Zhang J, Zhou Q F, Jiang G B.Environ.Chem.,2013, 58(36): 4593-4601

51 Xun Z, Zhao X Y, Guan Y F.Nanotechnology,2013, 24(35): 355504

52 Ma X J, Cui Y C, Qiu Z, Zhang B K, Cui S J.J.Virol.Methods,2013, 193(2): 374-378

53 Cui Y, Wang Z, Ma X, Liu J, Cui S.Lett.Appl.Microbiol.,2014, 58(2): 163-167

54 Wang X L, Bai A Q, Zhang J, Kong M M, Cui Y C, Ma X J, Ai X, Tang Q H, Cui S J.J.Virol.Methods,2014, 202(16): 106-111

55 Yuan W Z, Li Y N, Li P, Song Q Y, Li L M, Sun J G.J.Virol.Methods,2015, 220: 18-20

56 Yuan W Z, Li J N, Li P, Sun J G, Chen L G, Liu J X.Lett.Appl.Microbiol.,2015, 62(1): 63-67

57 Yuan W Z, Li Y N, Wang J C, Wang J F, Sun J G.Vet.Arhiv,2016, 86(1): 1-8

58 Elhusseini D M, Helmy N M, Tammam R H.RSCAdv.,2016, 6(60): 54898-54903

59 Rehman A, Sarwar Y, Raza Z A, Hussain S Z, Mustafa T, Khan W S, Ghauri M A, Haque A, Hussain I.Analyst,2015, 140(21): 7366-7372

60 Xu S Y, Yao M S.J.Aerosol.Sci.,2013, 65(65): 1-9

This works was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 21407035)

卓立漢光新品推出：Omni-λBright300光纖輸出可調單色光源

卓立漢光多年專注于光譜儀與高穩定光源研發，積累了豐富的經驗，可提供多種可調單色光源(其組件包括氙燈、溴鎢燈、氘燈等光源以及光譜儀)，主要用于光、電元器件的表征。典型應用如下：光探測器量子效率(QE)測量系統、太陽能電池光電轉換效率測量(QE/ IPCE)系統、各類CCD/CMOS 影像器件模組光色標定系統等。 承載十年研發經驗，全新推出高性能、高輸出功率的可調單色光源Omniλ-Bright 系列。

典型應用：

PEC光電化學測試； 透反吸測試系統； 太陽能電池量子效率測試系統； 用于熒光光譜測試系統的激發光源； 表面光電壓測試； 探測器光譜響應度測試系統； 光學鏡頭透過率測試系統； 防護眼鏡產品測試系統； CCD/CMOS影像器件模組的光色標定。

Omni-λBright 系列可調單色光源主要由200 mm 焦距影像光譜儀、75W 氙燈光源以及其他配件組成。整個系統的光學設計經過多次優化，以保證最佳的分辨率和最大的光通量，同時又最大強度地抑制了雜散光，提升測量的準確度, 用戶通過簡單的幾個步驟就可以快速實現測試。

FENXIHUAXUECHINESEJOURNALOFANALYTICALCHEMISTRY(月刊，1972年創刊)(Monthly，Started1972)第45卷 第11期 2017年11月Vol．45 No．11 November 2017編 輯主 編主 管主 辦出 版印刷裝訂訂 購國內總發行國外發行《分析化學》編委會地址：長春市人民大街5625號郵政編碼：130022電話：0431-85262017http：//www．analchem．cnE?mail：fxhx@ciac．ac．cn楊秀榮中國科學院中國化學會中國科學院長春應用化學研究所地址：北京東黃城根北街16號 郵政編碼：100717吉林省保隆冠彩印刷有限公司國內：全國各地郵政局吉林省報刊發行局中國國際圖書貿易總公司地址：北京399信箱 郵政編碼 100044EditedbyEditor?in?ChiefSuperintendedbySponsoredbyPublishedbyPrintedbySubscriptionsForeignEditorialBoardofChineseJournalofAnalyticalChemistryAdd:5625RenminStreet,Changchun130022,ChinaTel:0431?85262017http://www.analchem.cnE?mail:fxhx@ciac.ac.cnYANGXiu?RongChineseAcademyofSciencesChineseChemicalSocietyChangchunInstituteofAppliedChemistry,ChineseAcademyofSciencesSciencePressAdd:16DonghuangchenggenNorthStreet,Beijing100717,ChinaJilinBaolongguancaiPrintingCo.,Ltd.LocalPostOfficesChinaInternationalBookTradingCorporationAdd:P.O.Box399,Beijing100044,China

國內統一刊號: CN 22-1125/O6國內郵發代號: 12-6國外發行: M336

定價: 45.00元

廣告經營許可證號 2200004000094 廣告代理: 北京行勝言廣告有限公司 電話: 010-51289220 傳真: 010-82781370

國內外公開發行

DevelopmentofNano-PolymeraseChainReaction
andItsApplication

SANG Fu-Ming*, LI Xin, LIU Jia
(SchoolofMarineScienceandTechnology,HarbinInstituteofTechnology(Weihai),Weihai264209,China)

Polymerase chain reaction (PCR) has become one of the powerful technique since its invention in 1980s. Nevertheless, PCR technique is still frequently impaired by its low specificity, poor sensitivity, false positive results, etc. Recently, nanomaterials including metal nanoparticles, carbon nanomaterials, quantum dots and nano metal oxide have been added into PCR solution to improve both quality and productivity of PCR. The nanoparticles assisted PCR (NanoPCR) has

considerable attentions due to its unprecedented sensitivity, selectivity and efficiency. In this view, the mainly used nanoparticles in NanoPCR, including gold nanoparticles, quantum dots, carbon nanomaterials, graphene and metallic oxide, was firstly summarized. And then, the possible mechanisms for highly improved sensitivity and selectivity were discussed. Finally, recent applications of NanoPCR were described.

NanoPCR; Nanomaterials; Specificity; Amplification efficiency; Hot-start；Review

17 February 2017; accepted 4 September 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.170097