超高效液相色譜-質譜聯用檢測土壤中兩種抗生素呋喃唑酮和氟苯尼考

南 瓊 唐景春*,2,3 何若竹 胡羽成 吳 濤

1(南開大學環境科學與工程學院，天津 300071)2(環境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津 300071)3(天津市城市環境污染診斷與修復技術工程中心，天津 300071) 4(天津市水利科學研究院，天津 300061)

超高效液相色譜-質譜聯用檢測土壤中兩種抗生素呋喃唑酮和氟苯尼考

南 瓊1唐景春*1,2,3何若竹1胡羽成4吳 濤4

1(南開大學環境科學與工程學院，天津 300071)2(環境污染過程與基準教育部重點實驗室，天津 300071)3(天津市城市環境污染診斷與修復技術工程中心，天津 300071)4(天津市水利科學研究院，天津 300061)

建立了超高效液相色譜-串聯質譜(UPLC/MS/MS)檢測土壤中多種環境基質下呋喃唑酮和氟苯尼考的方法。提取液采用磷酸鹽緩沖溶液(pH=3)-乙腈(3∶7，V/V)，經過SPE固相萃取小柱SAX-HLB串聯富集，使用Waters BEH C18色譜柱(2.1×100 mm)進行分離，UPLC/MS/MS在多反應監測模式下進行定性與定量分析。以3倍信噪比確定方法檢出限，以10倍信噪比確定方法定量限。結果表明，本方法在5 min內即可分離兩種物質，呋喃唑酮和氟苯尼考的檢出限分別為1.19和0.41 μg/kg; 定量限分別為3.40和1.37 μg/kg。50 μg/L加標水平的呋喃唑酮和氟苯尼考的回收率分別為92%和79%; 200 μg/L加標水平下呋喃唑酮與氟苯尼考的回收率分別為96%和86%。

超高效液相色譜-串聯質譜; 呋喃唑酮; 氟苯尼考; 固相萃取

2016-11-28收稿; 2017-09-04接受

本文系水體污染控制與治理科技重大專項(No. 2015ZX07203-011-06)、天津市水務局局科研項目(No. KY2015-01)和863成果轉化項目(No. 14RCHZSF00144)資助

* E-mail: tangjch@nankai.edu.cn

1 引 言

肉類、牛奶、蜂蜜和其它動物源性食物的抗生素殘留對人類健康以及環境均存在不可忽視的風險。其中硝基呋喃類抗生素是常有的抗生素，由于其對人具有一定的毒副作用，許多國家已經禁止硝基呋喃類抗生素在農業生產中使用[1]。氯霉素(CAP)對人類具有潛在的致死作用，并且可以使人類容易患上諸如白血病、再生障礙性貧血和灰色嬰兒綜合征等疾病[2～4]。歐盟規定CAP在食品中的最高殘留限量(MRPL)值為0.3 μg/kg[5]。硝基呋喃類抗生素的抗菌活性主要來源于5位碳上的硝基基團，其被廣泛應用于奶牛的乳腺炎以及家禽家畜的雞瘟、球蟲病、豬腸炎的治療[6～8]。1990年，日本首次將氟苯尼考用于漁業養殖中，韓國、美國以及歐洲的一些國家隨后也開始使用氟苯尼考治療魚類疾病，1999年我國批準使用氟苯尼考[9～11]。由于呋喃唑酮(FZD)和氟苯尼考抗菌效果好，經常作為飼料直接喂養家禽以及魚蝦[12]，使用量日益增大，導致其環境殘留也愈來愈多，造成抗生素污染。

目前，呋喃唑酮與氟苯尼考的檢測方法主要有比色法、薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法等。Kaniou等[13]使用高效液相色譜-紫外-可見光二極管陣列方法檢測了雞蛋中的硝基呋喃類抗生素; Wilhelmus等[14]借助紫外可見光二級陣列管檢測技術檢測了卵中呋喃唑酮的含量，回收率為86%; Fernando等[15]使用高效液相色譜-二極管陣列檢測器檢測了組織結合的硝基呋喃類代謝物。然而，由于呋喃唑酮母體的復雜性、不穩定性以及其代謝產物的存在，使得高效液相色譜法檢測呋喃唑酮的效果不佳，并且呋喃唑酮在動物體內代謝快，不穩定，難以長時間存留[14]，所以檢測呋喃唑酮主要是通過檢測呋喃唑酮的代謝物，但尚未見超高效液相色譜-串聯質譜聯用技術(UPLC-MS/MS)檢測呋喃唑酮的方法。Cornejo等[16]使用液相色譜-串聯級質譜聯用方法檢測了肉雞羽毛中氟苯尼考含量; Ryan等[7]建立了液相色譜-質譜聯用檢測土壤中氟苯尼考的方法，回收率在60.2%120.3%之間; Lee等[17]開發了一種通過UPLC-MS/MS測定羅非魚片中氟苯尼考殘留及其代謝物氟苯尼考胺的方法; Orlando等[18]使用液相色譜-加熱電噴霧離子化(HESI)和大氣壓化學電離(APCI)串聯質譜對白尾鹿組織中氟苯尼考進行了定性和定量分析。謝愷舟等[19]使用高效液相色譜熒光檢測法檢測了雞肉中的氟苯尼考，分離時間為18 min; 郭霞等[20]使用高效液相色譜法檢測了魚肉中的氟苯尼考，分離時間為22 min。目前使用UPLC-MS/MS檢測土壤中的呋喃唑酮與氟苯尼考的方法鮮有報道。與HPLC相比，UPLC分析速度更快，分離能力更好，能夠同時分離檢測多種有機物質。本研究采用UPLC結合串聯質譜技術檢測土壤中的呋喃唑酮與氟苯尼考，不受復雜基質干擾，5 min內即可完全分離兩種目標物，對土壤中的抗生素的檢測有更廣闊的應用前景。

2 材料與方法

2.1儀器與試劑

TYXH-I渦旋儀(中國上海豫明儀器有限公司); ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1×100 mm, 1.7 μm)、Xevo TQS超高效液相色譜質譜質譜聯用儀(美國Waters公司);Lab-1A-50E冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司); 3H16RI高速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司); SBEQ-CR1027固相萃取真空裝置、DC12氮氣濃縮儀、HLB固相萃取柱、SAX固相萃取柱(中國上海安普科技有限公司);XPE電子分析天平(梅特勒托利多儀器有限公司);PB-10精密pH計(賽多利斯科學儀器有限公司)。

氟苯尼考標準品(純度99%)、呋喃唑酮標準品(純度99%)購自Dr.Ehrenstorfer公司; 甲醇、乙腈(99.99%，HPLC級，上海安普科技有限公司); 其它試劑均為國產分析純。實驗用水為蒸餾水。

2.2實驗方法

2.2.1標準儲備液與工作液的配制標準儲備液：稱量0.01 g的氟苯尼考和呋喃唑酮，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶，配制成1000 mg/L 標準儲備液，20℃下保存。

標準工作液：取10 μL 1000 mg/L的氟苯尼考、呋喃唑酮標準儲備液，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶，配制成1000 μg/L的標準工作液。

配制0.1、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、100.0和200.0 μg/L系列氟苯尼考和呋喃唑酮混合標準溶液，用于繪制標準曲線。

磷酸鹽緩沖溶液(pH=3.0， 4.6 g/L Na+)-乙腈(3∶7，V/V)(簡稱A液); EDTA-McIlvaine緩沖溶液(pH=4.0，檸檬素緩沖溶液-0.1 mol/L四乙酸二乙胺二鈉，1∶1，V/V)-甲醇(1∶1，V/V)配制成EDTA-McIlvaine提取液(簡稱B液); 0.5 mol/L草酸-乙腈(1∶1，V/V，簡稱C液); 甲醇-檸檬酸緩沖溶液(pH=4.0)-EDTA溶液(3∶2∶1，V/V，pH 5．0，簡稱D液)。

2.2.2提取方法空白土壤樣品經過冷凍干燥，研磨，過40目篩，備用。稱取1 g備用空白土壤樣品，添加氟苯尼考和呋喃唑酮標準工作儲備液，使土壤中抗生素含量為50 μg/kg。稱取經抗生素處理過的土壤1 g，加入0.2 g乙二胺四乙酸二鈉， 10 mL A提取液，渦旋混合1 min，超聲10 min， 8000 r/min離心15 min，上清液轉移至另一個離心管中。再提取兩次，合并上清液，用蒸餾水稀釋至400 mL。串聯SAX小柱與HLB小柱，先后用6 mL甲醇、6 mL蒸餾水活化、淋洗。400 mL提取稀釋液經固相萃取小柱萃取，萃取完畢后用蒸餾水清洗固相萃取小柱，真空干燥30 min，棄去SAX小柱，僅留下富集有抗生素的HLB小柱。用甲醇洗脫HLB小柱，高純氮氣吹至盡干，用甲醇定容至1 mL，供UPLC-MS/MS檢測。

2.3色譜分析條件

Waters BEH C18色譜柱，柱溫50℃，流動相為0.5%甲酸(A)與乙腈(B)。流速0.4 mL/min，進樣量10 μL，采用多反應監測模式，串聯質譜檢測。梯度洗脫程序: 0～1.5 min, 10% B; 1.5～2.0 min, 16% B; 2.0～2.5 min, 18% B; 2.5～3.0 min, 20% B; 3.0～4.0 min, 22% B; 4.0～5.5 min, 35% B; 4.5～6.5 min, 60% B; 6.5～7.0 min, 95% B; 7.0～10.0 min, 10% B，質譜條件見表1。

表1 質譜工作參數

Table 1 Mass spectrometric conditions for qualitative and quantitative analyses

抗生素Antibiotics離子化方式Ionizationmethod離子對Ionpair(m/z)錐孔電壓Conevoltage(V)碰撞電壓Fragmentorvoltage(V)呋喃唑酮Furazolidone(FZD)正離子模式Positiveionmode226．07/67．08/122．064620/22氟苯尼考Florfenicol(FFC)負離子模式Negativeionmode356．03/185．05/336．00188/8

圖1 不同提取液對呋喃唑酮和氟苯尼考的回收率A: 磷酸緩沖液/乙腈; B: EDTA-McIlvaine; C: 草酸/乙腈; D: 甲醇/檸檬酸緩沖溶液/EDTA溶液Fig.1 Recovery of furazolidone (FZD) and florfenicol (FFC) using different extraction solutionsA: Phosphate buffer-acetonitrile; B: EDTA-McIlvaine; C: oxalic acid-acetonitrile; D: methanol-citric acid buffer-EDTA.

3 結果與討論

3.1提取液的選擇

[21～23]方法，對比磷酸鹽緩沖液-乙腈、EDTA-McIlvaine、草酸-乙腈、甲醇-檸檬酸緩沖溶液-EDTA溶液4種提取液， 分別簡稱為A、B、C、D提取液。采用經檢測不含有抗生素的土壤，制備成呋喃唑酮和氟苯尼考的濃度為50 μg/kg的土壤加標樣品，采用4種提取液提取，A提取液對呋喃唑酮的氟苯尼考的提取效率最高，回收率分別達到96%和93%; B、 C、 D 3種提取液對呋喃唑酮的提取率較高， 回收率在74%～91%之間，但是對氟苯尼考的回收率僅為47%～54%(圖1)。綜合考慮，選擇A提取液對呋喃唑酮和氟苯尼考進行提取效果更好。李曉晶等[24]研究土壤中磺胺類提取效果時，也發現乙腈的提取效果優于甲醇; Pfenning等[21]認為這與乙腈良好的溶劑性能有關，也可能與提取液的pH值有關; 馬麗麗等[25]研究表明，2%甲酸-乙腈溶液并不能有效提取氟喹諾酮類抗生素，50%乙腈-磷酸鹽緩沖溶液對氟喹諾酮類抗生素回收率高于80%，這可能與氟喹諾酮類抗生素的pKa有關，在酸性條件下，氟喹諾酮類抗生素更加穩定。

3.2pH值對抗生素提取效果的影響

在不同的pH值條件下，抗生素的穩定性與存在形態不同。李曉晶等[24]在pH=3的酸性條件下提取四環素類抗生素; 而磺胺類抗生素在pH=5酸性條件下提取[26]。考察了提取呋喃唑酮和氟苯尼考的最優pH條件， 每個樣品設置3個平行樣，提取液采用A液，使用0.1 mol/L NaOH調節pH值。由圖2可見，隨著pH值升高，回收率呈下降趨勢，在pH=3.0時，呋喃唑酮的回收率為94%～97%，氟苯尼考的回收率為90%～93%。酸堿環境會影響抗生素的離子形態及穩定性，在堿性條件下,大部分抗生素容易堿性水解，而某些抗生素如紅霉素在酸性條件下易酸解。呋喃唑酮與氟苯尼考為酸性化合物[14,15]，在酸性條件下更加穩定，在中性或者偏堿性條件下易水解，造成損失。

3.3HLB洗脫液體積對抗生素提取效果的影響

在確定最佳提取液和pH值后，進一步探究洗脫液體積對抗生素提取效果的影響。洗脫液為甲醇，考察甲醇體積為3、5、8和10 mL時的洗脫效果。結果如圖3所示，隨著甲醇洗脫液體積的增加，抗生素的回收率增加。相比之下，呋喃唑酮的提取效果更好，提取液體積為8與10 mL時，呋喃唑酮和氟苯尼考的提取回收率差異較小，因此確定洗脫液最佳體積為8 mL。

圖2 不同pH條件下FZD和FFC回收率Fig.2 Recovery of FZD and FFC under different pH values

圖3 HLB洗脫液體積對FZD和FFC回收率的影響Fig.3 Recovery of FZD and FFC with different volume of eluent

3.4線性范圍及檢出限

用甲醇將標準儲液稀釋成1000、500、250、100、50、25、10、5、1.0、0.5和0.1 μg/L目標物的混合標準系列濃度，根據每個濃度下的峰面積進行線性回歸，根據3倍信噪比確定檢出限，10倍信噪比確定定量限。表2為FZD和FFC的線性回歸方程、相關系數、檢出限與定量限。

表2 方法的線性范圍、相關系數、檢出限、定量限

Table 2 Regression equation, correlation coefficient, LOD and LOQ of the proposed method

抗生素Antibiotics回歸方程Regressionequation線性范圍Linearityrange(μg/kg)相關系數Correlationcoefficient(R2)檢出限LOD(μg/kg)定量限LOQ(μg/kg)FZDy=2210．7x+559．70．1～10000．99971．193．40FFCy=180．1x-170．80．1～10000．99970．411．37

在優化的實驗條件下，呋喃唑酮和氟苯尼考被很好地分離檢測，圖4為呋喃唑酮、氟苯尼考的二級質譜圖，圖5為分離色譜圖?？梢姡?本方法能夠很好地分離復雜基質中多組分物質。

圖4 呋喃唑酮(A)和氟苯尼考(B)的二級質譜圖Fig.4 Mass spectra (MS2) of (A) FZD and (B) FFC

3.5方法回收率

采用2.2.2實驗方法檢測加標水平為50和200 μg/kg呋喃唑酮和氟苯尼考的土壤樣品，每個樣品平行測定3次，兩個加標濃度下的呋喃唑酮與氟苯尼考的回收率見表3。

圖5 呋喃唑酮與氟苯尼考分離色譜圖Fig.5 Separation chromatogram of FZD and FFC

表3 FZD, FFC的回收率

Table 3 Recovery (n=3) of FZD and FFC

抗生素Antibiotics加標量Added50μg/L回收率Recovery(%，n=3)RSD(%)200μg/L回收率Recovery(%，n=3)RSD(%)FZD9210．39612．3FFC795．68615．1

3.6實際樣品分析

對華北地區某水庫底泥的37個采樣點進行呋喃唑酮和氟苯尼考含量檢測，呋喃唑酮含量在5.0～330.2 μg/kg， 平均值為73.2 μg/kg。氟苯尼考含量在0～4.5 μg/kg范圍內，平均值為0.7 μg/kg。其中呋喃唑酮檢出率為100%，污染比較嚴重; 氟苯尼考檢出率73%，但檢出量均較低，多在0.5 μg/kg左右，表明此地區氟苯尼考污染風險較小。

4 結 論

建立了一種UPLC/MS/MS檢測底泥中呋喃唑酮和氟苯尼考的方法，采用磷酸鹽緩沖液-乙腈(3∶7，V/V)提取，在酸性條件(pH=3)下,呋喃唑酮和氟苯尼考的提取效果更好，洗脫液為8 mL甲醇，本方法前處理步驟簡單，檢測速度快，回收率高。本研究為UPLC-MS/MS方法檢測各種復雜基質中抗生素殘留以及有機物質的分析檢測提供了參考。

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DeterminationofFurazolidoneandFlorfenicolinSoilbyUltraPerformanceLiquidChromatography-TandemMassSpectrometry

NAN Qiong1, TANG Jing-Chun*1,2,3, HE Ruo-Zhu1, HU Yu-Cheng4, WU Tao4
1(CollegeofEnvironmentalScienceandEngineering,NankaiUniversity,Tianjin300071,China)2(KeyLaboratoryofPollutionProcessesandEnvironmentalCriteria,MinistryofEducation,Tianjin300071,China)3(TianjinEngineeringCenterofEnvironmentalDiagnosisandContaminationRemediation,Tianjin300071,China)4(TianjinHydranlicResearchInsitute,Tianjin300061,China)

A detection method for furazolidone and florfenicol in soil with various environmental matrices was established using ultra performance liquid chromatography-tandem spectrometry (UPLC/MS/MS) technique. Extracting solution of a mixture of phosphate buffer (pH=3) and acetonitrile (3∶7,V/V) was used in this experiment. The extracted water samples were enriched by SAX-HLB solid phase extraction column before the process of nitrogen blowing (high purity nitrogen). The enriched antibiotics were desalted with 8 mL of methanol. Waters BEH C18(2.1 × 100 mm) column was used for the sample separation. UPLC/MS/MS was carried out for qualitative and quantitative analysis under multi-reaction monitoring mode. The detection limit of the method was determined by 3 times of signal-to-noise ratio, and the limit of determination of the method was determined by 10 times of signal-to-noise ratio. The results showed that the detection limits of furazolidone and florfenicol were 1.19 and 0.41 μg/kg, respectively, and the limits of quantitation of furazolidone and florfenicol were 3.40 and 1.37 μg/kg, respectively. Besides, recovery experiment showed that, for the soil samples spiked with 50 μg/L furazolidone and florfenicol, the recoveries were 79% for florfenicol and 92% for furazolidone. Similarly, for the soil samples spiked with 200 μg/L furazolidone and florfenicol, the recoveries were 96% for furazolidone and 86% for florfenicol.

Ultra performance liquid chromatography-tandem spectrometry; Furazolidone; Florfenicol; Solid phase extraction

28 November 2016; accepted 4 September 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.160870