中藥淫羊藿薄層色譜鑒別方法的建立

謝媛媛，彭靈，蘇加坤，羅娟敏，王義明，郭磊，蔡繼寶，羅國安

中藥淫羊藿薄層色譜鑒別方法的建立

謝媛媛1，彭靈1，蘇加坤2，羅娟敏2，王義明3，郭磊2，蔡繼寶2，羅國安1

目的：建立淫羊藿薄層鑒別方法。方法：以朝藿定A、朝藿定C和淫羊藿苷混合溶液為對照品，對淫羊藿進行薄層鑒別，并考察了不同點樣量、不同薄層板、不同溫度及不同濕度對淫羊藿薄層鑒別的影響。結果：以朝藿定A、朝藿定C和淫羊藿苷混合溶液為對照品，以甲醇∶丁酮∶氯仿∶水（4∶6∶6∶1）為展開系統，5 μL點樣量點樣于Merck硅膠鋁箔板時，所得的薄層色譜斑點清晰，專屬性強。結論：該鑒別方法操作簡便，重復性好，可作為淫羊藿的薄層鑒別方法。

淫羊藿；朝藿定A；朝藿定C；淫羊藿苷；薄層鑒別

淫羊藿Epimedii Folium藥材來源復雜，2015年版《中國藥典》規定：淫羊藿為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxi. 或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥葉[1]。2001年出版的《中國植物志》記載的淫羊藿主要種類有7種：箭葉淫羊藿、淫羊藿、粗毛淫羊藿、朝鮮淫羊藿、柔毛淫羊藿、黔嶺淫羊藿及巫山淫羊藿[2]。淫羊藿是我國傳統的補益中藥，具有補腎陽、強筋骨、祛風濕等功效，在陽痿、遺精、筋骨酸軟、手足麻木拘攣、更年期高血壓、心腦血管疾病[3,4]、提高機體免疫力[5,6]、抗腫瘤[7]及抗衰老[8]等方面有著顯著的療效[9]。

淫羊藿中成分主要為含有異戊烯基取代的黃酮類化合物。包括淫羊藿苷、寶藿苷I、寶藿苷II、寶藿苷V、淫羊藿次苷I、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、脫水淫羊藿素、去甲基脫水淫羊藿素、大花淫羊藿苷B、大花淫羊藿苷C、大花淫羊藿苷F、淫羊藿次苷、箭藿苷A、箭藿苷B等[10]。薄層色譜法操作簡便、設備簡單、成本相對低廉、分離快速，被廣泛應用于中藥鑒別領域。本實驗對淫羊藿進行薄層色譜鑒別，是為了有效地控制其質量，為淫羊藿的質量控制提供參考依據。

1 儀器與材料

電子精密天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；KM-12A型超聲波清洗機（廣州市科潔盟實驗儀器有限公司，功率60W，頻率40KHz）；SP-20E型全自動點樣儀（上海科哲生化科技有限公司）、GoodSee-20E薄層色譜成像系統（上海科哲生化科技有限公司）、25 μL微量進樣針（寧波市鎮海玻璃儀器廠）；101-1AB型電熱鼓風干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；硅膠G板（北京和信同通科技發展有限公司）；硅膠GF254鋁箔板、硅膠GF254玻璃板（德國Merck公司）。

朝藿定A（純度99.25%，批號 110623-72-8）、朝藿定C（純度 98.93%，批號 110642-44-9）和淫羊藿苷（純度 99.31%，批號 489-32-7）均購于四川省維克奇生物制藥有限公司；淫羊藿對照藥材（批號：Z09S7B20761）購于上海源葉生物科技有限公司；水為超純水；其他試劑均為分析純。淫羊藿藥材經清華大學化學系分析中心謝媛媛鑒定為小檗科植物淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.、箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.）Maxim.、柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxi.、巫山淫羊藿Epimedium wushanense Ying和朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥葉。

2 方法與結果

2.1 薄層色譜條件的考察

2.1.1 藥材供試品及對照藥材溶液的制備 取淫羊藿粉末1 g，加甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過，取濾液作為供試品溶液。另取淫羊藿對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別取朝藿定A、朝藿定C和淫羊藿苷各1mg混溶于1 mL甲醇，作為混合對照品溶液。

圖1 點樣量的考察

2.1.3 點樣量的考察 分別吸取2 μL、5 μL、8 μL、10 μL淫羊藿供試品溶液點樣于同一薄層板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開劑，展開，取出，晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點顯色清晰，置于紫外光燈（365nm）下檢視。結果見圖1。結果表明，點樣量為5 μL時斑點較清晰、無暈染情況，故確定供試品的點樣量為5 μL。2.1.4條帶寬度的考察 吸取淫羊藿供試品溶液分別以5 μL點樣量點2 mm、4 mm、6 mm、8 mm、10 mm的條帶于同一薄層板上，以甲醇∶丁酮∶氯仿∶水（4∶6∶6∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點顯色清晰，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結果見圖2。結果表明，條帶寬度為10mm時，斑點較清晰、無暈染情況，故確定點樣的條帶寬度為10 mm。

圖2 條帶寬度的考察

2.2 方法學考察

2.2.1 穩定性考察 取同一批淫羊藿藥材，按2.1.1供試品溶液制備方法，制備4份供試品溶液，分別于室溫下保存不同時間（0天、1天、2天、3天）。吸取對照品溶液和上述4份供試品溶液各5 μL，點于同一薄層板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開劑，展開，取出，晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點顯色清晰，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結果見圖3。結果表明，在3天內供試品溶液穩定性良好。

圖3 穩定性考察

2.2.2 耐用性考察

（1）不同薄層板的考察 吸取混合對照品溶液、淫羊藿對照藥材溶液、淫羊藿供試品溶液各5 μL，點樣于3種不同的薄層板（Merck硅膠鋁箔板、Merck硅膠玻璃板和北京硅膠G板）上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開系統，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點顯色清晰，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結果見圖4。結果表明，Merck硅膠鋁箔板的分離效果優于Merck硅膠玻璃板和北京硅膠G板。

圖4 淫羊藿在Merck硅膠鋁箔板 (A)、Merck硅膠玻璃板(B)、Merck硅膠玻璃板(C)上展開的薄層色譜圖

（2）不同展開溫度的考察 吸取混合對照品溶液、淫羊藿對照藥材溶液、淫羊藿供試品溶液各5 μL點于3塊Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開系統，分別在4 ℃、室溫（25 ℃）、32 ℃的條件下展開，取出，晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結果見圖5。結果表明，展開溫度對展開效果影響不大，故選擇室溫（25 ℃）下展開。

圖5 淫羊藿在4 ℃ (A)、25 ℃ (B)、32 ℃(C)下展開的薄層色譜圖

（3）不同展開濕度的考察[11]吸取混合對照品溶液、淫羊藿對照藥材溶液、淫羊藿供試品溶液各5 μL點于3塊Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開系統，分別在相對濕度32%、58%、88%的條件下展開，取出，晾干，再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結果見圖6。結果表明，相對濕度對展開效果及斑點的清晰度影響較小。

圖6 淫羊藿在32% (A)、58% (B)、88% (C)濕度下展開的薄層色譜圖

2.3 淫羊藿藥材的薄層鑒別

2.3.1 箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.）Maxim. 按照2.1和2.2確定的色譜條件，將對照品溶液、對照藥材溶液及供試品藥材點于Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開系統，展開，取出，晾干。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結果見圖7、圖8。

圖7 第1～6批箭葉淫羊藿TLC圖

圖8 第7～12批箭葉淫羊藿TLC圖

2.3.2 朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai 按照2.1和2.2確定的色譜條件，將對照品溶液、對照藥材溶液及供試品藥材點于Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開系統，展開，取出，晾干。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結果見圖9、圖10。

圖9 第1～6批箭葉淫羊藿TLC圖

圖10 第7～9批朝鮮淫羊藿TLC圖

2.3.3 巫山淫羊藿Epimedium wushanense Ying 按照2.1和2.2確定的色譜條件，將對照品溶液、對照藥材溶液及供試品藥材點于Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開系統，展開，取出，晾干。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結果見圖11。

圖11 第1～4批巫山淫羊藿TLC圖

2.3.4 淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim. 按照2.1和2.2確定的色譜條件，將對照品溶液、對照藥材溶液及供試品藥材點于Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開系統，展開，取出，晾干。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結果見圖12。

圖12 第1～3批淫羊藿TLC圖

2.3.5 柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxi. 按照2.1和2.2確定的色譜條件，將對照品溶液、對照藥材溶液及供試品藥材點于Merck硅膠鋁箔板上，以甲醇：丁酮：氯仿：水（4：6：6：1）為展開系統，展開，取出，晾干。再噴以10%硫酸乙醇溶液，在110 ℃加熱至斑點顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視，結果見圖13。

圖13 柔毛淫羊藿TLC圖

以上箭葉淫羊藿Epimedium sagittatum (Sieb.et Zucc.）Maxim.、朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai、巫山淫羊藿Epimedium wushanense Ying、淫羊藿Epimedium brevicornu Maxim.和柔毛淫羊藿Epimedium pubescens Maxi.的薄層色譜結果表明，本實驗所建立的淫羊藿薄層色譜鑒別方法分離度高，重現性好，可用于淫羊藿藥材的鑒定并為淫羊藿藥材的質量控制提供參考依據。

3 討論

3.1 本實驗前期參考相關文獻[11,12,13]，對淫羊藿供試品制備方法中提取溶劑（50% 甲醇、甲醇、50%乙醇、乙醇）、溶劑體積（5 mL、10 mL、15 mL）及超聲處理時間（30 min、40 min、50 min）進行了考察。實驗結果表明，以10 mL甲醇作為溶劑，超聲30 min時薄層展開效果最佳。

3.2 實驗中對淫羊藿的薄層鑒別方法中的點樣量（2 μL、5 μL、8 μL、10 μL）、條帶寬度（2mm、4mm、6mm、8mm、10mm）、不同薄層板（Merck硅膠鋁箔板、Merck硅膠玻璃板、北京硅膠G板）、不同展開溫度（4 ℃、25 ℃、32 ℃）及不同展開濕度（32%、58%、88%）進行了考察，結果表明點樣量為5 μL，點樣于Merck硅膠鋁箔板時效果最好，而溫度和濕度對淫羊藿薄層色譜的展開影響較小；對各批不同種的淫羊藿進行薄層鑒別，色譜斑點明顯、分離效果好。本實驗建立的淫羊藿薄層色譜鑒別方法朝藿定A、朝藿定C及淫羊藿苷斑點清晰，重復性好，可作為淫羊藿藥材的一種鑒定方法，為淫羊藿藥材的質量控制提供參考依據。

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Establishment of TLC identi fication method of Yinyanghuo/

XIE Yuan-yuan1, PENG Ling1, SU Jia-kun2, LUO Juan-min2,WANG Yi-ming3, GUO Lei2, CAI Ji-Bao2, LUO Guo-an1//(1. Department of Chemistry, Tsinghua University, Beijing 100084, China.2.Tobacco Jiangxi Industrial Co., Ltd., Nanchang 330096, Jiangxi. 3. Zhuhai Qingda Hongrui Biotechnology Co., Ltd., Zhuhai 519085, Guangzhou)

Objective: To establish a TLC method for the identification of Yinyanghuo. Method: The TLC was used to identify epimedin A, epimedin C and icariin. The effect of volume of application, thin layer plates, temperature and humidity on the TLC identi fication of Yinyanghuo were investigated. Result: With epimedin A, epimedin C and icariin as the reference substances, 5 μL volume of application, TLC spots on the Merck silica gel aluminum foil plate were clear and TLC identi fi cation of Yinyanghuo was high specific with Methanol-butanone-chloroform-water (4：6：6：1) as the developing system. Conclusion: The method established for Yinyanghuo is feasible and reproducible, and can be used for Yinyanghuo identification.

Yinyanghuo; epimedin A; epimedin C; icariin; TLC identi fi cation

R 284.1

A

1674-926X(2017)04-006-05

中國煙草總公司重大專項項目[項目編號：110201401025(JH-03)]

1.清華大學化學系，北京，100084；2.江西中煙工業有限責任公司，江西 南昌 330096；3.珠海清大弘瑞生物科技有限公司，廣東 珠海 519085

謝媛媛（1980-），女，博士，主要從事中藥質量分析研究Tel： 010-62772264 Email：yuanyuan_sy@tsinghua.edu.cn

王義明（1945-），女，本科，主要從事生命分析化學研究Tel：010-62781688 Email：wangyim@tsinghua.edu.cn

2017-03-10

（責任編輯：蔣淼）