p62在NSCLC組織中的表達(dá)及其與化療效果的關(guān)系

繆小輝 許 姣 周 堯 周燕娟 莊志方

p62在NSCLC組織中的表達(dá)及其與化療效果的關(guān)系

繆小輝 許 姣 周 堯 周燕娟 莊志方

目的探討自噬相關(guān)蛋白p62在非小細(xì)胞肺癌患者中的表達(dá)及其與化療效果的關(guān)系。方法選擇60例確診為NSCLC并接受聯(lián)合化療患者，并選擇同期診斷為肺部良性疾病60例患者的外周血標(biāo)本作為對(duì)照，采用免疫組化檢測(cè)各組織標(biāo)本中p62表達(dá)，ELISA檢測(cè)患者外周血p62水平。結(jié)果①與對(duì)照組相比，NSCLC組p62高表達(dá)，化療前后NSCLC患者外周血p62表達(dá)量及陽(yáng)性表達(dá)率存在顯著差異(P<0.05)；②化療有效者與無(wú)效者p62陽(yáng)性率存在顯著差異(P<0.05)。結(jié)論自噬相關(guān)蛋白p62在非小細(xì)胞肺癌呈高表達(dá)，且p62表達(dá)與NSCLC化療效果有關(guān)，可作為NSCLC腫瘤指標(biāo)及預(yù)測(cè)因子之一。

非小細(xì)胞肺癌;p62

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1588～1590)

肺癌是全世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是全球癌癥死亡的首要原因。在美國(guó)，肺癌在男性和女性的惡性腫瘤中的病死率均居第一位。在發(fā)展中國(guó)家，特別是中國(guó)，肺癌的發(fā)生率一直呈上升趨勢(shì)，到2025年我國(guó)每年肺癌患者將超過(guò)100萬(wàn)，成為世界第一肺癌大國(guó)。非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer,NSCLC)占全部肺癌約85%。NSCLC的治療在過(guò)去的幾十年并未取得突破性的進(jìn)展，即使Ⅰ期的NSCLC患者，其5年生存率也只有50%，Ⅱ期患者5年生存率只有30%，5年生存率仍然不到15%，腫瘤侵襲以及轉(zhuǎn)移是肺癌患者死亡的主要原因。因此，大量的實(shí)驗(yàn)研究都在尋求敏感性和特異性都較高的分子標(biāo)記物，可以早期診斷，評(píng)估療效和判斷預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 資料

以2014年01月至2015年09月期間在本院就診經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查確診為NSCLC的患者60例為研究對(duì)象(肺癌組)。其中男性35例，女性25例，年齡48～65歲。其中肺腺癌33例，肺鱗癌27例。選擇肺部良性疾病組作為對(duì)照組。經(jīng)病理證實(shí)為NSCLC，接受至少2個(gè)周期含鉑類(lèi)方案的聯(lián)合化療，于第1及3個(gè)周期化療前行全身檢查。化療適應(yīng)癥如下：體力狀況(PS)評(píng)分≤2分，重要臟器功能可耐受化療。符合納入標(biāo)準(zhǔn)的60名NSCLC患者，年齡48～79歲。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法 術(shù)后取部分新鮮組織標(biāo)本10%福爾馬林液固定，石蠟包埋切片；脫蠟處理；抗原修復(fù)；抗體封閉；PBS清洗3次，每次5 min；37 ℃孵育二抗(1∶1 000)；配置DAB工作液，避光反應(yīng)30 min～1 h；脫水透明，中性樹(shù)脂封片檢測(cè)。

1.2.2 ELISA檢測(cè)方法 在未進(jìn)行化療、第3個(gè)周期化療前，收集NSCLC患者外周血標(biāo)本，選擇同期診斷為肺部良性疾病患者40例作為對(duì)照(肺部良性疾病組)，治療前收集血標(biāo)本，離心(12 000 r/min,20 min)后取上清液凍存于-20 ℃。ELISA檢測(cè)NSCLC、肺部良性疾病組患者外周血蛋白p62：室溫復(fù)溫平衡30 min；p62抗原以0.5 μg/ml的稀釋濃度包被96孔板；一抗為1∶50稀釋的待測(cè)血清，100 μg/孔，PBS作為空白對(duì)照。加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本(空白對(duì)照孔不加)，37 ℃恒溫箱孵育30 min后PBS液洗板4次。加入酶標(biāo)工作液(空白對(duì)照孔不加)37 ℃恒溫箱孵育30 min，PBS液洗板4次，依次加入顯色劑，避光15 min，最后每孔中加終止液。

1.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

按照RECIST 1.1實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，化療療效評(píng)估分為：完全緩解(complete response,CR)、部分緩解(partial response,PR)、病灶穩(wěn)定(stable disease,SD)和病灶進(jìn)展(progressive disease,PD)。CR和PR定義為有效，SD和PD定義為無(wú)效。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 p62在NSCLC組織中的表達(dá)

肺鱗癌、腺癌組織中癌細(xì)胞胞質(zhì)、胞核高表達(dá)p62(棕褐色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞)，而肺部良性病變組幾乎不表達(dá)p62。

化療前后NSCLC患者外周血p62相對(duì)表達(dá)量的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。NSCLC患者化療前p62陽(yáng)性表達(dá)率為83%(50/60)，化療后p62陽(yáng)性表達(dá)率為58%(35/60)，治療前后p62陽(yáng)性表達(dá)率存在顯著差異(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.2 NSCLC外周血p62表達(dá)與化療效果的關(guān)系(表3)

60例NSCLC患者治療有效(CR+PR)35例，治療無(wú)效(SD+PD)25例。化療有效者與無(wú)效者p62陽(yáng)性表達(dá)率存在顯著差異，提示外周血中p62陽(yáng)性表達(dá)與患者化療效果顯著相關(guān)(P<0.05)。

表1 NSCLC患者治療前后外周血中p62相對(duì)表達(dá)量

表2 NSCLC患者治療前后外周血中p62陽(yáng)性表達(dá)情況(例，%)

表3 p62表達(dá)與化療效果的關(guān)系/例

3 討論

自噬(autophagy)是指從粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的無(wú)核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜包裹部分胞質(zhì)和細(xì)胞內(nèi)需降解的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)等成分形成自噬體，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新[1-2]。但很多研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞可利用增強(qiáng)的自噬過(guò)程逃離“低氧、化療”等應(yīng)激環(huán)境，成為進(jìn)展性腫瘤，但當(dāng)代謝壓力增加，尤其在細(xì)胞凋亡障礙的時(shí)候，過(guò)度激活的自噬還可以促使細(xì)胞死亡[3-4]。p62蛋白是c-myc原癌基因的表達(dá)產(chǎn)物,同時(shí)也是一種轉(zhuǎn)錄因子,在胚胎及成人部分增殖能力很強(qiáng)的組織(如腸道黏膜及皮膚)中呈高表達(dá)。通用轉(zhuǎn)錄因子2H肽1抗體(p62) 功能類(lèi)似于支架蛋白，與泛素化蛋白結(jié)合,并將其運(yùn)送至自噬小體內(nèi)降解，在自噬過(guò)程中起著轉(zhuǎn)運(yùn)和降解蛋白的功能，因此,p62是反映自噬活性的標(biāo)記蛋白[5]。近來(lái)很多研究發(fā)現(xiàn)自噬特異性底物p62的積累可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。P62在子宮頸鱗狀細(xì)胞、結(jié)腸癌、乳腺癌等癌組織細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)明顯高于正常組織[6-8]。膽囊癌組織中p62蛋白持續(xù)表達(dá)抑制自噬相關(guān)基因如Beclin1等的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的自噬活動(dòng)，同時(shí)調(diào)控NF-KB因子，促使腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[9-10]。閆兵等發(fā)現(xiàn)在腎透明細(xì)胞癌等腫瘤組織中高表達(dá)同時(shí)伴隨自噬相關(guān)蛋白的下調(diào)[11]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)證明了非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織內(nèi)自噬相關(guān)蛋白p62高表達(dá)，而癌旁正常肺組織中弱表達(dá)，提示自噬在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)水平下調(diào)。但本實(shí)驗(yàn)尚需進(jìn)一步探索自噬其他相關(guān)蛋白如Beclin-1、LC3、ATG7等在非小細(xì)胞肺癌的表達(dá)情況。顧昕等研究結(jié)果證明人肺腺癌耐多西他賽細(xì)胞SPC-A1/DTX細(xì)胞高表達(dá)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1，下調(diào)p62蛋白，同時(shí)放射治療誘導(dǎo)的自噬，為人肺腺癌細(xì)胞耐受放射治療過(guò)程提供了自我保護(hù)機(jī)制[12]。趙大海等通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)培美曲塞誘導(dǎo)A549細(xì)胞自噬體表達(dá)增加，并誘導(dǎo)自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin-1的表達(dá)，p62的表達(dá)降低。上述實(shí)驗(yàn)，提示在腫瘤放化療可誘導(dǎo)自噬的增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)臨床體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明化療可降低p62在非小細(xì)胞肺癌外周血的表達(dá)，同時(shí)證明p62的表達(dá)水平與化療效果相關(guān)。與顧昕、趙大海等實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，本實(shí)驗(yàn)提示腫瘤細(xì)胞對(duì)以鉑類(lèi)為基礎(chǔ)的化療的敏感性與自噬相關(guān)蛋白p62有關(guān)。推測(cè)，p62可作為NSCLC腫瘤指標(biāo)及預(yù)測(cè)因子之一，但自噬相關(guān)蛋白p62如何參與非小細(xì)胞肺癌發(fā)生發(fā)展的尚需進(jìn)一步研究。

[1] Shen J,He J,Tang X,et al.Role of autophagy on cobrotoxin induced cell death of A549〔J〕.Zhongguo Fei Ai Za Zhi.2013,16(7):339-344.

[2] Venanzi F,Shifrin V,Sherman M,et al.Broad-spectrum anti-tumor and anti-metastatic DNA vaccine based on p62-encoding vector〔J〕.Oncotarget.2013,4(10):1829-1835.

[3] Kenific CM,Thorburn A,Debnath J.Autophagy and metastasis:another double-edged sword〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2010,22(2):241-245.

[4] White E,DiPaola RS.The double-edged sword of autophagy modulation in cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2009,15(17):5308-5316.

[5] Fujita K,Maeda D,Xiao Q,et al.Nrf2-mediated induction of p62 controls Toll-like receptor-4-driven aggresome-like induced structure formation and autophagic degradation〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2011,108(4):1427-1432.

[6] 李曉妍,趙衛(wèi)東,周 穎.子宮頸鱗狀細(xì)胞癌中自噬標(biāo)記蛋白p62的表達(dá)及臨床意〔J〕.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志,2014,30(1):38-41.

[7] Park JM,Huang S,Wu TT,etal.Prognosticimpact of Beclin1,p62/sequestosome1 and LC3 protein expression in colon carcinomas from patients receiving 5fluorouracil as adjuvant chemotherapy〔J〕.Cancer Biol Ther,2013,14(2):100-107.

[8] Luo RZ,Yuan ZY,Li M,et al.Accumulation of p62 is associated with poor prognosis in patients with triple-negative breast cancer〔J〕.Onco Targets Ther，2013,6:883-888.

[9] Puissant A,Fenouille N,Auberger P.When autophagy mee-

ts cancer through p62/SQSTM1〔J〕.Am J Cancer Res，2012,2(4):397-413.

[10] Robin Mathew,Cristina M.Karp,Brian Beaudoin,et al.Autophagy Suppresses Tumorigenesis through Elimination of p62〔J〕.Cell，2009,137(6)：1062-1075.

[11] 閆 兵,任雅麗,何 群,等.自噬相關(guān)蛋白在腎透明細(xì)胞癌與癌旁組織中表達(dá)狀況的比較研究〔J〕.中華泌尿外科雜志，2013，34(11)：823-826.

[12] 顧 昕，陳東芹，潘半舟.自噬對(duì)人肺腺癌細(xì)胞放療敏感性的影響〔J〕.臨床腫瘤學(xué)雜志，2015，20(4):289-295.

TheExpressionofp62inNSCLCandtheRelationshipwithChemotherapy

MIAOXiaohui,XUJiao,ZHOUYao,etal.

ChangzhouWujinPeople’sHospital,Changzhou,213000

ObjectiveTo analyze autophagy-associated protein p62 in peripheral blood of patients with NSCLC and explore the relationship between the expression of p62 and the chemotherapy effect.MethodsIHC were adopted to detected expression levels of p62 in NSCLC lung tissues.Enzyme-linked immunosorbent assay was applied to investigate the expression of p62 in peripheral blood of patients with NSCLC and benign lung diseases in our hospital at the same time.Results①The expression levels of p62 in NSCLC tumor tissues were significantly expressed.The concentrations of p62 had a significant differences between pre-chemotherapy and post-chemotherapy(P<0.05).At the same time,positive rates of post-chemotherapy p62 decline significantly；②The positive rates of p62 in peripheral blood from patients were significant different between effective and ineffective group(P<0.05).ConclusionAutophagy-associated protein p62 expressed highly in tumor cells of NSCLC.The p62 in NSCLC peripheral blood has some relationship with chemotherapy and can be used as a marker and predictor for NSCLC.

NSCLC;p62

江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)臨床科技發(fā)展基金項(xiàng)目(編號(hào)：JLY20140041)

213000 江蘇省常州市武進(jìn)人民醫(yī)院

莊志方

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.10.007

R734.2

A

1001-5930(2017)10-1588-03

2016-09-23

2017-07-24)

(編輯吳小紅)