基于GEO數(shù)據(jù)庫的EGFR或KRAS突變型非小細胞肺癌耐藥基因表達譜分析

吳 峰 朱圣明 胡承浩 邱 力 王 科

基于GEO數(shù)據(jù)庫的EGFR或KRAS突變型非小細胞肺癌耐藥基因表達譜分析

吳 峰 朱圣明 胡承浩 邱 力 王 科

目的通過對相關數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析，探究NSCLC中EGFR和KRAS突變與耐藥基因表達的關系，以及對患者生存和預后的影響。方法對NCBI中GEO數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)進行表達量分析、生存分析和相關性分析。結(jié)果①研究分析表明，ABCC1、GSTP1、MGMT1和RRM1基因在NSCLC組織中存在明顯的高表達(P<0.0001；P<0.0001；P=0.0014；P<0.0001)；而ERCC1和TUBB3基因表達差異沒有統(tǒng)計學意義(P=0.3922；P=0.4583)。②在KM組中，TUBB3、ABCC1和XPA基因存在明顯的高表達(P=0.0169；P=0.033；P=0.0165)，而在EM組中只有ABCC1存在明顯的高表達(P=0.0002)。③在KM組中ABCC1和XPA的表達情況呈正相關(P=0.025，γ=0.4992)；而它們與TUBB3的表達情況呈負相關(P=0.0075，γ=-0.5789；P=0.0012，γ=-0.6696)。④ABCC1和TUBB3的高表達會導致肺癌患者的總生存率和無復發(fā)生存率明顯降低。結(jié)論在NSCLC中EGFR或KRAS基因的突變會導致部分相關耐藥基因的差異表達，這些差異表達的基因之間存在相關性，而且對患者的生存及預后又具有重要影響。

非小細胞肺癌；EGFR；KRAS；耐藥基因

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1411～1415)

非小細胞肺癌(NSCLC)40%～80%存在表皮生長因子受體(EGFR)的過度表達和突變。針對該靶點的藥物主要為EGFR酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)[1]。盡管EGFR突變的NSCLC患者大多會對其首次治療有響應，但在此后腫瘤又會有不同程度的復發(fā)，甚至出現(xiàn)耐藥[2-3]。KRAS也是NSCLC的驅(qū)動突變，其結(jié)果是信號通路的持續(xù)激活，KRAS的突變與抗EGFR抗體藥物的治療效果也有密切關系[4]。

本研究旨在通過相關NSCLC的耐藥基因的表達研究及相關樣本的預后情況，了解EGFR和KRAS突變與NSCLC耐藥性的相關性，以期為臨床EGFR和KRAS突變的NSCLC患者的用藥和治療提供一個可靠的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究所用到的材料均來自于NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫，具體信息見表1。

表1 GES31210數(shù)據(jù)集樣本分組統(tǒng)計表

1.2 分析方法

1.2.1 表達量分析 基于數(shù)據(jù)庫特定研究樣本數(shù)據(jù)集中特定目標基因的表達量的相對值進行表達量的分析，所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換和中位數(shù)中心化處理。根據(jù)表達量處理后數(shù)據(jù)進行聚類和差異分析。文中熱圖由HemI軟件制作，比較差異分析圖由GraphPad Prism 5軟件制作(P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義)。

1.2.2 生存分析 基于數(shù)據(jù)庫特定研究樣本數(shù)據(jù)集中特定目標基因的表達量的相對值及對應樣本的總生存(OS)和無復發(fā)生存(RFS)信息進行生存分析，所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換和中位數(shù)中心化處理，并采用Kaplan-Meier分析方法進行分析。

1.2.3 相關性分析 基于數(shù)據(jù)庫特定研究樣本數(shù)據(jù)集中特定目標基因的表達量的相對值進行相關性分析，所有數(shù)據(jù)都經(jīng)過對數(shù)轉(zhuǎn)換和中位數(shù)中心化處理(P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，γ<0表示負相關，γ>0表示正相關)。

2 結(jié)果

2.1 相關耐藥基因在NSCLC患者中的表達分析

為了評估NSCLC耐藥性與EGFR和KRAS基因突變的關系，我們選取了7個已有報道過的NSCLC相關的耐藥基因，分別為切除修復交叉互補基因1(excision repair cross complement-1,ERCC1)、核糖核苷還原酶亞單位1 (ribonucleotide reductase M1,RRM1)、細胞骨架微管蛋白Ⅲ(classⅢ-tubulin,TUBB3)、多藥耐藥相關蛋白基因1(multidrug resistence-associated protein,MRP1或ABCC1)、谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶1(glutathione-S-transferase P1,GSTP1)，O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(O6-methy lguanine-DNA methyltransferase,MGMT)和DNA修復基因(DNA damage recognition and repair factor,XPA)。據(jù)以往的相關研究表明，這些基因在NSCLC的耐藥性調(diào)控方面都起著非常重要的作用。據(jù)此，我們對GSE31210數(shù)據(jù)集中的不同分組的NSCLC樣本和正常樣本的這些基因的表達進行了表達譜的聚類分析，結(jié)果表明，不同的耐藥相關基因在不同分組間的表達存在差異，如RRM1和GSTP1基因在NSCLC組織中存在明顯的高表達，這也與以往的類似研究結(jié)果相一致。這些表明，耐藥基因的表達在不同突變類型NSCLC分組間存在差異，可能與NSCLC的耐藥性及EGFR和KRAS基因的突變有關。

2.2 正常對照組與NSCLC組間耐藥基因的表達差異比較

通過上述表達譜顯示，耐藥基因在不同分組間的表達量確實存在差異。所以，為了進一步具體探究這些表達差異，我們在不同分組間進行了具體的比較和統(tǒng)計學分析。結(jié)果表明，與正常肺組織相比，ABCC1、GSTP1、MGMT1和RRM1基因在NSCLC組織中存在明顯的高表達(ABCC1，P<0.0001；GSTP1，P<0.0001；MGMT1，P=0.0014；RRM1，P<0.0001)；而ERCC1和TUBB3基因在正常組織和NSCLC組織間的表達差異沒有統(tǒng)計學意義(ERCC1，P=0.3922；TUBB3，P=0.4583)，甚至XPA基因在正常組織中存在一定程度的高表達(XPA，P=0.0004)(圖1)。

2.3 不同基因突變組間耐藥基因的表達差異比較

為了進一步明確耐藥相關基因的表達與EGFR和KRAS基因突變間的聯(lián)系，我們又對EGFR基因突變組(EM)、KRAS基因突變組(KM)和無突變NSCLC組(LC)間的耐藥基因的表達差異進行了比較。結(jié)果顯示，不同分組間耐藥基因的表達存在明顯的差異，尤其是在KM組中，與LC組相比，TUBB3、ABCC1和XPA基因存在明顯的高表達(TUBB3，P=0.0169；ABCC1，P=0.033； XPA，P=0.0165)，而在EM組中只有ABCC1存在明顯的高表達(ABCC1，P=0.0002)，TUBB3反而呈現(xiàn)出明顯的低表達現(xiàn)象(TUBB3，P=0.0003)(表2和圖2)。這些結(jié)果表明，相關耐藥基因的表達與NSCLC中EGFR或KRAS基因的突變存在著一定的聯(lián)系，而且通過這一比較分析可以看到不同的耐藥基因在不同的突變組中表達不同，各耐藥相關基因也不會同時處于同樣的表達趨勢，也許它們之間還存在功能互補的關系。

圖1 正常組與NSCLC組間耐藥相關基因的表達差異比較分析

耐藥相關基因LCvsKMLCvsEMKMvsEMERCC10.71240.03480.3372RRM10.50300.11250.0436TUBB30.01690.00030.0009GSTP10.17030.43340.2678ABCC10.03300.00020.3490MGMT0.22210.25480.1013XPA0.01650.82170.0074

2.4 耐藥基因表達間的相關性分析

鑒于上述的研究結(jié)果，為了進一步探明不同差異表達的耐藥相關基因之間的關系，我們選取KM組中明顯高表達的3個基因TUBB3、ABCC1和XPA，并對其進行了相關性分析。結(jié)果顯示，在KM組中ABCC1和XPA的表達情況呈正相關(P=0.025，γ=0.4992)；而它們與TUBB3的表達情況呈負相關(P=0.0075，γ=-0.5789；P=0.0012，γ=-0.6696)(圖3)。這就說明，在KM組中，ABCC1和XPA可能存在協(xié)同高表達的情況，而它們與TUBB3之間則可能是一種耐藥功能上的互補關系。因此即便是在同樣高表達的KM組中，各耐藥基因的高表達情況并不完全同步，且可能存在互補的現(xiàn)象。

圖2 不同基因突變組間耐藥相關基因的表達差異比較分析

圖3 KRAS突變組中相關耐藥基因表達相關性分析

2.5 耐藥基因異常表達對NSCLC患者生存及預后的影響

通過我們對部分高表達耐藥相關基因的相關性分析，我們在一定程度上揭示了其在表達上的協(xié)同或互補的規(guī)律。基于此，我們進一步對ABCC1和TUBB3基因表達對患者生存和預后的影響進行了分析。結(jié)果表明，在EGFR突變的NSCLC患者中，ABCC1的高表達會導致肺癌患者的總生存率明顯降低(P=0.0186)，并且它的高表達也同樣會導致肺癌患者的無復發(fā)生存率明顯降低(P=0.0331)；與此類似，TUBB3的高表達也會導致肺癌患者的總生存率明顯降低(P=0.0018)，并且它的高表達也同樣會導致肺癌患者的無復發(fā)生存率明顯降低(P=0.0071)。見圖4。

圖4 ABCC1和TUBB3高表達對NSCLC患者的生存分析

3 討論

基于NSCLC患者多存在EGFR的過表達或突變，目前所采用EGFR-TKIs靶向治療NSCLC患者仍然屬于較為有效的治療手段，可以使患者免受傳統(tǒng)化療手段所帶來的痛苦[5]。但在初期對EGFR-TKIs敏感性階段的治療后，耐藥性問題的出現(xiàn)困擾了NSCLC患者的繼續(xù)治療[6]。有研究者發(fā)現(xiàn)，KRAS基因的突變可能與NSCLC耐藥性相關，而且隨著分子生物學的發(fā)展，與耐藥性有關的一些基因也不斷被發(fā)現(xiàn)，正如本研究中所分析那些耐藥相關基因，它們在DNA修復、細胞增殖和細胞運動等方面發(fā)揮著不同的功能[7-8]。由于研究發(fā)現(xiàn)的眾多基因、蛋白和信號通路等均參與同一種或者多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，所以盡可能地闡明這些耐藥基因與EGFR或KRAS基因突變的相關性及其對患者生存和預后的影響將有利于尋找解決EGFR-TKIs耐藥性問題以及靶向治療NSCLC患者的分子靶點和治療策略，通過這樣阻斷治療過程中出現(xiàn)的耐藥現(xiàn)象，提高靶向藥物治療NSCLC患者的療效。鑒于此，本研究基于數(shù)據(jù)庫，對EGFR和KRAS基因突變的NSCLC樣本中相關耐藥基因進行了分析。

我們的研究分析表明，ABCC1、GSTP1、MGMT1和RRM1基因在NSCLC組織中存在明顯的高表達；而ERCC1和TUBB3基因在正常組織和NSCLC組織間的表達差異沒有統(tǒng)計學意義，且XPA基因反而在正常組織中存在一定程度的高表達。這一表達情況的分析證明了耐藥基因異常表達的情況存在于NSCLC病例中，且有可能與疾病的某些進程相關。與此同時，部分耐藥相關基因在此之間存在差異表達，尤其是在KM組中，TUBB3、ABCC1和XPA基因存在明顯的高表達，而在EM組中只有ABCC1存在明顯的高表達，TUBB3反而呈現(xiàn)出明顯的低表達現(xiàn)象。由此，相關耐藥基因的表達與NSCLC中EGFR或KRAS基因的突變存在著一定的聯(lián)系，而且通過這一比較分析可以看到不同的耐藥基因在不同的突變組中表達不同。針對于此，進一步的研究結(jié)果顯示，在KM組中ABCC1和XPA的表達情況呈正相關；而它們與TUBB3的表達情況呈負相關。這一結(jié)果就說明了在KM組中，ABCC1和XPA可能存在協(xié)同高表達的情況，而它們與TUBB3之間則可能是一種耐藥功能上的互補關系。最終，我們對本研究分析篩選出的耐藥基因ABCC1和TUBB3進行了生存分析，在EGFR突變的NSCLC患者中，ABCC1、TUBB3的高表達會導致肺癌患者的總生存率明顯降低，并且它們的高表達也同樣會導致肺癌患者的無復發(fā)生存率明顯降低。

通過本研究對相關數(shù)據(jù)庫中NSCLC樣本數(shù)據(jù)的分析和歸納，發(fā)現(xiàn)在NSCLC中EGFR或KRAS基因的突變會導致部分相關耐藥基因的差異表達，尤其是高表達，這就與某些NSCLC病例的耐藥性相關聯(lián)了。此外，這些耐藥基因的表達還存在協(xié)同或互補的關系，通過這樣的表達關系可以更大化地維持腫瘤的增殖和存活等功能，以進一步增強腫瘤的耐藥性。鑒于此，在今后的研究和臨床治療中，可以以這些差異表達的耐藥基因作為針對的依據(jù)及靶向治療的靶點。

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(編輯：甘艷)

AnalysisofResistantGenesExpressionProfilinginEGFRorKRASMutantNon-smallCellLungCancer(NSCLC)BasedonGEODatabase

WUFeng,ZHUShengming,HUChenghao,etal.

TaiheHospital,Taihe,442000

ObjectiveTo explore the relationship between EGFR or KRAS mutant NSCLC and resistance genes and the impact on the survival and prognosis of NSCLC patients,based on relevant database data analysis.MethodsBased on data sets of GEO in the NCBI database,to perform express analysis,survival analysis and correlation analysis.Results①Analysis showed thatERCC1,GSTP1,MGMT1 and RRM1 genes significantly higher expression in NSCLC(P<0.0001;P<0.0001;P=0.0014;P<0.0001);and the expression of ERCC1 and TUBB3 had no statistically significance(P=0.3922;P=0.4583).②In the KM group,the expression of TUBB3,ABCC1 and XPA genes were significantly higher(P=0.0169;P=0.033;P=0.0165),but in the EM group only ABCC1 significant higher expression(P=0.0002).③In the KM group,the expression of ABCC1 and XPA were positively correlated(P=0.025,γ=0.4992);and they were negatively correlated with TUBB3(P=0.0075,γ=-0.5789;P=0.0012,γ=-0.6696).④High expression of ABCC1 and TUBB3 will lead to overall survival and relapse-free survival of patients with lung cancer were significantly reduced.ConclusionThe mutations of EGFR or KRAS gene in NSCLC could lead to differences in part related resistance gene expression,in which the genes expression are correlated,but also has a significant impact on the survival and prognosis of patients.

NSCLC；EGFR；KRAS；Resistant genes

442000 湖北省十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學院附屬醫(yī)院)

王 科

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.005

R734.2

A

1001-5930(2017)09-1411-05

2016-10-24

2017-04-10)