不同提取方法對波棱瓜子多糖提取率的影響

劉美琳，董佳悅，安太勇，李楊，張梅

不同提取方法對波棱瓜子多糖提取率的影響

劉美琳，董佳悅，安太勇，李楊，張梅*

目的：考察用不同提取方法(回流提取法、超聲波輔助提取法)對波棱瓜子多糖提取率的影響。方法：用苯酚-硫酸法測定多糖的含量，在單因素實驗的基礎上，通過正交實驗確定最佳提取工藝條件。結果：回流提取的最佳工藝條件為在100 ℃的水浴條件下，1：40(g：mL)的料液比，提取3 h，提取2次，多糖提取率為1.47%。超聲波輔助提取的最佳工藝條件為在60 ℃水溫條件下，以1：10(g：mL)的料液比，超聲強度300 W、超聲處理時間20 min，超聲1次，多糖提取率為1.32%。結論：通過對兩種方法最佳工藝的比較，回流法較超聲法多糖提取率提高11%，回流法優于超聲法，但差異無顯著性。

波棱瓜子；多糖；正交實驗；回流提取法；超聲波輔助提取法

波棱瓜子系葫蘆科波棱瓜屬植物波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall. (H. pedunculosum(Ser.) Baill) 的干燥成熟種子，是一種常用藏藥。具有清腑熱，膽熱的功效，用于治療赤巴入臟腑，肝、膽熱癥(肝炎，膽囊炎)，消化不良等癥[1]。波棱瓜子中主要含脂肪油、木脂素、多糖類等活性成分[2-4]。課題組前期研究表明，波棱瓜子多糖具有抗免疫性肝損傷作用。為進一步深入開展波棱瓜子多糖的研究，本文在前期實驗基礎上，參考相關文獻[5-7]，對波棱瓜子多糖提取方法進行考察。分別采用熱水回流提取法、超聲波輔助提取法提取波棱瓜子中的多糖，比較波棱瓜子多糖的提取率，獲得最佳的提取工藝條件。

1 材料

1.1 藥材

波棱瓜子，2015年10月購于四川甘孜，經成都中醫藥大學藥學院裴瑾教授鑒定為葫蘆科植物波棱瓜Herpetospermum caudigerum Wall．的干燥成熟種子。

1.2 儀器

UV-2600型紫外-可見分光光度計（上海天美科學儀器有限公司）；BT 125D型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。RE-5203型旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-600DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.3 試劑

D-無水葡萄糖(中國食品藥品檢定研究院，批號：110833-201205)，濃硫酸、苯酚、正丁醇、三氯甲烷、無水乙醇、石油醚(60-90℃) 等均為分析純；蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

2.1.1 回流法 波棱瓜子粉碎(過10目篩)，石油醚回流脫脂，濾渣按一定比例加入蒸餾水，水浴回流提取，減壓濃縮，Savage法除蛋白，加入6倍體積的無水乙醇，醇沉過夜（靜置24 h），濾過。取沉淀，精密稱取25 mg，加蒸餾水溶解并定容至25 mL。精密吸取上述溶液4 mL，加蒸餾水定容至25 mL。

2.1.2 超聲波輔助提取法 取波棱瓜子粉末，除提取方式為超聲提取，其余同 “2.1.1”項下相同方法處理。

2.2 苯酚-硫酸法測定多糖含量

2.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制 精密稱取105 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖對照品10 mg，加蒸餾水溶解制成0.1 mg/mL貯備液。分別準確吸取上述溶液5、10、15、20、25、30、35、40 mL于50 mL容量瓶中，定容。準確吸取2 mL置于10 mL具塞試管中，分別加入新制成5%的苯酚溶液0.2 mL，搖勻，迅速加入4 mL濃硫酸，充分搖勻，另取2 mL蒸餾水按同樣顯色條件作空白對照，置60 ℃水浴15 min，冰水浴冷卻至室溫。在400-600 nm內掃描，最大吸收波長為488 nm。在488 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖對照品溶液濃度(μg/mL)作為橫坐標，相應的吸光度(A)作為縱坐標，進行線性回歸分析，繪制標準曲線，得回歸方程Y=0.0126 X+0.0014 (n=6，r=0.9995)。結果表明在10～80 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.2 波棱瓜子多糖含量測定 精密量取供試品溶液2 m L，置10 m L具塞刻度試管中，照標準曲線制備項下的方法測定吸光度，從回歸方程中求出供試品溶液中葡萄糖的濃度，計算公式如下[8]：

（其中，V：樣品溶液體積（ml）；C：多糖供試液中葡萄糖的濃度（μg/ml）；D：樣品溶液的稀釋倍數；m：稱取樣品的質量（mg））

2.3 正交實驗

在單因素實驗基礎上，以料液比、時間、溫度、提取次數等為考察因素，設計L9(34)正交實驗來確定回流提取法(表1)、超聲波輔助提取法(表2)提取波棱瓜子多糖的最佳提取工藝。

表1 回流提取法正交實驗各因素水平表

表2 超聲輔助提取法正交實驗各因素水平表

2.4 結果與分析

2.4.1 回流提取法提取波棱瓜子多糖工藝的研究 根據單因素實驗確定回流提取法提取波棱瓜子多糖的適宜條件為：料液比1∶60，提取時間2 h，提取溫度100 ℃，提取次數固定為2次，在此基礎上以提取率作為評價指標進行正交實驗，結果見表3、表4。

由表3可知，影響波棱瓜子多糖提取的主要因素依次為：A＞C＞B，即提取溫度＞料液比＞提取時間，由表4的進一步方差分析得知，提取溫度對波棱瓜子多糖得率的影響最大，達顯著水平。根據正交實驗結果，波棱瓜子多糖多糖回流提取最佳方案為A3B2C1，即提取溫度100 ℃，提取時間3 h，料液比1：40。在最佳工藝方案下回流提取多糖的提取率為1.48%。

表3 正交實驗設計與結果分析

k2 1.0998 1.0660 0.9483 k3 1.3917 1.0204 1.0517 R 0.7701 0.0456 0.1091

表4方差分析表

2.4.2 超聲波輔助提取法提取波棱瓜子多糖工藝的研究 根據單因素實驗確定超聲波輔助提取法提取波棱瓜子多糖的適宜條件為：固定超聲功率300 w，料液比1：10，超聲時間60 min，提取溫度80 ℃，超聲次數1次，在此基礎上以提取率作為評價指標進行正交實驗，結果見表5、表6。

表5 正交實驗設計與結果分析

表6 方差分析表

由表5可知，各因素影響順序依次為：C＞A＞B，即料液比＞超聲溫度＞超聲時間，由表6的進一步方差分析得知，超聲溫度和料液比對波棱瓜子多糖提取有顯著性影響。根據正交實驗結果，波棱瓜子多糖超聲提取最優方案是A1B1C1，即在60 ℃水溫，超聲功率300 W的條件下，以料液比1：10，超聲提取20 min。在最優提取方案下超聲提取多糖的提取率為1.39%。

2.4.3 驗證實驗

表7 不同方法提取波棱瓜子多糖的比較(n=3)

3 結論與討論

本實驗比較了2種不同方法提取波棱瓜子多糖，回流提取法所得工藝的最優組合是在100 ℃水浴條件下，以料液比1：40(g：mL)，提取時間3 h，提取2次，波棱瓜子多糖的平均提取率為 1.47 %。超聲波輔助提取法的最優工藝參數為在60 ℃水溫，300 w超聲功率條件下，以1：10(g：mL)的料液比，提取1次，每次提取20 min，波棱瓜子多糖的平均提取率為 1.32 %，回流提取法提取率比超聲法提取率高11%，但差異性不顯著。

回流提取多糖成本較低，不需要特殊設備，但需較高溫度，提取時間較長。而超聲法提取多糖能源消耗少，提取時間短，操作簡單，但超聲波的機械剪切作用，可能導致多糖分子結構的改變。綜上所述，不同的提取工藝各具優勢，在今后的研究和生產中可根據實際情況選擇合適的提取工藝。

[1] 楊永昌.藏藥志[M].青海人民出版社.第一版,1991：441.

[2] 陳璐,張梅,李春沁,等. 波棱瓜子乙酸乙酯提取物對小鼠免疫性肝損傷的影響[J]. 中藥藥理與臨床,2014,03：111-113.

[3] 陳璐,張梅,雷有成,等. 波棱瓜子脂肪油抗免疫性肝損傷的譜效關系研究[J]. 中國實驗方劑學雜志,2014,11：123-126.

[4] 李春沁,王紫燕,唐慧君,等. 波棱瓜子多糖對刀豆蛋白A所致小鼠免疫性肝損傷的保護作用[J]. 中藥藥理與臨床，2015,04：94-97.

[5] 程振玉,宋海燕,楊英杰,等. 不同提取方法對北五味子多糖提取率的影響[J]. 湖北農業科學,2015,01：159-163+167.

[6] 王廣慧,戴明,魏雅冬. 香菇多糖的提取工藝研究[J]. 食品科技,2013,01：192-194.

[7] 王月囡,辛廣,翁霞. 兩種不同方法提取枸杞多糖的比較研究[J]. 鞍山師范學院學報,2010,04：39-43.

[8] 勾建剛,劉春紅. 白茅根多糖超聲提取的優化[J]. 時珍國醫國藥,2007,11：2749-2750.

Study on the effect of different extraction process on extraction ratio of polysaccharide from Bolengguazi/

LIU Mei-lin,DONG Jia-yue, AN Tai-yong, LI Yang, ZHANG Mei//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine;Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: The effect of various extraction (re fl ux extraction, ultrasonic assisted extraction) process on extraction ratio of polysaccharide from Bolengguazi was studied. Method: The content of polysaecharides were detected by phenol—sulfuirc acid colorimetrictitration method. The best extraction process was determined by orthogonal experiment based on the result of single factor experiment. Result: The best extraction process for reflux extraction method was to extract 2 times (3 h/times) with the ratio of material to liquid for 1：40 (g：mL) in 100 ℃water bath. The extraction rate of polysaccharide reached 1.47% under the best condition. The best process for the ultrasonic assisted extraction method was to extract 1 times (20 min/times) with the ratio of material to liquid for 1：10 (g：mL) in 60℃ water bath, ultrasonic power 300 W. And the extraction rate of polysaccharide reached 1.32% under the best condition. Conclusion: The re fl ux extraction yield increase nearly 11% compared with that of ultrasonic assisted extraction. However, there is no significant difference between the two extraction methods in extraction efficiency of Bolengguazi polysaccharide .

Bolengguazi; polysaccharide; orthogonal test; re fl ux extraction；ultrasonic assisted extraction

R 283.6

A

1674-926X(2017)04-008-03

四川省科技支撐項目(2013SZ0114)

成都中醫藥大學 中藥材標準化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統研究與開發利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地 四川 成都 611137

劉美琳，中藥學專業在讀碩士Tel：18782984265 Email：674894419@qq.com

張梅，教授，博士生導師Tel：028-61800231 Email： zhangmei63@126.com

2017-1-15

(責任編輯：傅舒)