川貝母組織培養的影響因素研究

王偉，張大燕，文歡，汪頎浩，彭成，高繼海

【研究論著】

川貝母組織培養的影響因素研究

王偉，張大燕，文歡，汪頎浩，彭成，高繼海

目的：以川貝母鱗莖外表基部為材料，研究激素、暗處理時間與低溫處理溫度對鱗莖誘導效果的影響，為川貝母組培技術應用研究提供參考。方法：通過采用組織培養的方法，比較無菌處理的外植體在不同培養方式中的生長情況，并簡要分析川貝母組織培養的影響因素。結果：低溫暗處理，GA3均有利于打破鱗莖休眠，加快分化速度，同時GA3有提高愈傷組織誘導率的效果；這批試驗樣本中，愈傷組織誘導率最高為80.2%，不定芽誘導率最高為79.3%。結論：誘導生成不定芽的最佳激素配比為6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg﹒L-1，誘導鱗莖生成愈傷組織的最佳激素配比為6-BA 1 mg﹒L-1+ NAA 2 mg﹒L-1+ GA3 1 mg﹒L-1；低溫暗處理誘導鱗莖分化效果最佳的組合為4 ℃+5 d。

川貝母；鱗莖；組織培養；影響因素；應用

川貝母（Fritillaria cirrhosa）為百合科植物，在云南、四川等地有栽培。其鱗莖有清熱潤肺，化痰止咳，祛瘀解結、降壓解痙等功效[1]。川貝母對于生長環境要求較高，野生植株相對較少，由于其藥用價值極高，近年來遭到人們大量采挖，造成了野生資源的極其匱乏。現在部分地區開始采用人工種植的方式來解決此問題，然而其繁殖系數小、發育周期長、種植成本高等因素大大的降低了此方法的可行性[2]。

近年來，組織培養技術的成功應用有望解決貝母資源匱乏的問題。根據現有資料，外植體再生鱗莖最普遍的處理是將外植體接入培養基讓其表面直接長出小鱗莖或小芽，在短時間內可以得到大量的鱗莖[3]。郭生楨等學者研究發現5種貝母的幼鱗片誘導率最高[4]。目前關于川貝母的組織培養研究尚未系統進行，因此，針對現有研究空白，本實驗研究了關于川貝母組織培養的一些影響因素并做簡要分析，為川貝母后續研究提供參考，以期進一步推動川貝母資源的開發利用。

1 材料、儀器、試劑

1.1 材料

樣品采自甘孜州康定市，采集時間為出苗盛期，經成都中醫藥大學藥學院裴瑾教授鑒定為川貝母（Fritillaria cirrhosa）。

1.2 儀器

HIRAYMA HVE-50滅菌器（華粵行儀器有限公司）、1300系列A2生物安全柜（賽默飛世爾科技公司）、JA2003B電子天平（上海越平科學儀器有限公司）、QHZ-98B全溫度光照振蕩培養箱（太倉市華美生化儀器廠）、智能人工氣候箱RTOP-280B（浙江托普儀器有限公司）。

1.3 試劑

MS培養基（批號20160815001，杭州百思生物技術有限公司）、6-芐基腺嘌呤（批號20150611，國藥集團化學試劑有限公司）、α-萘乙酸（批號20150617，國藥集團化學試劑有限公司）、赤霉素（批號20150519，國藥集團化學試劑有限公司）、蔗糖（CAS：57-50-1，成都市科龍化工試劑廠）、瓊脂（CAS：9002-18-0，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司），無水乙醇（CAS：64-17-5，成都科隆化學品有限公司）。

2 實驗方法

2.1 無菌處理

自來水沖洗材料2小時，刷洗掉表面的土壤雜質。選取顏色、質地相對一致的鱗莖外表基部，然后切成約6 mm 厚的小塊作為外植體。首先將材料在75%酒精中浸泡1 min，再轉入0.1%氯化汞溶液中浸泡10 min，最后在無菌水中清洗2～3次后轉入培養基中。

2.2 培養基制備

培養基配制為組織培養過程中非常重要的過程，根據現有報道分析，最適宜貝母生長的培養基為MS基本培養基，特別對于種胚成苗的高生長促進效果方面表現突出[5]，本文采用培養基為MS 4.74 g﹒L-1+蔗糖30 g﹒L-1+瓊脂4 g﹒L-1+活性炭0.3 g﹒L-1+激素。培養基配制好后，分裝至培養瓶內，121 ℃ 滅菌20分鐘后放入超凈工作臺至凝固備用。

2.3 培養條件

溫度、光照、濕度等為植物組織培養中的重要因素，其中溫度和光照是這2種環境因子不僅影響細胞增殖和器官分化,而且對次生產物的形成有很大的影響[6]，考慮川貝母生長的特殊環境，本研究在李旦[7]等相關報道的基礎上進行優化處理，光照強度2200 lx，光照16 h，暗培養8 h，散射光培養18 ℃ ± 1 ℃，濕度為49% RH。

2.4 激素的處理方式

2.4.1激素初始篩選 首先用6-BA（6-芐基腺嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）組合方式進行篩選確定激素使用范圍，每種激素選取相同的6種濃度，即0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/L，每種組合做三次重復，培養觀察，組合方式見表1。

表1 激素篩選方式

2.4.2激素正交設計 根據2.3.1的結果刪除初始設計濃度3.0 mg﹒L-1，將GA3（赤霉素）、6-BA（6-芐基腺嘌呤）、NAA（α-萘乙酸）按照正交方法設計實驗[8]，GA3的設計水平為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L，具體信息見表2。

表2 激素正交設計方案

2.5 培養方式

以往報道提出低溫和暗處里均可以打破貝母鱗莖休眠，加快分化速度，根據已有研究，本文選出2.3.1中愈傷組織誘導率及不定芽誘導率最高的兩組激素組合進行不同的低溫暗處理培養，處理方式見表3。

表3 低溫暗處理方式

3 結果與分析

觀察在不同的培養方式下組織的生長情況，不定芽與愈傷組織分別見圖1-A、1-B。結果發現有GA3的對照組和經過低溫暗處理的對照組分化速度明顯快于只含NAA、6-BA的實驗組，而且含GA3的培養基中愈傷組織誘導率明顯提高。35天后（不包括低溫暗處理時間）對川貝母生長情況進行統計，在不含在有GA3的培養基中，激素組合6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg﹒L-1能夠很好誘導不定芽生長，激素組合6-BA 1 mg﹒L-1+ NAA 2 mg﹒L-1能夠較好誘導愈傷組織的形成；添加GA3后，6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg·L-1+ GA3 0.5 mg·L-1 的培養基不定芽誘導率最高，其不定芽誘導率達到60.5%，但是低于此培養基不加GA3時的不定芽誘導率，推測GA3 有抑制不定芽發育的效果；誘導鱗莖生成愈傷組織的最佳激素配比為6-BA 1 mg﹒L-1+ NAA 2 mg﹒L-1+ GA3 1 mg﹒L-1；低溫暗處理誘導效果最佳的組合為4 ℃+5 d。6-BA+NAA、6-BA + NAA + GA3、6-BA+ NAA+低溫暗處理 這3種方式的最佳處理結果見表4。

圖1 川貝母在不同環境的生長情況

表4 三種方式最佳處理結果

愈傷形成率（%）=（長有愈傷組織的外植體數 /全部的外植體數）×100%

不定芽形成率（%）＝（產生芽的外植體數 / 全部外植體數）×100%（同時形成不定芽和愈傷的材料也納入統計）

4 討論

4.1 激素的影響

植物組織培養與多種激素同時存在關系，本實驗在研究不同因素對川貝母分化效果比較的過程中發現，GA3不僅可以打破鱗莖休眠，加快分化速度，還能誘導材料形成愈傷組織，這與樊軍[9]、熊增芳[6]等的報道相似，由此推測GA3本身或者與其它激素結合使用時有提高愈傷組織誘導率的效果。誘導生成不定芽的最佳激素配比為6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg﹒L-1，6-BA與 NAA濃度比為4：1，沈海龍[10]指出當細胞分裂素與生長素比例較高時利于芽的分化的結論與本實驗結果吻合。研究發現[11]，植物體內的細胞分裂素由5，-腺苷單磷酸（5，-AMP）與二甲基丙烯基（DMAPP）經過一系列酶催化反應得到，中間會產生核糖、磷酸基團等物質，同時伴隨著一系列酶的失活與活化，這些物質都有可能引起組織體內基因的表達，如果使用不同濃度的激素時，產生的效果自然不同。關于生長素的研究報道甚少，不過已有研究證明生長素可以作用位于質膜上的H+-ATP酶（P型ATP酶），這個酶能通過酸化質外體來增加細胞壁的伸展。目前植物激素對于其生長的詳細調控機制尚未研究清楚，例如細胞分裂素和生長激素一起使用可以促進細胞的分裂也會影響植物細胞的分化，同時激素之間的相互作用機制也非常復雜。但值得一提的是，通過不斷的實驗研究可以找到最佳的貝母組織培養方案，為后續研究提供參考。

4.2 低溫黑暗的影響

大量研究表明，黑暗和光照條件下低溫處理植物對其代謝機制有重大影響，植物激素及其它內源性物質在低溫黑暗環境下所起的作用和含量都會發生變化。例如常見的生長抑制激素脫落酸，相關報道指出其代謝變化與低溫信號存在密切聯系[12]，此外，對于低溫誘導組織萌發或開花有研究者認為是赤霉素參與了成層以及春化過程[11]，因為不經過冷處理而直接施加赤霉素也可以獲得同樣的效果，但是目前仍未搞清赤霉素介導了溫度刺激的原因。李招弟在紅花幼苗研究中發現，低溫暗處理的幼苗的生理指標與對照組相比差異明顯[13]，結果證明低溫黑暗處理確實對植物自身調節的影響較大。因此，若在鱗莖培養初始階段設置一個低溫黑暗的信號，該信號通過影響植物代謝過程而改變某些物質的含量和活性，再加上合適的生長環境，鱗莖做出應答的速度和概率都會提高。這與貝母鱗莖長期生長在地表以下，幾乎不見光照的生活環境也是密切相關的。

近年來，關于川貝母的組織培養研究尚未系統進行，例如內源與外源激素之間的聯系、激素種類等方面的研究尚未進行，大多研究僅僅針對分化的某個環節，對于外植體的前期處理研究更是甚少。本研究將激素與低溫黑暗處理等因素同時結合起來考慮有望成為川貝母組織培養的研究熱點，一旦川貝母的組織培養技術能夠全面應用，將會很大程度上推動農業經濟以及醫藥行業的發展。

[1] 李 強. 組培川貝母(Fritillaria Cirrhosa D.Don)鱗莖形成和發育過程中的生理生化研究[D]. 四川大學, 2003.

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Study on the influencing factors of Chuanbeimu tissue culture/

WANG Wei, ZHANG Da-yan,WEN Huan, WANG Qihao, PENG Cheng, GAO Ji-hai//(School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine; Key Laboratory of Standardization for Chinese Herbal Medicine, Ministry of Education; National Key Laboratory Breeding Base of Systematic Research, Development and Utilization of Chinese Medicine Resources, Chengdu 611137, Sichuan)

Objective: With Chuanbeimu bulb appearance base as the materials, the effects of hormone, dark processing and low temperature on the bulb was investigated to provide a reference for the tissue culture technology of Chuanbeimu. Method:Using tissue culture method, the growth conditions of explants in different culture medium were compared and the influence factors of Chuanbeimu tissue culture was analyzed. Result: Low temperature, dark environment and GA3 were conductive to break the dormancy of the bulb and accelerate the differentiation rate. GA3 also improved the frequency of callus induction. In these samples, the highest frequency of callus induction was 80.2%, and the highest rate of adventitious buds inductivity was 79.3%.Conclusion:The best hormone combination for inducing buds from bulb is 6-BA 2 mg﹒L-1+ NAA 0.5 mg﹒L-1. The best hormone combination for inducing callus formation from bulb is 6-BA 1 mg﹒L-1+ NAA 2 mg﹒L-1+ GA3 1 mg﹒L-1. The optimum combination of low temperature and dark environment for inducing bulb is 4 ℃ +5 d.

Chuanbeimu; bulb; tissue culture; in fl uence factor; application

R 282.2

A

1674-926X(2017)04-001-03

成都中醫藥大學藥學院 中藥材標準化教育部重點實驗室 四川省中藥資源系統研究與開發利用重點實驗室省部共建國家重點實驗室培育基地，四川 成都 611137

王偉（1995-），男，在讀學士，研究方向：生藥學 Tel：18980924453 Email：1185213978@qq.com

高繼海（1983-），男，博士，研究方向：分子生藥學 Tel：13709094661 Email：271969318@qq.com

2017-03-17

（責任編輯： 胡慧玲）