66個玉米自交系的SSR引物篩選試驗初報

張微微 王莉萍 陳 岳 李 炯 俞平高*（上海農林職業技術學院植物科學技術系，上海市松江區 0699；上海市農業廣播電視學校，上海市松江區 0699；上海交通大學農業與生物學院，上海市閔行區 000；上海粒粒豐農業科技有限公司,上海市金山區 050）

66個玉米自交系的SSR引物篩選試驗初報

張微微1王莉萍2陳 岳3李 炯4俞平高1*（1上海農林職業技術學院植物科學技術系，上海市松江區 201699；2上海市農業廣播電視學校，上海市松江區 201699；3上海交通大學農業與生物學院，上海市閔行區 200240；4上海粒粒豐農業科技有限公司,上海市金山區 201503）

玉米作為上海地區農業生產上的主要農作物之一，其種質資源的優劣將直接影響到上海地區的農業生產發展水平和農民的收益水平。為給上海地區玉米品種的遺傳資源評價和親緣關系分析提供理論依據和技術支持，利用SSR分子標記技術進行了SSR引物篩選試驗。結果表明，以“SH376”“Z421-P1”“Z571”“Z226-P10”“Z678-P17”“Z710-P8”品系的基因組DNA為模板對103對引物進行篩選，可獲得30對多態性高的SSR引物；再對6 6份玉米自交系進行S S R分析，可擴增出1 2 1條譜帶，每個標記位點等位基因數2～8個，平均等位基因數為4.0，PIC值變幅為0.73～0.90，平均為0.82；選擇6個PIC值等于或高于0.85的SSR引物及2個PIC值低于0.85的引物組合成一套核心引物，可用于構建6 6份玉米自交系的S S R指紋圖譜。

玉米；S S R；引物篩選；等位基因數；多態性信息

DNA指紋技術是基于DNA分子水平差異檢測進行個體識別的技術，具有覆蓋面全、多態性高、測試周期短和不受季節和測試時間限制等優點。目前，該技術已廣泛應用于各種農作物品種遺傳背景分析、指紋圖譜構建、品種真實性和純度鑒定、區試品種質量監控等方面。作為第二代分子標記的SSR標記，是由2～6個堿基組成的重復序列，是建立在PCR反應基礎之上的一種遺傳標記技術。目前，該技術已被有效地應用于玉米指紋圖譜構建工作中，如譚君等[1]構建了四川常用73份玉米自交系和雜交種的SSR指紋圖譜；趙久然等[2]建立了中國玉米新品種DNA指紋庫；吳渝生等[3]建立了3個云南玉米雜交種及其親本DNA的指紋圖譜；李曉輝等[4]確定10 對核心引物，建立了86個雜交種的SSR指紋圖譜庫；李麗華等[5]對四川農業大學玉米研究所近年選育的20個優良自交系的指紋圖譜進行了構建。

玉米作為上海地區農業生產上的主要農作物之一，其品種自交系常年種植面積在0.4萬hm2以上，玉米種質資源的優劣將直接影響到上海地區的農業生產發展水平和農民的收益水平。為此，本研究利用SSR分子標記技術進行了SSR引物篩選試驗，以期對當地玉米品種真實性和一致性進行鑒定，為上海地區玉米品種的遺傳資源評價和親緣關系分析提供理論依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

由上海粒粒豐農業科技有限公司收集66份玉米自交系，見表1，包括甜玉米、糯玉米、少量甜糯玉米和普通玉米等類型，各品種均于2015年4月在上海粒粒豐農業科技有限公司實驗基地種植，常規播種，于5月對每個自交系進行取樣，-80 ℃保存備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取

采用DNA提取試劑盒[DP320，天根生化科技(北京)有限公司]提取玉米幼嫩葉片基因組DNA，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用NanoDrop2000c紫外可見光譜儀(Thermo公司)進行DNA純度和濃度測定，稀釋至50 ng/μL工作液，于4 ℃冰箱儲藏備用。

1.2.2 SSR引物篩選

以“SH376”“Z421-P1”“Z571”“Z226-P10”“Z678-P17”“Z710-P8”品系的基因組DNA為模板進行SSR引物多態性篩選，引物試驗所用SSR引物均由生工生物工程股份(上海)有限公司合成。PCR反應總體積為10 μL，反應混合液為2×ES Taq mix(康為公司)5 μL、50 ng/μL 的DNA模板 1 μL、10 μM 的引物 0.5 μL、ddH2O 3.5 μL。PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR產物加入變性劑6 μL，95 ℃變性5 min，迅速于冰上冷卻，6%聚丙烯酰胺凝膠檢測，銀染法顯色。白熾燈下觀察電泳結果，進行數據統計和照相。

2 結果與分析

2.1 SSR引物多態性篩選

以“SH376”“Z421-P1”“Z571”“Z226-P10”“Z678-P17”“Z710-P8”品系的基因組DNA為模板，對103對引物進行多態性篩選，結果篩選出30對條帶清晰、擴增穩定、具有多態性的SSR引物，多態性比率為29.1%，見表2。

2.2 SSR標記分析

利用30對多態性引物對66份玉米自交系進行SSR分析，獲得的擴增譜帶清晰，可用于不同玉米自交系材料的區分。結果表明，30對多態性SSR引物共擴增出121條譜帶，每個標記位點等位基因數2～8個，平均等位基因數為4個；多態性信息量(PIC)是用來評估每對引物標記的多態性信息量水平，本試驗篩選出的30對SSR引物中，PIC值為0.73～0.90，平均為0.82，表明所篩選的引物具有較豐富的遺傳多樣性。

表1 66份玉米自交系名稱、類型和顏色信息

表2 30對多態性SSR引物名稱、等位基因數和多態性信息量

本研究選取多態性、穩定性、重復性等綜合特性好的引物作為核心引物，從表2可看出，PI C值超過0.85的有bnlg615、bnlg1017、bnlg1018、bnlg1257、bnlg1265、umc1083和NC004等7個引物。考慮特征譜帶、帶型統計和引物重復性等原因，最終確定將bnlg615、bnlg1017、bnlg1018、bnlg1257、bnlg1484、umc1083、Phi072和NC004等8個引物作為一套核心引物，其中，引物bnlg615對材料“Z1222”和“Z492-P11”、引物bnlg1017對材料“Z397-P2”、引物bnlg1018對材料“Z1255”、引物bnlg1257對材料“Z1222”和“Z758-P18”、引物bnlg1484對材料“Z710-P8”、引物Phi072對材料“Z1258”有特征性譜帶。5對引物bnlg615、bnlg1017、bnlg1018、bnlg1257和NC004組合可以將63份供試材料區分開，見表3，其他材料需用擴增特征譜帶引物區分。

此外，由于少數材料不易找出特征譜帶或不易區分，而可篩選的引物數量有限，只有個別PIC值較低的引物對其有特征性譜帶，或與其它引物組合才能區分開，如引物bnlg1484(0.82)和Phi072(0.81)。

表3 部分引物組合區分自交系數統計分析

3 結論與討論

結果表明，以“SH376”“Z421-P1”“Z571”“Z226-P10”“Z678-P17”“Z710-P8”品系的基因組DNA為模板對103對引物進行篩選，可獲得30對多態性高的SSR引物；再對66份玉米自交系進行SSR分析，可擴增出121條譜帶，每個標記位點等位基因數2～8個，平均等位基因數為4.1個，平均PIC值為0.82，這與Xie等[6]研究的70對SSR引物在187份玉米自交系中檢測到的平均等位基因數(4.14)相近，但其平均PIC值(0.615)低于本試驗；本試驗檢測到的平均等位基因數和PIC值均高于肖木輯等[7]用70對SSR標記對37份遼寧省主要玉米自交系檢測的平均等位基因數(3.7)和平均PIC值(0.564)，分析原因，這可能與試驗所用材料和所選引物不同有關。本實驗所用SSR標記的平均PIC均高于文獻報道，表明所篩選引物具有較豐富的遺傳多樣性。

SSR標記具有簡單快速、重復性好、穩定性高、多態性豐富和具共顯性等優勢，是構建玉米指紋圖譜采用最多的標記技術。DNA指紋圖譜的構建應利用盡量少的標記分開盡量多的品種，而多態性信息量高的引物，其擴增產物多態性好，能區分更多的供試材料。因此，這就要求所用標記的多態性要好，以降低成本、提高檢測效率。本研究選擇6個PIC值等于或高于0.85的SSR引物及2個PIC值低于0.85的引物組合成一套核心引物，其中5對引物bnlg615、bnlg1017、bnlg1018、bnlg1257和NC004可將63份供試材料區分開，這有助于進一步構建玉米自交系（上海地區）DN A指紋圖譜。但本研究僅對上海地區玉米自交系材料進行了分析，因此其等位基因數目和頻率值的準確性還有待印證，對于不同地區、不同玉米自交系材料，應針對引物合成成本、不同材料的引物多態性、引物穩定性等多方面進行調整和人工優化，從而確定最佳引物組合。

本研究利用SSR標記技術對玉米自交系（上海地區）進行了SSR引物篩選試驗，試驗結果對今后優異基因資源的發掘、品種權益的保護及種子的真實性和純度鑒定均具有重要意義。

[1]譚君,丁仲芳,孫仕賢,等.西南常用玉米自交系SSR指紋圖譜構建[J].西南農業學報,2003,16(2):1-6.

[2]趙久然,王鳳格,郭景倫,等.中國玉米新品種DNA指紋庫建立系列研究Ⅱ.適于玉米自交系和雜交種指紋圖譜繪制的SSR核心引物的確定[J].玉米科學,2003,11(2):3-5.

[3]吳渝生,楊文鵬,鄭用璉.3個玉米雜交種和親本SSR指紋圖譜的構建[J].作物學報,2003,29(4):496-500.

[4]李曉輝,李新海,高文偉,等.玉米雜交種DNA指紋圖譜及其在親子鑒定中的應用[J].作物學報,2005,31(3):386-391.

[5]李麗華,魏昕,潘光堂.20個骨干玉米自交系的SSR指紋圖譜構建[J].西南農業學報,2007,20(6):1172-1175.

[6]Xie C,Zhang S, Li M, et al. Inferring genome ancestry and estimating molecular relatedness among 187 Chinese maize inbred lines[J]. Journal of Genetics and Genomics,2007,34(8):738-748.

[7]肖木輯,李明順,孫有位,等.遼寧省主要玉米自交系的SSR遺傳多樣性分析[J].玉米科學,2006,14(1):33-36.

2017-08-20

*為通訊作者