白藜蘆醇經鼻腔黏膜給藥腦內釋藥特性的研究

李躍東,崔京浩,羅道奇

(1.蘇州市第七人民醫院·蘇州大學附屬第二醫院高新區醫院藥劑科;2.蘇州大學藥學院，江蘇 蘇州 215151)

白藜蘆醇經鼻腔黏膜給藥腦內釋藥特性的研究

李躍東1,崔京浩2,羅道奇2

(1.蘇州市第七人民醫院·蘇州大學附屬第二醫院高新區醫院藥劑科;2.蘇州大學藥學院，江蘇 蘇州 215151)

目的通過鼻腔灌流給藥與靜脈給藥兩種方式來考察白藜蘆醇包合以后，經鼻入腦釋藥的可能性。方法取新西蘭兔3只，體質量約為3 kg，分別經鼻腔灌流與靜脈注射白藜蘆醇羥丙基-β-環糊精包合物，觀察單位質量血液、大腦、嗅腦及篩鼻甲中白藜蘆醇的分布情況。結果靜脈給藥后，單位質量組織中白藜蘆醇的含量從高到低依次為血液、大腦、嗅腦和篩鼻甲，分別為(0.143±0.181)μg/g、(0.035 7±0.034 8)μg/g、(0.031 3±0.037 6)μg/g、(0.0297±0.0129)μg/g；鼻腔灌流后，單位質量組織中白藜蘆醇的含量從高到低依次為篩鼻甲、嗅腦、血液和大腦，分別為(149.529±2.344)μg/g、(0.124±0.072)μg/g、(0.097±0.104)μg/g、(0.025±0.019)μg/g。鼻腔灌流后，單位質量篩鼻甲及嗅腦中白藜蘆醇含量均明顯高于靜脈給藥后(P<0.05或P<0.01)。結論經鼻腔灌流給藥可以改善白藜蘆醇在篩鼻甲和嗅腦中的分布，從而發揮腦內釋藥的作用。

白藜蘆醇;鼻腔灌流;腦內釋藥;羥丙基-β-環糊精

白藜蘆醇是從植物中提取的天然化學物質，是一種常見的二苯乙烯類化4合物，其化學結構名稱為3,4’,5-三羥基二苯乙烯，又名芪三酚，分子式為C14H12O3。現代藥理學研究[1-3]表明，白藜蘆醇不僅具有保護心血管、調節血脂代謝、保護神經及抗炎等多種生理活性，還具有抗氧化、抗自由基、延年益壽、提高免疫系統活性的作用。目前，白藜蘆醇在日本、美國、加拿大等國家已被廣泛接受，但由于國內白藜蘆醇研究起步較晚，對其功能認識尚存在一定不足。關于白藜蘆醇，已研究的制劑主要包括納米粒、脂質體、膠囊劑和保健品，但因其水不溶性的特點使普通制劑難以通過口服給藥途徑在體內發揮良好的生物活性[4-5]。因此，為避免白藜蘆醇的首過效應，提高生物利用度，本實驗擬將白藜蘆醇制備成鼻腔給藥制劑，以初步探討其鼻腔黏膜給藥腦內釋藥的特性。

1 材料與方法

1.1一般材料

實驗動物：新西蘭兔3只，體質量約為3 kg，由蘇州大學動物實驗中心提供。試劑：白藜蘆醇(批號：ZL01302008，純度>98%，南京澤朗醫藥科技有限公司)；甲醇(批號：10071753，色譜純，美國斯百全公司)；羥丙基-β-環糊精(批號：100301，純度≥98%，上海睿騰化工有限公司)；無水乙醇(批號：20120403，江蘇強盛功能化學股份有限公司)。儀器：高效液相色譜(LC-15C型泵，SPD-15C型檢測器，日本島津公司)； X-射線衍射儀(X’Pert-Pro MPD，荷蘭帕納科公司)；紅外分光光度計(Pro Star LC240，美國瓦里安公司)；紫外分光光度計(UV-2600型，日本島津公司)。

白藜蘆醇與羥丙基-β-環糊精包合物采用冷凍干燥法進行制備，首先取適量羥丙基-β-環糊精于干凈燒杯中，加水置磁力攪拌器上攪拌至溶解，取處方量白藜蘆醇于試管中，加乙醇溶解，滴加至上述燒杯中繼續避光攪拌1.5 h；待包合完成，將包合物溶液置于冰箱，預凍、真空冷凍干燥，即得白藜蘆醇環糊精分子包合物。

1.2方法

1.2.1 實驗動物模型與實驗裝置 兔耳緣靜脈注射10%水合氯醛(2 mL·kg-1)麻醉，仰臥、固定四肢及頭部后，于手術臺上進行手術；切開頸部皮膚，暴露氣管和食管，氣管切開后插入聚乙烯管，以保證正常呼吸；另取一根細聚乙烯管通過氣管插至鼻腔后部，用膠黏劑將鼻腭至口腔的通道封閉，以防止藥液從鼻腔流入口腔中，同時從兩根聚乙烯管中間結扎氣管和食管；用聚乙烯管連接蠕動泵，將盛有藥液的容器置于37 ℃恒溫水浴器中，封住瓶口，防止水分蒸發；用蠕動泵將藥液以恒定的速度泵入鼻腔，并從兩側鼻孔流出，定時取樣以測定灌流液中的藥物濃度，確定藥物吸收量[6-7]。

1.2.2 鼻腔灌流液取樣及測定 先以10 mL生理鹽水灌流10 min，測定灌流前后生理鹽水體積，若灌流液體積變化<0.1 mL，則整個灌流環路密封性良好，沒有漏液。待兔鼻腔灌流適應后，排盡所有生理鹽水。取8 mL白藜蘆醇包合物酚紅生理鹽水溶液于密封的量筒中，置于37 ℃水浴恒溫。將蠕動泵進液管插入量筒底部，啟動蠕動泵，流速為1.0 mL/min，待兔鼻中藥液滴出時開始計時，分別于0、5、10、15、20、30、45、60 min讀取量筒中剩余白藜蘆醇藥液的體積Vn后取樣0.1 mL，補加空白生理鹽水0.1 mL，以高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)測定各時間點剩余白藜蘆醇的質量濃度Cn，通過不同時間計算剩余白藜蘆醇的量Qn。剩余白藜蘆醇的量Qn計算方法：Qn=V實際Cn，該公式中Qn為第n個時間點的剩余白藜蘆醇的量(μg)，V實際為鼻腔灌流液的實際體積=酚紅總量/酚紅實時濃度[8]。

1.2.3 生物樣品取樣及測定 兔鼻腔灌流60 min后，自心臟取血約0.5 mL，以10 000 rpm離心10 min，取上清液0.2 mL，置于1.5 mL離心管中，加濃度為40.5 μg/mL內標物根皮素20 μL，渦旋混勻；加乙酸乙酯1 mL后，再渦旋3 min，以10 000 rpm離心10 min，取上清液800 μL，氮氣吹干，加80 μL甲醇復溶后，HPLC分析。

取血完畢后，處死新西蘭兔，取出大腦、嗅腦和篩鼻甲，稱重，分別加入2 mL生理鹽水和20 μL濃度為40.5 μg/mL的根皮素，渦旋振蕩混勻后，勻漿。上述各個樣品中加入2 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩3 min，以10 000 rpm離心10 min。取1.4 mL上清液，氮氣吹干，加甲醇80 μL復溶后，HPLC分析[9]。

1.2.4 靜脈給藥 兔耳緣靜脈注射2 mL環糊精包合物溶液(劑量同灌流液)，60 min后，從心臟取血，血液靜置30 min，10 000 rpm離心10 min，取上清液0.2 mL，加入20 μL濃度為40.5 μg/mL的根皮素(內標物)；渦旋振蕩均勻后，加入1 mL乙酸乙酯，渦旋振蕩3 min萃取，10 000 rpm離心10 min，取上清液0.8 mL，于通風櫥中氮氣流吹干，加甲醇80 μL復溶；渦旋震蕩均勻后，10 000 rpm離心10 min，取上清液20 μL，行HPLC分析。

取血完畢后，處死新西蘭兔，取出大腦、嗅腦、篩鼻甲，大腦稱取0.5 g，取稱重好的大腦和全部嗅腦，分別加入2 mL生理鹽水和20 μL濃度為40.5 μg/mL的根皮素(內標物)，渦旋振蕩均勻后，勻漿；篩鼻甲加入2 mL生理鹽水于研缽中研勻，各個樣品加乙酸乙酯2 mL，渦旋振蕩3 min萃取，每個樣品離心(10 000 rpm 10 min)，取上清液1.4 mL，于通風櫥中氮氣流吹干，加甲醇80 μL復溶；渦旋震蕩均勻后，離心(10 000 rpm 10 min)，取上清液20 μL，行HPLC分析。

1.3統計學分析

2 結果

2.1鼻腔灌流后白藜蘆醇的吸收量

每只兔的鼻腔灌流白藜蘆醇量為5 369.99 μg，鼻腔灌流60 min后白藜蘆醇平均吸收量為(941.66±428.64)μg，吸收百分比為(17.54±7.94)%。見表1。

表1 鼻腔灌流60 min后白藜蘆醇的吸收量

2.2靜脈給藥后單位質量組織中白藜蘆醇的量

每只兔的靜脈給藥量為5 369.99 μg，與鼻腔灌流量相同。靜脈給藥60 min后，單位質量組織中白藜蘆醇的含量從高到低依次為血液、大腦、嗅腦和篩鼻甲，分別為(0.143±0.181)μg/g、(0.035 7±0.034 8)μg/g、(0.031 3±0.037 6)μg/g、(0.029 7±0.012 9)μg/g。見表2。

表2 靜脈給藥后單位質量組織中白藜蘆醇的量(A)及白藜蘆醇在各組織中的含量(C)

2.3鼻腔灌流后單位質量組織中白藜蘆醇的量

鼻腔灌流60 min后，單位質量組織中白藜蘆醇的含量從高到低依次為篩鼻甲、嗅腦、血液和大腦，分別為(149.529±2.344)μg/g、(0.124±0.072)μg/g、(0.097±0.104)μg/g、(0.025±0.019)μg/g。鼻腔灌流后，單位質量篩鼻甲及嗅腦中白藜蘆醇含量均明顯高于靜脈給藥后(P<0.05或P<0.01)，且大腦、血液中的含量幾乎相當，差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 鼻腔灌流后單位質量組織中白藜蘆醇的量(A)及白藜蘆醇在各組織中的含量(C)

3 討論

本實驗選擇新西蘭兔作為研究對象，主要考慮與大鼠麻醉易死和插管灌流手術要求較高不易操作有關。

由于白藜蘆醇水飽和液溶解度較低，水中溶解度僅為40 μg/mL左右，鼻腔吸收量有限，通過簡單實驗驗證，在此實驗條件下幾乎沒有信號響應[10]。因此，本實驗使用羥丙基-β-環糊精對白藜蘆醇進行包合，以提高白藜蘆醇在水中的溶解度；通過兔鼻腔灌流給藥與靜脈給藥兩種方式來考察白藜蘆醇包合以后，經鼻入腦釋藥的可能性，旨在為全面系統地評價白藜蘆醇鼻腔給藥提供理論依據。

經鼻直接入腦的途徑主要為篩鼻甲-嗅神經通路、嗅黏膜上皮通路-嗅腦-大腦。本實驗結果表明，白藜蘆醇靜脈給藥和鼻腔灌流給藥均能進入腦部，且大腦中的含量幾乎相當；鼻腔灌流后，單位質量篩鼻甲中白藜蘆醇平均含量遠大于靜脈給藥后，且嗅腦中的白藜蘆醇平均含量亦明顯大于靜脈給藥后，說明白藜蘆醇的含量依次為篩鼻甲>嗅腦>大腦，尤其嗅腦白藜蘆醇含量大于大腦，進一步證明白藜蘆醇經鼻入腦通路的存在，提示經兔鼻腔灌流給藥可以改善白藜蘆醇在篩鼻甲和嗅腦中的分布，白藜蘆醇經鼻腔黏膜給藥后達到腦內釋藥是可行的。通過簡單的驗證實驗，增加白藜蘆醇靜脈給藥的量，會使進入腦部的白藜蘆醇含量增加，這可能與白藜蘆醇脂溶性較強，易透過血腦屏障有關[11-12]。但增加白藜蘆醇包合物的鼻腔灌流量，進入腦部的白藜蘆醇含量卻沒有靜脈給藥增加的明顯；稍微減少白藜蘆醇鼻腔灌流量，進入腦部的白藜蘆醇含量亦未見明顯減少，這可能與鼻腔吸收有飽和性有關[13-14]。

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Studyonthebrainreleasecharacteristicsofresveratrolthroughintranasaladministration

LI Yue-dong1,CUI Jing-hao2,LUO Dao-qi2

(1.DepartmentofPharmacy,TheSeventhPeople’sHospitalofSuzhou,GaoxinDistrictHospital,TheSecondAffiliatedHospitalofSoochowUniversity;2.CollegeofPharmacy,SoochowUniversity,Suzhou215151,Jiangsu,China)

Objective：To explore the possibility of resveratrol into the brain via the nose after clathration through nasal perfusion and intravenous injection.Methods3 New Zealand rabbits with 3 kg of body weight approximately were selected,and resveratrol-hydroxypropyl-β-cyclodextrin inclusion compounds were given respectively by nasal perfusion and intravenous injection.The distribution of resveratrol in blood,brain,rhinencephalon and sieve turbinate per unit mass was observed.ResultsAfter intravenous injection,the content of resveratrol in blood per unit mass was the highest,then was the brain,rhinencephalon and sieve turbinate,and the contents were (0.143±0.181)μg/g,(0.0357±0.0348)μg/g,(0.0313±0.0376)μg/g and (0.0297±0.0129)μg/g,respectively.After nasal perfusion,the content of resveratrol in the sieve turbinate per unit mass was the highest,then was the rhinencephalon,blood and brain,and the contents were (149.529±2.344)μg/g,(0.124±0.072)μg/g,(0.097±0.104)μg/g and (0.025±0.019)μg/g,respectively.After nasal perfusion,the contents of resveratrol in the sieve turbinate and rhinencephalon were significantly higher than those after intravenous injection (P<0.05 orP<0.01).ConclusionNasal perfusion of resveratrol can improve its distribution in the sieve turbinate and rhinencephalon so as to exert the effect of specific delivery in the brain.

Resveratrol;Nasal perfusion;Brain release;Hydroxypropyl-β-cyclodextrin

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.05.037

2017-04-11

李躍東(1985-)，男，主管藥師。E-mail:1344050208@qq.com

時間： 2017-10-10 02∶28

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171010.0228.076.html

1005-3697(2017)05-0778-04

R944.9

A

(學術編輯李毅)

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