藏茵陳4種有效成分的含量測定

張慧，楊孟妮，李洋，劉娟，李文婷，夏厚林

藏茵陳4種有效成分的含量測定

張慧，楊孟妮，李洋，劉娟，李文婷，夏厚林

目的：建立藏茵陳4種有效成分的含量測定方法，并測定10批不同來源的含量。方法：采用HPLC（高效液相色譜法）法，同時測定藏茵陳中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷和芒果苷的含量，采用C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)，以甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫，檢測波長238 nm（獐牙菜苦苷）、274 nm（龍膽苦苷）、246 nm(獐牙菜苷)和258 nm（芒果苷）。結果：建立了HPLC法同時測定藏茵陳中四種有效成分含量的方法，四種成分分離度良好，方法學考察符合要求。結論：本方法操作簡便，結果準確，重復性好，可靠性好，可用于同時測定藏茵陳中四種有效成分的含量。

藏茵陳；有效成分；HPLC；含量測定

藏茵陳為多基源藥材，本研究所用藏茵陳（Artemisiae)為來源于龍膽科(Gentianaceae)獐牙菜屬（Swertia)植物川西獐牙菜（Swertia mussotii Franch.)印度獐牙菜（Swertia chirayita (Roxb.ex Flemi)Karste.)的干燥全草。藏茵陳是貴重的八珍藏藥之一，藏藥名為蒂達，為藏藥中最具特色的治療‘赤巴’病，清諸熱，治血病，膽病等的常用藥[1]。藏醫所說的赤巴諸癥與漢醫理論中的中焦諸病略同，特別是廣義的肝膽癥更接近赤巴癥。查閱相關文獻，其所含獐牙菜苦苷主要具有清熱、消炎等生理作用[2～5]。獐芽菜苷能有效保護肝細胞，并能促進細胞修復[6,7]，龍膽苦苷具有保肝、健胃、抗氧化等作用[8]，芒果苷主要具有抗氧化[9,10]、抗結核[11]和抗菌作用[12,13]以及保肝利膽作用。

根據本課題組前期藥理篩選顯示其活性成分集中在大極性部位。由于上述4種成分在大極性部位含量相對較高，而其藥理作用又與古籍記載的清肝膽，解諸熱等功效息息相關，因此對該4種成分進行含量測定，有著重要的意義。由于HPLC法常用于單體成分含量的測定，故本實驗擬采用HPLC法建立同時測定4種有效成分含量的方法。本方法準確可靠，穩定性好，可用于藏茵陳的質量評價。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BS124S電子分析天平（十萬分之一，賽多利斯科學儀器，北京有限公司)，HPLC高效液相色譜儀（Agilent Technologies 1200 Series)，KQ-600DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑

獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、芒果苷（購自成都曼斯特生物科技有限公司 中國科學院成都生物研究所，經HPLC面積歸一化法檢測含量達到98%以上)，甲醇（色譜純)，磷酸（色譜純)，水（超純水)，其他試劑均為分析純。

1.3 藥材

藥材來源見表1，S1、S3、S6和S10藥材經成都中醫藥大學盧先明教授初步鑒定為龍膽科獐牙菜屬植物川西獐牙菜的干燥全草；S2、S4、S5、S7、S8和S9藥材初步鑒定為龍膽科獐牙菜屬植物印度獐牙菜的干燥全草；S11為S1的花葉部分；S12為S1的根莖部分。

表1 實驗用藏茵陳樣品來源

2 方法與結果

2.1 樣品制備

2.1.1 混合對照品溶液 精密稱量獐牙菜苦苷，龍膽苦苷，獐牙菜苷和芒果苷對照品各適量，加甲醇配制成混合對照品儲備液，取適量儲備液稀釋至每1 mL含獐牙菜苦苷0.2 mg，龍膽苦苷0.06 mg，獐牙菜苷0.14 mg，芒果苷0.5 mg，即得混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 取本品粉末（過四號篩)約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，超聲處理（功率600W，頻率40kHz)1h，過濾，加甲醇定容至25 mL，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續濾液，即得供試品溶液。

2.2 方法學考察

2.2.1色譜條件 以島津Inertsil ODS-3 C18（250*4.6mm，5μm)為色譜柱，甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫；檢測波長238 nm（獐牙菜苦苷)、274 nm (龍膽苦苷)、246 nm（獐牙菜苷)和258 nm（芒果苷)；流速：1.0 mL﹒min-1；柱溫：25℃；進樣量：20 μL；采集時間：30 min，洗脫程序見表1。在此條件下藏茵陳中獐牙菜苦苷（保留時間為：12.08 min)，龍膽苦苷（保留時間為：16.12 min)，獐牙菜苷（保留時間為：18.87 min)，芒果苷（保留時間為：26.67 min)與其他組分在30 min內均能達到基線分離(見圖1)

表1 流動相比例表

圖1 藏茵陳對照品HPLC色譜圖

圖2 藏茵陳樣品HPLC色譜圖

2.2.2 線性關系的考察 分別取‘2.1.1’項下混合對照品溶液0.5mL、2mL、3mL、3.3mL、3.6mL、4mL，加相應溶劑至4mL。分別進樣20 μL。以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積（A)為縱坐標繪制標準曲線，并計算回歸方程見表2。結果表明獐牙菜苦苷在0.5μg～4 μg，龍膽苦苷在0.15μg ～1.2 μg，獐牙菜苷在0.35μg ～2.8 μg，芒果苷在1.25μg ～10 μg之間有較好的線性關系。

表2 藏茵陳中4種成分線性回歸方程

2.2.3 精密度試驗 精密吸取上述混合對照品溶液，按“2.2.1”條件重復進樣6次測定峰面積，結果對照品中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的RSD分別為0.67%，0.71%，0.70%，0.85%，表明方法精密度良好。

2.2.4 穩定性試驗 精密吸取‘2.1.2’中供試液溶液20 μL，按“2.2.1”條件分別于0 h，2 h，4 h，8 h，12 h，24 h進樣測定峰面積，結果樣品中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的RSD分別為0.69%，1.26%，1.57%，0.71%，表明供試品溶液在24 h內保持穩定。

2.2.5 重復性試驗 取同一樣品粉末6份，各約0.5 g，精密稱定，制備成供試品溶液，按“2.2.1”條件進行測定，結果獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的RSD分別為1.31%，1.40%，1.26%，1.28%，表明方法重復性良好。

2.2.6 加樣回收試驗 精密稱定已知含量的藥材粉末0.25g共6份，精密加入適量獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、芒果苷對照品按供試品溶液制備及測定法操作，進行色譜分析，結果獐牙菜苦苷、龍膽苦苷、獐牙菜苷、芒果苷的平均回收率分別為95.31%，92.70%，91.95%，94.87%，RSD分別為1.11%，1.05%，1.03%，0.54%，表明方法準確度良好。

2.3 樣品測定

準確吸取‘2.1.2’項下供試品溶液各20 μL, 注入液相色譜儀, 按測定法進行測定。結果見表3。由表可見不同來源的藏茵陳各有效成分的含量相差較大。

表3 樣品中各有效成含量（n=3)

3 討論

3.1 本實驗對10批藏茵陳全草開展了4種有效成分的含量測定，由表3結果橫向觀察顯示：10個樣品中4種有效成分含量的高低順序都呈現出芒果苷＞獐牙菜苦苷＞獐牙菜苷＞龍膽苦苷；縱向觀察顯示：獐牙菜苦苷和芒果苷含量最高的批次都為購自西藏的1601（編號S3)，龍膽苦苷含量最高的批次為購自西藏的1511（編號S1)，獐牙菜苷含量最高的批次為購自西藏的1603（編號S10)，4種成分含量最低的批次都為購自新都的1602（編號S2)。總體來說各有效成分含量最高的批次都為西藏采購，說明西藏采購的質量較優。該含量差異可能與基源、環境以及采收加工有關。

3.2 獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷都屬于環烯醚萜苷類，該三成分的含量總和顯示：S1、S3、S6和S10的全草樣品普遍高于其他6個批次全草樣品，結合基源鑒定結果初步說明川西獐牙菜環烯醚萜苷類含量可能高于印度獐牙菜。該含量差異主要與基源不同有關，提示了明確藥材的來源對藏茵陳研究的重要性。

3.3 本實驗對S1藥材進行了分部位研究，由表3結果顯示橫向對比：分部位研究也符合4種有效成分含量芒果苷＞獐牙菜苦苷＞獐牙菜苷＞龍膽苦苷的分布；縱向比較S1、S11和S12顯示：獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和芒果苷含量都為S11（花葉)＞S1（全草)＞S12（根莖),龍膽苦苷含量則為S12（根莖)＞S11（花葉)，該結果初步提示藏茵陳中獐牙菜苦苷、獐牙菜苷和芒果苷成分主要存在于花葉中，龍膽苦苷主要存在于根莖中。藏茵陳的臨床用藥都是全草入藥，由于市場上購買的樣品大部分都是經過產地加工后將根莖花葉分離，導致臨床用藥可能因為取藥不均導致質量不一，分部位研究可以有效的指導臨床用藥。由于本實驗對分部位研究僅進行了一個初探，進一步確證需要加大批次進行研究。

3.4 芒果苷屬于口山酮類，獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷屬于環烯醚萜苷類，由表可知每個樣品都呈現出芒果苷單體的含量大于另外三個環烯醚萜苷總和的含量，提示芒果苷在該兩個來源中的重要性，推測可能為其主要活性成分。

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Determination of four active ingredients of Zangyinchen/

ZHANG Hui,YANG Meng-ni, LI Yang, LIU Juan, LI Wen-ting,XIA Hou-lin//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan )

Objective: To establish determination method of four effective components in Zangyinchen, and detect the content 5 of 10 batches samples from different sources. Method: High performance liquid chromatography (HPLC) method was used for the simultaneous determination of swertiamarin, gentiopicroside, swertiamarin and mangiferin in Zangyinchen on C18 column (4.6 mm × 250 mm, 5 μm), with methanol-0.1% phosphoric acid water solution as mobile phase in gradient elution. The detection wavelength was set at 238 nm (swertiamarin) , 274 nm (gentiopicroside), 243 nm (sweroside) and 258 nm (mangiferin).Result: The HPLC simultaneous determination of four effective components in Zangyinchen was established with good separation,and met the methodological requirements. Conclusion: The method is simple, accurate with ood repeatability and reliability, which can be used for the simultaneous determination of four effective components in Zangyinchen.

Zangyinchen; effective components; HPLC; determination of content

A

1674-926X(2017)04-004-04

成都中醫藥大學，中藥材標準化教育部重點實驗室, 四川省中藥資源系統研究與開發利用重點實驗室—省部共建國家重點實驗室培育基地。

張慧(1991—），女，藥物分析碩士，主要從事中藥質量控制研究。Tel：13880459062 Email：zhanghui9101@163.com

夏厚林(1964—)，男，教授，主要從事藥物分析學、物理化學研究。Tel：13568899011 Email：XHL64@163.com

2016-08-08

（責任編輯：李蕓霞)