探討利用測量不確定度評估ELISA法檢測抗HEV-IgM實(shí)驗(yàn)中灰區(qū)設(shè)置的適用性

楊宇生

（成都市疾病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

探討利用測量不確定度評估ELISA法檢測抗HEV-IgM實(shí)驗(yàn)中灰區(qū)設(shè)置的適用性

楊宇生

（成都市疾病預(yù)防控制中心，四川 成都 610041）

目的 探討ELISA法檢測HEV-IgM的實(shí)驗(yàn)中灰區(qū)值的設(shè)置。方法 使用瑞士漢密爾頓全自動酶聯(lián)免疫分析儀FAME24/20檢測HEV-IgM，利用本實(shí)驗(yàn)室ELISA法檢測抗HEV-IgM實(shí)驗(yàn)中的測量不確定度，評估ELISA法檢測抗HEV-IgM實(shí)驗(yàn)中灰區(qū)值的范圍。結(jié)果置信水平為95%時，抗HEV-IgM擴(kuò)展不確定度U抗HEV-IgM=59.78%，在臨界狀態(tài)下，即s/co=1時，s/co值有95%的可能性位于1± 1*59.78%，即可評估ELISA法檢測抗HEV-IgM實(shí)驗(yàn)中灰區(qū)值范圍為0.40～1.60。結(jié)論 灰區(qū)范圍的設(shè)置能顯著的影響到ELISA檢測結(jié)果，設(shè)置合理的符合實(shí)驗(yàn)室實(shí)際情況的灰區(qū)范圍，有助于降低假陰性標(biāo)本的漏檢率，提高檢測的準(zhǔn)確度和檢測質(zhì)量，利用實(shí)驗(yàn)室已獲得的測量不確定度來評估檢測項(xiàng)目的灰區(qū)范圍，比起按照固定比例來設(shè)置灰區(qū)范圍更為科學(xué)合理，也更適合不同實(shí)驗(yàn)室的實(shí)際情況。

ELISA；測量不確定度；灰區(qū)；設(shè)置

戊型病毒性肝炎是一種經(jīng)消化道傳播的病毒性肝炎，其傳播方式、臨床表現(xiàn)和預(yù)后均與甲型病毒性肝炎類似，是發(fā)展中國家的面臨的一個重大公共衛(wèi)生問題，能引起戊型肝炎大的爆發(fā)流行或急性散發(fā)性感染，還可轉(zhuǎn)為慢性感染，主要侵犯中青年，尤其是孕婦感染率高，戊肝如果爆發(fā)在孕婦人群尤其是妊娠晚期，易導(dǎo)致高發(fā)病率、高病死率、高急性肝功能衰竭等肝臟疾病，還可導(dǎo)致早產(chǎn)兒，低出生體質(zhì)量兒和圍生期病死率的風(fēng)險增加[1]。《中華人民共和國食品安全法》（2015年修訂）第45條中也規(guī)定，患有國務(wù)院衛(wèi)生行政部門規(guī)定的有礙食品安全疾病的人員，不得從事接觸直接入口食品的生產(chǎn)。從事接觸直接入口食品工作的食品生產(chǎn)經(jīng)營人員應(yīng)當(dāng)每年進(jìn)行健康檢查，取得健康證明后方可上崗工作。而戊型病毒性肝炎作為食品從業(yè)人員健康檢查的項(xiàng)目之一，是衛(wèi)生行政部門規(guī)定的有礙食品安全疾病之一。

血清免疫學(xué)檢測抗HEV-IgM作為戊肝近期感染的標(biāo)志[1]，其中ELISA法是最常用的免疫學(xué)檢測方法之一。酶聯(lián)免疫試驗(yàn)（ELISA）法是免疫診斷中的一項(xiàng)常用技術(shù)，已成功地應(yīng)用于多種病原微生物引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷，也可應(yīng)用于大分子抗原和小分子抗原的定量測定。由于ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩(wěn)定以及易于自動化操作等特點(diǎn)，還廣泛應(yīng)用于各級醫(yī)療衛(wèi)生機(jī)構(gòu)，如各級醫(yī)院，疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室，采供血機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)室等，因此保證ELISA檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和檢測質(zhì)量，對于疾病的診斷，預(yù)防篩查和流行病學(xué)調(diào)查等有著十分重要的意義。但是由于ELISA法影響因素較多，十分有必要在臨界值附近設(shè)置灰區(qū)，以提高檢測準(zhǔn)確性，避免出現(xiàn)漏檢。同時，由于國內(nèi)試劑廠商多沒有提供試劑檢測結(jié)果的灰區(qū)值，國內(nèi)對于灰區(qū)范圍的設(shè)置沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，各實(shí)驗(yàn)室對于灰區(qū)設(shè)置也有不同的觀點(diǎn)和方法。基于此，本研究對此問題進(jìn)行初步探討，嘗試?yán)脤?shí)驗(yàn)室的測量不確定度來評估ELISA檢測中實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的灰區(qū)的范圍設(shè)置。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器：預(yù)防醫(yī)學(xué)門診部實(shí)驗(yàn)室采用瑞士HANMILTON AT全自動樣本處理機(jī)，和瑞士漢密爾頓FAME24/20全自動酶聯(lián)免疫分析儀。

1.1.2 試劑：北京萬泰生物藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的抗HEV-IgM酶聯(lián)免疫體外診斷試劑盒，北京康徹思坦生物制劑公司生產(chǎn)的室內(nèi)質(zhì)控品（單位：抗HEV-IgM，2 U/mL），衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心提供的室間質(zhì)量評價考核標(biāo)本（每次質(zhì)評活動中提供5個水平的質(zhì)評樣本）。

1.2 數(shù)據(jù)：室內(nèi)質(zhì)控根據(jù)操作手冊每一檢測批內(nèi)進(jìn)行一次檢測，收集本實(shí)驗(yàn)室2015年4月至2016年4月萬泰抗-HEV-IgM（批號：201501001）共83個質(zhì)控數(shù)據(jù)。收集2014年至2015年度衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心的室間質(zhì)量評價活動，抗HEV-IgM實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目全年共兩次室間質(zhì)評結(jié)果，每次室間質(zhì)評活動中，衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心發(fā)出5組水平的質(zhì)控樣本，盡量選擇檢測結(jié)果在臨界值附近（s/co值在1～6）的質(zhì)控樣本的室間質(zhì)評數(shù)據(jù)。

1.3 檢測程序：①確保儀器處于良好的性能，儀器按作業(yè)指導(dǎo)書進(jìn)行維護(hù)，年底由廠家工程師做年終維護(hù)；②以實(shí)驗(yàn)室程序文件為指導(dǎo)，正確開展實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制，同時每年參加衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的免疫項(xiàng)目室間質(zhì)量評價計(jì)劃，均通過；③實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)控品和衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)評樣本的測量過程，均和日常常規(guī)標(biāo)本一致，根據(jù)儀器作業(yè)指導(dǎo)書和試劑說明書嚴(yán)格進(jìn)行操作。

1.4 不確定度的來源與計(jì)算

1.4.1 不確定度來源：近年來國外學(xué)會諾德創(chuàng)新中心（NordicInnovation）提出一整套規(guī)則，即Nordtest準(zhǔn)則[2]，其主要致力于北歐國家檢測方法的發(fā)展和檢測的一致性評定，以保證北歐國家間產(chǎn)品與服務(wù)能無障礙的流通，其中有關(guān)測量不確定度的評定方法主要采用實(shí)驗(yàn)室已有的室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)和實(shí)驗(yàn)室參加PT（能力驗(yàn)證）計(jì)劃所獲得的室間質(zhì)量評價數(shù)據(jù)來進(jìn)行測量不確定度的評估，旨在提供一個實(shí)用的、易于理解的、普遍的測量不確定度的評定方法，即是說，實(shí)驗(yàn)室如果擁有室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)，并參加了實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證計(jì)劃并獲得反饋回的室間質(zhì)量評價數(shù)據(jù)，就可以根據(jù)Nordtest準(zhǔn)則來進(jìn)行測量不確定度的評估。根據(jù)Nordtest準(zhǔn)則[2]，測量不確定度主要來源于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重現(xiàn)性（Reproducibility within-laboratory），以及方法和實(shí)驗(yàn)室偏倚（Method and laboratory bias）。

1.4.2 不確定度評定[2-4]：合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度uc（y）和擴(kuò)展不確定度U：

U=k×uc，其中包含因子k=2，取95%置信區(qū)間。

其中，①實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重現(xiàn)性（Rw）主要反映的是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的精密度，因此當(dāng)室內(nèi)質(zhì)控品經(jīng)過和常規(guī)檢測樣本一致的實(shí)驗(yàn)處理過程并具有相似的基體效應(yīng)時，室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)的變異系數(shù)CV就是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重現(xiàn)性（Rw）的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，用uRw（rel）表示：

在本文中s為本實(shí)驗(yàn)室1年內(nèi)室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差， 為1年內(nèi)室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)平均值。

②方法和實(shí)驗(yàn)室偏倚即均方根（Root mean square，RMS），計(jì)算公式為[3]

n為實(shí)驗(yàn)室參加衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心室間質(zhì)評的實(shí)驗(yàn)次數(shù)，bias為實(shí)驗(yàn)室室間質(zhì)評樣本測量值與質(zhì)評樣本公示值之間的相對偏倚值。

③參考值和（或）參考方法偏倚ucref，根據(jù)ISO13528[4]：

cvr為室間質(zhì)評中相同方法組所得檢測結(jié)果的變異系數(shù)，m為室間質(zhì)評相同方法組中參評實(shí)驗(yàn)室的數(shù)目，1.25為穩(wěn)健標(biāo)準(zhǔn)差的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 uRw（rel）計(jì)算結(jié)果：收集本實(shí)驗(yàn)室2014年至2015年度的同一批號的室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)，利用室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)來評估測量不確定度，結(jié)果見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重現(xiàn)性的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.2 相對偏倚和RMSbias計(jì)算結(jié)果：收集本實(shí)驗(yàn)室2014年至2015年度衛(wèi)生部臨檢中心室間質(zhì)量評價回饋數(shù)據(jù)，評價方法和實(shí)驗(yàn)室偏倚的測量不確定度，結(jié)果見表2。

表2 評價方法和實(shí)驗(yàn)室偏倚相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.3 參考值測量不確定度ucref計(jì)算結(jié)果：結(jié)果見表3。

表3 室間質(zhì)評參考值相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4 合成相對標(biāo)準(zhǔn)測量不確定度和擴(kuò)展不確定度：

其中包含因子k=2，取95%置信區(qū)間。

2.5 ELISA法檢測抗HEV-IgM灰區(qū)范圍：置信水平為95%時，抗HEV-IgM擴(kuò)展不確定度U抗HEV-IgM=59.78%，在臨界狀態(tài)下，即s/co=1時，s/co值有95%的可能性位于1±1*59.78%，即可評估本實(shí)驗(yàn)室ELISA法檢測抗HEV-IgM實(shí)驗(yàn)中灰區(qū)值范圍為0.40～1.60。

3 討 論

ELISA法的基本原理是抗原抗體的特異性結(jié)合，以及底物和酶的多級放大系統(tǒng)，其操作步驟復(fù)雜，每一步操作不當(dāng)都會對最終結(jié)果產(chǎn)生影響，同時ELISA法影響因素眾多，包括試劑的因素，樣本前處理，內(nèi)源性和外源性干擾因素等[5]。在采用ELISA方法進(jìn)行檢測時，國產(chǎn)試劑常以CUTOFF值（co值）來作為判定檢測結(jié)果陽性還是陰性的標(biāo)準(zhǔn)，但是由于ELISA方法學(xué)的原因和種種限制，還是會出現(xiàn)一些處于臨界值附近的結(jié)果，現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)難以判斷其陰陽性，而國外的ELISA試劑通常把這一區(qū)間的結(jié)果定義為“灰區(qū)”[6]。由此可以看出，由于ELISA方法學(xué)的固有特性和局限性，其必然會存在有處于“灰區(qū)”范圍內(nèi)的可疑檢測結(jié)果，同時由于ELISA法步驟復(fù)雜，影響因素眾多，因此應(yīng)用ELISA法進(jìn)行檢測時變異系數(shù)較大，灰區(qū)的范圍相對較寬，因此科學(xué)合理的設(shè)置灰區(qū)范圍對實(shí)驗(yàn)結(jié)果和檢測質(zhì)量有著顯著影響。

灰區(qū)的設(shè)置就是在臨界值附近劃出一定的“范圍”，在這個“范圍”內(nèi)樣本的檢測結(jié)果為“可疑”，需對樣本進(jìn)行重復(fù)檢測，設(shè)置灰區(qū)范圍的方法一般有兩種，一是根據(jù)室內(nèi)質(zhì)控的變異系數(shù)cv，或室內(nèi)質(zhì)控的標(biāo)準(zhǔn)差SD[7]，另一種是按照固定比例來設(shè)定，例如10%～15%倍CUTOFF值區(qū)域作為灰區(qū)范圍[8]。筆者認(rèn)為酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)（ELISA）中“灰區(qū)”的設(shè)置不是固定的，也沒有一個統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)比例，由于ELISA實(shí)驗(yàn)影響因素眾多，同時每個檢測項(xiàng)目的特點(diǎn)不同，各個實(shí)驗(yàn)室的客觀條件、檢測水平也各不相同，因此“灰區(qū)”范圍的設(shè)定應(yīng)該根據(jù)不同檢測項(xiàng)目，不同檢測條件，由各實(shí)驗(yàn)室根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行設(shè)置，毛瑞[9]也持相似的觀點(diǎn)，同時僅僅根據(jù)室內(nèi)質(zhì)控cv或SD來設(shè)置，也存在一定局限，如cv僅反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室批內(nèi)和批間變異，未能反應(yīng)出實(shí)驗(yàn)室檢測的偏倚大小，而根據(jù)Nordtest準(zhǔn)則[2]，測量不確定度主要來源于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)重現(xiàn)性、以及方法和實(shí)驗(yàn)室偏倚，其能全面反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室的批內(nèi)和批間變異，以及實(shí)驗(yàn)室的偏倚。測量不確定度是表征合理地賦予被測量之值的分散性，與測量結(jié)果相聯(lián)系的參數(shù)，即在一定的置信水平下，測量之值有多大可能性處于這個區(qū)間。當(dāng)ELISA檢測結(jié)果在判斷結(jié)果真?zhèn)蔚呐R界值，即s/co=1時，由于檢測的測量不確定度的存在，此檢測結(jié)果有一定的可能性（一般是95%可信水平），處于1± 1*U，從而可以評估出該檢測項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)中的灰區(qū)值范圍，因此筆者認(rèn)為利用測量不確定度來評估灰區(qū)范圍較為科學(xué)、合理。

陳善華[6]等的研究表明，ELISA檢測HBsAg結(jié)果處于灰區(qū)范圍的樣本，經(jīng)電化學(xué)發(fā)光和HBA DNA重復(fù)檢測，其陽性率達(dá)10%以上，因此灰區(qū)范圍合理、科學(xué)的設(shè)置，有利于幫助判斷“可疑”標(biāo)本，從而采取不同檢測試劑，或者不同檢測方法進(jìn)行復(fù)檢，以進(jìn)一步減少漏檢的可能性，提高實(shí)驗(yàn)室檢測質(zhì)量，保證廣大群眾的健康。

[1] 肖培,程龍慧,許曉紅.戊型肝炎病毒研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2014,41(22):4160-4162.

[2] Magnusson B,Naykki T,Hovind H,et al.Handbook for Calculation of Measurement Uncertainty in Environmental laboratories[S]. Espoo:Nordtest,2003.

[3] Bertil Magnusson,Haakan Ossowicki,Olaf Rienitz Elvar Theodorsson.Routine internal-and external-quality control data in clinical laboratories for estimating measurement and diagnostic uncertainty using GUM principles[J].Scand J Clin Lab Invest, 2012,72(3):212-220.

[4] 中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局,中國國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會.利用實(shí)驗(yàn)室間比對進(jìn)行能力驗(yàn)證的統(tǒng)計(jì)方法[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2012.

[5] 容瑩,孫秀雙,鄭望春,等.乙型肝炎表面抗原檢測結(jié)果分析及灰區(qū)設(shè)置探討[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2010,7(15):1593-1595.

[6] 陳善華,朱麗莉,李浩,等.ELISA方法檢測HBsAg設(shè)置灰區(qū)的必要性探討[J].中國輸血雜志,2013,26(10):1013-1014.

[7] 魏蘭華.ELISA法檢測抗-HIV實(shí)驗(yàn)中灰區(qū)設(shè)置的探討[J].臨床輸血與檢驗(yàn),2015,17(6):566,581.

[8] 伍偉建,郭如華.ELISA試驗(yàn)灰區(qū)設(shè)置方法的探討[J].中國生物制品學(xué)雜志,2008,21(10):911-912.

[9] 毛瑞.西藏自治區(qū)血液中心實(shí)驗(yàn)室酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測“灰區(qū)范圍”淺談[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2013,20(3):285-287.

Discuss the Applicability of Using Measurement Uncertainty to Assess the Setting of Gray Area in Anti-HEV-IgM Detection by ELISA

YANG Yu-sheng
(Chengdu Center for Disease Control and Prevention, Chengdu 610041, China）

Objective Discuss the setting of gray area in anti-HEV-IgM detection by ELISA. Methods Use the Automatic enzyme-linked immunity analyzer FAME24/20 to detect anti-HEV-IgM, make use of measurement uncertainty in anti-HEV-IgM by ELISA, assess the range of gray area in anti-HEV-IgM by ELISA. Results With a 95% confidence level, the expanded uncertainty of anti-HEV-IgM was 59.31%, at the CUT-OFF level(S/CO=1), there was a 95% chance that S/CO was between 1±1*59.31%, then the range of gray area in anti-HEV-IgM by ELISA was 0.41-1.59. Conclusion The setting of gray area observably affects the detection of ELISA, reasonable range of gray area coincide with the actual situation of lab, helps to decrease the not-detected rate of false negative,improves the accurancy and quality of detection, assessment of the gray area range by the lab’ measurement uncertainty obtained, was more reasonable than setting of gray area by fixed ratio, then more suitable to the actual situation of the lab.

ELISA; Measurement uncertainty; Gray area; Setting

R575.1

B

1671-8194（2017）18-0011-03