肺腺癌EGFR、KRAS基因突變、ALK融合蛋白狀態分析

董丹丹 徐 鋼 李芳華 李 科 胥 穎

·基礎研究·

肺腺癌EGFR、KRAS基因突變、ALK融合蛋白狀態分析

董丹丹 徐 鋼 李芳華 李 科 胥 穎

目的分析肺腺癌中EGFR、KRAS、ALK三種腫瘤驅動基因的突變狀態及與其臨床病理特征、腫瘤分期的關系。方法85例肺腺癌EGFR,KRAS基因突變采用ARMS法檢測，ALK融合蛋白用特異性抗ALK單克隆抗體(克隆號：D5F3)采取免疫組織化學法檢測。結果EGFR,KRAS,和ALK融合蛋白檢測陽性率分別是62%,15%,和14%。EGFR基因突變更常見于女性。KRAS基因突變更常見于男性及有吸煙史患者。ALK融合蛋白更常見于年輕及腫瘤分期Ⅲ/Ⅳ患者。檢測中發現了8例雙突變病例。結論結果進一步證實了EGFR、KRAS基因突變與ALK融合蛋白并非完全互斥。對于肺腺癌患者進行全面的基因檢測非常重要，在選擇靶向治療時更應考慮到多種變異同時存在的情況。

肺腺癌；EGFR；KRAS；ALK

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1393～1397)

肺癌是全世界腫瘤致死的主要原因[1]，中國每年大約有超過140萬人死于肺癌[2]。傳統的手術摘除聯合放療、化療并未使肺癌的生存率有顯著的提高[3]，隨著腫瘤治療進入靶向治療時代，與肺癌發生及治療相關的基因包括EGFR基因[4]、KRAS基因[5]及ALK基因等[6]，越來越受到關注。

4%的NSCLC患者中存在間變性淋巴瘤激酶ALK重排，這種變異可導致酪氨酸激酶激活，與腫瘤細胞的生長分化密切相關[7]。

研究顯示非小細胞肺癌中存在KRAS和EGFR的雙突變[8]，但更多結果表明KRAS、EGFR突變和間變性淋巴瘤激酶(ALK)重排是互相排斥的[9]?？梢姺伟┒嗷虻膮f同表達研究結果還不是十分充分，也沒有統一的結論。

肺腺癌是肺癌中最常見的組織學亞型[10]，本研究檢測85例肺腺癌4種腫瘤驅動基因EGFR、KRAS、ALK的突變狀態，并與臨床病理特征、腫瘤分期等之間的關系進行分析，旨在進一步揭示其相互關系，全面 了解肺腺癌的相關腫瘤驅動基因之間的內在聯系，以指導臨床治療。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2014年至2016年四川省人民醫院病理科85例病理診斷為浸潤性肺腺癌樣本，所有病例均經兩位病理醫師獨立閱片并診斷，其中男性37例(44%)，女性41例(48%)；中位年齡62.5，年齡<40歲的患者2例(2%)，年齡40～49歲的患者9例(11%)，年齡49～59歲的患者22例(26%)，>60歲的患者47例(55%)；44例(52%)患者無吸煙史，24例(28%)患者目前或以往吸煙。其中外科手術標本55例，穿刺活檢標本30例。

1.2 ARMS法檢測EGFR、KRAS、BRAF基因突變

5 μm厚的石蠟包埋組織切片38張，置于1.5 ml的EP管內。采用QIAGEN公司DNA抽提試劑盒，提取樣本DNA，操作按說明書進行。DNA質量評估及濃度調整：用分光光度計(3100 pro 型，Amersham Biosciences)檢測樣本260 nm與280 nm波長吸光度值，以評價其純度及含量。每例樣本所提DNA均符合OD260/OD280在1.8～2.0，用雙蒸水調整DNA濃度至1.5～3 ng/μl。采用廈門艾德ADx-ARMSTMEGFR基因突變檢測試劑盒,檢測18～21號外顯子共21個突變位點。廈門艾德ADx-ARMSTMKRAS基因7種突變檢測試劑盒,檢測12號密碼子和13號密碼子上7種常見突變。反應體系在ABI 7500實時定量PCR儀中進行擴增及數據采集。

1.3 ARMS法結果判定

試劑盒采用8聯PCR管設計，每一個8聯PCR管檢測一個樣品，1～7號管內裝有相應EGFR基因突變檢測和內控試劑，突變探針由FAM信號指示，內控由HEX信號指示。內控作為對試劑、DNA質量及操作本身的質控，選擇人類EGFR基因相對保守區段。待測樣本的內控HEX信號升起，同時樣本反應管中若有FAM信號升起，則判定相應的EGFR基因突變為陽性。

1.4 Ventana ALK IHC檢測ALK融合蛋白

準備未染色并由FISH驗證的ALK非小細胞肺癌患者組織切片，10%中性緩沖福爾馬林液固定6～24 h，每例患者準備3張空白組織片：一張用于VENTANA ALK(D5F3) 抗體染色，一張用于兔單克隆陰性質控抗體染色，一張用于H&E染色。將ALK FISH(+)與ALK FISH(-)切片貼在同一正電荷載玻片上，烤片60度至少1 h。

1.5 Ventana ALK IHC結果判讀

任何比例的NSCLC腫瘤細胞胞質呈現棕褐色顆粒狀著色，視為ALK(D5F3)陽性。應當排除已知的非特異性染色，包括肺泡巨噬細胞中較淡的胞質著色，神經來源細胞(神經和神經節細胞)、腺上皮以及浸潤的淋巴細胞及粘液等假陽性著色。另外非小細胞肺癌中正常粘膜(包括粘蛋白)內以及壞死組織區域內也可見到背景染色，應從臨床評估中排除。NSCLC腫瘤細胞內不存在強顆粒狀胞質染色，視為ALK(D5F3)抗體染色陰性。

肺腺癌組織學分類根據世界衛生組織(WHO)2015年版肺癌分類進行。

1.6 統計分析

統計學分析采用Fisher's精確檢驗或χ2檢驗(SPSS 10.0版)。

2 結果

2.1 EGFR、KRAS、ALK突變情況

85例肺腺癌患者中，EGFR、KRAS、ALK突變情況見表1。EGFR基因突變陽性病例中，19號外顯子缺失突變最常見，共30例檢出19外顯子缺失，占EGFR突變總體的57%，占總病例數的35%；21號外顯子突變次之，共23例，占EGFR突變總體的43%，占總病例數的27%；20號外顯子(3例，占總病例數的4%)及18號外顯子(2例，占總病例數的2%)突變少見，在EGFR突變總體中的比例<5%；另外5例雙突變病例，占EGFR突變總體的9%，占總病例數的6%。KRAS基因突變陽性病例中，12號密碼子G12C突變最常見，共6例，占KRAS突變總體的46%；G12V突變次之，共3例，占KRAS突變總體的23%。

2.2 肺腺癌患者是否吸煙與基因突變的關系(表1)

由表1可見，EGFR基因是否突變與患者吸煙(12/12)和不吸煙(29/15)無明顯相關性(P=0.2001)，KRAS基因突變與患者吸煙與不吸煙存在相關性(P=0.0044)，ALK融合蛋白與患者吸煙(1/23)和不吸煙(6/38)無相關性(P=0.4177)。

2.3 性別與基因突變的關系

EGFR基因是否存在突變在女性(29/12)和男性(17/20)患者之間存在顯著性差異(P=0.0263)，見表1。KRAS基因突變在女性和男性患者之間也存在顯著性差異(P=0.0084)；ALK融合蛋白，在女性(5/36)和男性(6/31)患者之間卻不存在顯著性差異(P=0.748)，見表1。

2.4 年齡與基因突變的關系(表1)

本組實驗結果顯示，EGFR基因突變率在老年患者與年輕患者之間無顯著差異(P=0.2701)，ALK融合蛋白陽性的患者的中位年齡為60歲，ALK融合蛋白陰性患者的中位年齡為63歲，而ALK融合基因則更多常見于年輕患者(P=0.0023)。采用Fisher's 精確檢驗，KRAS基因是否突變與患者年齡無顯著相關性(P=0.3533)。

2.5 腫瘤直徑與基因突變的關系(表1)

EGFR是否存在突變與腫瘤直徑無顯著相關性(P=0.7842)。KRAS基因突變也與腫瘤直徑無顯著相關性(P=0.7223)，ALK融合蛋白同樣與腫瘤直徑無顯著相關性(P=0.5637)。

2.6 基因突變與腫瘤分期的關系(表1)

由表1可見，EGFR基因是否突變與腫瘤分期不存在顯著相關性(P=0.4413)，與腫瘤分期也不存在顯著相關性(P=0.3946)。然而ALK融合蛋白與腫瘤分期存在顯著相關性(P=0.0043)。

2.7 肺腺癌組織學類型中黏液成分與基因突變的關系(表1)

EGFR是否存在突變與肺腺癌組織學類型中是否含有黏液成分無顯著相關性(P=0.9025)，KRAS基因是否突變與組織學類型中是否含有黏液成分無顯著相關性(P=0.7261)，ALK融合蛋白與肺腺癌組織學類型中是否含有黏液成分也不存在顯著相關性(P=0.7116)。

2.8 肺腺癌組織學類型中微乳頭成分與基因突變的關系(表1)

EGFR是否突變與肺腺癌組織學類型中是否含有微乳頭成分無顯著相關性((P=0.8703)，同樣KRAS基因突變與組織學類型中是否含有微乳頭成分也顯著相關性(P=0.2696)，ALK融合蛋白與肺腺癌組織學類型中是否含有微乳頭成分不存在顯著相關性(P=0.6890)。

表1 EGFR、KRAS基因、ALK融合蛋白表達情況與肺腺癌臨床病理特征的關系/例

2.9 EGFR、KRAS、ALK融合蛋白共同變異情況(表2)

85例肺腺癌病例中共檢出8例共同變異病例，其中5例EGFR突變同時伴有ALK融合蛋白的占研究對象總體的5.88%(5/85)，占EGFR突變患者的9.43%(5/53)，占ALK融合蛋白陽性患者的41.67%(5/12)；1例KRAS突變同時伴有ALK融合蛋白陽性的患者占研究對象總體的1.18%(1/85)，占KRAS突變患者的7.69%(1/13)，占ALK融合蛋白陽性患者的8.33%(1/12)。2例EGFR突變同時伴有KRAS突變的患者占研究對象總體的2.35%(2/85)，占EGFR突變患者的3.77%(2/53)，占KRAS突變患者的15.38%(2/13)。

表2 85肺腺癌中8例EGFR、KRAS、ALK共同變異情況

3 討論

EGFR基因突變最常發生于非吸煙、女性、亞裔、腺癌患者[11]。亞裔腺癌患者中，EGFR突變率高達30%～50%[12]。本組實驗85例肺腺癌中，EGFR基因突變率為62%，稍高于文獻報道，可能與檢測方法的靈敏度不同有關。女性突變率(71%)高于男性(46%)，二者之間差異具有顯著性，與文獻報道一致。本組實驗中EGFR基因突變在吸煙患者中高達50%，提示亞裔肺腺癌有吸煙史的患者中，EGFR基因突變頻率可能比先前報道的高。EGFR基因突變檢測應該在亞裔肺腺癌患者中更廣泛的開展。

本實驗肺腺癌KRAS基因突變率為15%，吸煙患者突變率明顯高于非吸煙患者(33% vs 6%，P<0.05)，KRAS基因12號密碼子發生的 G>T 易位導致Gly12Cys突變占50%，與Dogan等[13]的研究結果一致，說明KRAS基因狀態的改變可能與煙草中的致癌物質有關。本組實驗中男性KRAS基因突變(30%)明顯高于女性(5%)，可能是男性吸煙人數多于女性造成的。

ALK陽性肺癌在非小細胞肺癌中約占3%～6%[14]。本組實驗ALK融合蛋白陽性檢出率為14%，高于非小細胞肺癌患者陽性率，其中ALK融合蛋白陽性患者的中位年齡為63歲，且更常見于60歲以下及Ⅲ/Ⅳ期肺腺癌患者，與腫瘤大小無關。一些研究發現ALK基因重排陽性在含印戒細胞的粘液型或實性肺腺癌中更常見，高于其他類型的肺腺(46.2% vs 8%)。但本組研究中12例肺腺癌ALK融合蛋白陽性病例，實體性腺癌3例，腺泡型腺癌3例，黏液腺癌3例，乳頭型腺癌3例，與是否含有黏液或微乳頭成分無關。可見單純依靠臨床特征與病理分型選擇ALK檢測的適宜人群，存在漏檢的風險。

一些研究顯示，非小細胞肺癌中EGFR,KRAS和ALK基因的改變多數表現為互相排斥[15]。然而也有研究顯示EGFR基因突變與ALK基因重排同時存在[16]。可見肺癌多基因的協同表達，研究還不十分充分，也沒有統一的結論。

本研究分別檢出5例EGFR突變伴ALK融合蛋白陽性，1例KRAS突變伴ALK融合蛋白陽性，2例EGFR突變伴KRAS突變。結果顯示ALK融合蛋白陽性伴隨有EGFR或KRAS突變的病例在肺腺癌中并不罕見。Gainor等研究西方人群非小細胞肺癌患者，發現ALK基因重排與EGFR和KRAS基因突變互相排斥[17]，與本研究結果不同，說明不同人種基因狀態存在差異。

本組研究中12例ALK融合蛋白陽性病例，5例(41.67%)伴隨EGFR基因突變((19DEL，S768I，L858R)，1例(8.33%)伴隨KRAS基因突變(Gly12Asp)。EGFR突變伴隨有ALK融合蛋白陽性，與KRAS突變伴隨有ALK融合蛋白陽性在ALK融合蛋白陽性肺腺癌中誰更占優勢，還需要更多的數據支持。

對于具有EGFR基因突變及ALK融合蛋白陽性的病例，多項研究顯示，采用TKI治療表現為臨床獲益，采用克唑替尼治療也表現出良好的治療反應性[18]。但也有體外實驗研究發現，EGFR基因突變與ALK基因重排同時存在，可能導致分別針對EGFR和ALK兩個靶點的單藥TKI治療相互耐藥[19]。這可以可能是具有ALK融合基因的患者采用克唑替尼治療約20%～30%的患者缺乏治療反應性的原因。

本組實驗檢出2例EGFR突變伴隨KRAS突變的肺腺癌病例，約占2.35%，在EGFR突變的肺腺癌患者中較罕見。文獻報道此類患者從TKI的治療中獲益較小，并且顯示出了不良預后[20]。

了解基因的協同作用及改變可以幫助我們理解腫瘤患者采用靶向治療時出現的原發耐藥機制，同時指導臨床轉換或調整針對ALK和EGFR、KRAS基因的靶向治療方案，為臨床采用多種靶向藥物聯合使用以達到阻斷多條腫瘤信號通路的目的提供依據。多基因協調作用的肺癌患者的治療方案的選擇及效果的觀察還需要更多的研究證實。

[1] Jemal A,Bray F,Center MM,et al.Global cancer statistics〔J〕.CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[2] Zhou C.Lung cancer molecular epidemiology in China:recent trends〔J〕.Transl Lung Cancer Res,2014,3(2):270-9.

[3] Schiller JH,Harrington D,Belani CP,et al.Eastern Cooperative Oncology Group:Comparison of four chemotherapy regimens for advanced non-small-cell lung cancer〔J〕.N Engl J Med,2002,346:92-98.

[4] Lynch TJ,Bell DW,Sordella R,et al.Activating mutations in the epidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib〔J〕.N Engl J Med,2004,350:2129-2139.

[5] Santos E,Martin-Zanca D,Reddy EP,et al.Malignant activation of a K-ras oncogene in lung carcinoma but not in normal tissue of the same patient〔J〕.Science,1984,223(4637):661-664.

[6] Soda M,Choi YL,Enomoto M,et al.Identification of the transforming EML4 ALK fusion gene in non-small-cell lung cancer〔J〕.Nature,2007，448(7153):561-566.

[7] Choi YL,Takeuchi K,Soda M et al.Identification of novelisoforms of the EML4 ALK transforming gene in non small cell lung cancer〔J〕.Cancer Res,2008,68(13):4971-4976.

[8] Zhu CQ,Sants GC,Ding K,et al.Role of KRAS and EGFR as biomarkers of response to erlotinib in National Cancer institute of Canada Clinical Trial Group study BR.21〔J〕.Journal of Clinical Oncology,2008,26(26):4268-4275.

[9] Gainor JF,Varghese AM,Ou SH,et al.ALK rearrangements are mutually exclusive with mutations in EGFR and KRAS in non-small cell lung cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2013，19(15):4273-81

[10] Devesa SS,Bray F,Vizcaino AP,et al.International lung cancer trends by histologic type:male:female differences diminishing and adenocarcinoma rates rising〔J〕.Int J Cancer,2005,117:294-299.

[11] Choi YH,Lee JK,Kang HJ,et al.Association between age at diagnosis and the presence of EGFR mutations in female patients with resected non-small cell lung cancer〔J〕.J Thorac Oncol,2010,5:1949-1952.

[12] Dearden S,Stevens J,Wu YL,et al.(2013) Mutation incidence and coincidence in non small-cell lung cancer:meta-analyses by ethnicity and histology (mutMap)〔J〕.Ann Oncol,2013,24(9):2371-2376.

[13] Dogan S,Shen R,Ang DC,et al.Molecular epidemiology of EGFR and KRAS mutations in 3,026 lung adenocarcinomas:higher susceptibility of women to smoking-related KRAS-mutant cancers〔J〕.Clin Cancer Res,2012,18(22):6169-6177.

[14] Thunnissen E,Bubendorf L,Dietel M,et al.EML4-ALK te-sting in non-small cell carcinomas of the lung:a review with recommendations〔J〕.Virchows Arch,2012,461(3):245-57.

[15] Pao W,Wang TY,Riely GJ,et al.KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib〔J〕.PLoS Med,2005,2(1):e17.

[16] Kris M,Johnson B,Kwiatkowski D,et al.Identification of -driver mutations in tumor specimens from 1000 patients with lung adenocarcinoma:The NCI's Lung Cancer Mutation Consortium (LCMC)〔J〕.J Clin Oncol,2011,29(18 suppl):CRA7506.

[17] Justin F.Gainor,Anna M.Varghese,et al.ALK rearrangements are mutually exclusive with mutations in EGFR or KRAS:an analysis of 1,683 patients with non-small cell lung cancer〔J〕.Clin Cancer Res,2013,19(15):4273-4281.

[18] Baldi L,Mengoli MC,Bisagni A,et al.Concomitant EGFR mutation and ALK rearrangement in lung adenocarcinoma is more frequent than expected:report of a case and review of the literature with demonstration of genes alteration into the same tumor cells〔J〕.Lung Cancer,2014,86(2):291-295.

[19] Sasaki T,Koivunen J,Ogino A,et al.A novel ALK secondary mutation and EGFR signaling cause resistance to ALK kinase inhibitors〔J〕.Cancer Res,2011,71(18):6051-6060.

[20] Takeda M,Okamoto I,Fujita Y,et al.De novo resistance to epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in EGFR mutation-positive patients with non-small cell lung cancer〔J〕.J Thorac Oncol,2010,5(3):399-400.

(編輯：吳小紅)

InvestigationofEGFR、KRASMutationsandALKProteinFusionStatusinLungAdenocarcinomaPatients

DONGDandan,XUGang,LIFanghua,etal.

SichuanAcademyofMedicalSciences,SichuanProvincialPeople’sHospital,Chengdu,610072

ObjectiveTo evaluate the mutations of EGFR,KRAS,ALK fusion protein and their relations with clinical pathological features and stages of lung adenocarcinoma.MethodsIn a cohort of patients with lung adenocarcinoma (n=85),EGFR,KRAS mutations were detected by amplification refractory mutation system in multiple quantitative polymerase chain reaction (ARMSmultiq PCR).ALK fusion protein was screened using immunohistochemistry (IHC) conducted with an anti-ALK monoclonal antibody (clone D5F3,Ventana).ResultsThe mutation rate was 62%,15%,14% for EGFR,KRAS,ALK fusion protein in 85 lung adenocarcinoma cases,respectively.EGFR mutations were more frequently observed in female patients.KRAS mutations were more frequently detected in male patients,and smokers.ALK fusion protein was more frequently observed in younger patients,and 3/4 patients.8 cases of co-mutationswere detected.ConclusionWe have further confirmed that EGFR,KRAS mutations and ALK fusions are not mutually exclusive through the analysis of 85 lung adenocarcinoma cases.It is vital for a complete molecular analysis to be performed on all lung adenocarcinoma patients,and the possibility of multiple mutations must be taken into account when choosing targeted therapy.

Lung adenocarcinoma；EGFR；KRAS；ALK

四川省衛生廳課題基金項目(編號：120080)

610072 四川省醫學科學院四川省人民醫院

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.09.001

R734.2

A

1001-5930(2017)09-1393-05

2016-09-08

2017-07-10)