粒狀頭樣2在肺纖維化上皮間質轉化中的作用研究

孫建，代文靜，邱靜，李萬成

(成都醫學院第一附屬醫院呼吸內科，四川 成都 610500)

粒狀頭樣2在肺纖維化上皮間質轉化中的作用研究

孫建，代文靜，邱靜，李萬成

(成都醫學院第一附屬醫院呼吸內科，四川 成都 610500)

目的探討粒狀頭樣2(grainyheas-like2，GRHL2)在肺纖維化上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)中的作用研究。方法45只大鼠隨機分為正常對照組，模型組及丙戊酸鈉組，每組15只，模型組及丙戊酸鈉組沿著氣管注射博來霉素構建大鼠肺纖維化模型，正常對照組采用同樣方法給予等量生理鹽水。丙戊酸鈉組大鼠腹腔注射200 mg·kg-1·d-1丙戊酸鈉，正常對照組及模型組腹腔注射等量生理鹽水，連續給藥28 d。HE染色檢測肺組織病理情況，Masson染色檢測肺組織纖維化情況，堿水解法檢測羥脯氨酸(HYP)含量，免疫組化及Western Blot檢測GRHL2表達，Western Blot檢測EMT相關蛋白E-cadherin，α-平滑肌細胞肌動蛋白(α-SMA)，Vimentin，Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白表達。結果與正常對照組比較，模型組大鼠肺組織肺泡結構被破壞，大量膠原纖維沉積，膠原染色面積比、Ashcroft評分及HYP含量升高(P<0.01)，GRHL2陽性率及蛋白表達量降低(P<0.01)，E-cadherin表達量下調(P<0.01)，α-SMA，Vimentin，β-catenin，淋巴樣增強結合因子(LEF)及基質金屬蛋白酶7(MMP7)表達量上調(P<0.01)。與模型組比較，丙戊酸鈉組大鼠肺泡組織結構較為完整，膠原纖維沉積程度較輕，膠原染色面積比、Ashcroft評分及HYP含量降低(P<0.01)，GRHL2陽性率及蛋白表達量提高(P<0.01)，E-cadherin表達量上調(P<0.01)，α-SMA，Vimentin，β-catenin，LEF1及MMP7表達量下調(P<0.01)。結論大鼠肺纖維化過程GRHL2表達量下調，進而激活Wnt/β-catenin信號通路，促進EMT生成，加重大鼠肺纖維化程度，丙戊酸鈉能扭轉此過程。

粒狀頭樣2(GRHL2)；丙戊酸鈉；肺纖維化；大鼠；上皮間質轉化(EMT)；Wnt/β-catenin信號通路

肺纖維化是一種慢性的原因不明的肺間質炎性疾病，主要病理特點為肺泡腔、肺間質膠原纖維的生成、沉積及大量炎性細胞的浸潤滲出[1-2]。目前研究認為肺泡上皮損傷后異常修復引起的上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是肺纖維化產生的重要原因，與肺纖維化的發生密切相關，而且在肺纖維化過程中，EMT上皮標記物E-cadherin表達量下調，促使β-catenin進入細胞核，使Wnt/β-catenin信號通路被激活，進而誘導EMT的產生，因此通過抑制Wnt/β-catenin信號通路繼而干預EMT的生成已成為治療肺纖維化重要機制之一[3-5]。粒狀頭樣2(grainyheas-like2，GRHL2)是一種維持人類氣道上皮形態、功能的重要轉錄因子，在維持著上皮功能的完整性方面發揮著重要作用[6]。研究顯示，GRHL2能夠表達于人胚胎時期的肺間質及特發性纖維化肺間質，但在肺纖維化間質中表達量下調[7]。GRHL2能夠通過調控上皮的分化，上調E-cadherin表達，下調EMT間質標記物，最終遏制EMT的產生[8-9]，進而提示通過構建慢病毒下調GRHL2可能能夠通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路繼而扭轉EMT的生成最終抑制肺纖維化的發展，但是慢病毒的構建較為復雜且不適用于臨床。因此本研究將選取藥物進行間接的干預。丙戊酸鈉是一種組蛋白去乙?；D移酶抑制劑，能夠通過下調間充質標記物α-SMA表達，上調E-cadherin表達，繼而減輕博來霉素誘導大鼠肺纖維化[10]。丙戊酸鈉的調控機制是否與GRHL2的表達，Wnt/β-catenin信號通路有關尚未可知，因此本研究將對此推測展開研究。

1 材料和方法

1.1動物

(250±50)g的SD雄性大鼠45只，購于成都達碩實驗動物有限公司，生產許可證：SCXK(川)2015-030。大鼠自由飲水攝食。使用許可證SYXK(川)2015-196，成都醫學院。

1.2試劑及儀器

博來霉素購自哈爾濱博萊制藥有限公司；兔抗GRHL2多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗E-cadherin，α-SMA，Vimentin，β-catenin，LEF1及MMP7單克隆抗體購自美國宜百康公司；大鼠抗GAPDH單克隆抗體及BCA試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；羥脯氨酸含量(HYP)檢測試劑盒購自北京索萊寶生物技術有限公司。迷你雙垂直電泳儀，迷你轉印電泳儀，ChemiDocTM XRS凝膠成像系統購自美國伯樂公司；MCS7200顯微圖像采集系統購自德國Leica公司。

1.3分組、模型建立及給藥[11-12]

將45只大鼠隨機分為正常對照組，模型組及丙戊酸鈉組，每組15只。3組大鼠均用10%水合氯醛麻醉，并對頸部皮膚進行消毒，做切口使氣管暴露出來，模型組及丙戊酸鈉組沿著氣管一次性慢慢的注射5 mg/kg的博來霉素，建立大鼠肺纖維化模型。正常對照組同樣沿著氣管間隙一次性注入0.3 mL的生理鹽水。造模成功后，丙戊酸鈉組大鼠腹腔注射給予200 mg·kg-1·d-1丙戊酸鈉，正常對照組及模型組腹腔注射等量生理鹽水。連續給藥28 d。

1.4標本獲得

3組大鼠于28 d處死，剖開胸腔取出右肺，一小部分用于羥脯氨酸含量檢測，一部分用于HE染色，Masson染色，免疫組化及Wester Blot的檢測。

1.5 HE染色

肺組織標本固定，包埋，切片后，于二甲苯，100%乙醇，95%、80%、75%乙醇，蒸餾水中脫蠟至水洗。蘇木素染色，鹽酸酒精分化，流水沖洗。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固，于鏡下觀察。

1.6 Masson染色

石蠟標本于二甲苯，100%乙醇，95%、80%、75%乙醇，蒸餾水中脫蠟至水洗。蘇木素染色，水洗后Masson麗春紅溶液浸泡，在滴加1%磷鉬酸分化，苯胺藍染色，最后滴加1%冰醋酸分化。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固，于鏡下觀察。膠原纖維被蘇木素染色藍色，而肌纖維染色紅色，能夠判斷肺組織纖維化程度。采用Ashcroft評分對肺組織纖維化程度進行評分。采用Image pro plus6.0軟件分析圖像，染色面積比即為膠原纖維染色的面積占組織切片總的面積的比例。

1.7堿水解法檢測大鼠肺組織中HYP含量

將50～100 mg左右的肺組織置于試管中，加入1 mL水解液，在95 ℃水浴中水解15 min，取稀釋后的水解液于離心機中離心，于酶標儀560 nm處進行OD值的檢測。

1.8免疫組化檢測GRHL2的表達

石蠟標本于二甲苯，100%乙醇，95%、80%、75%乙醇，蒸餾水中脫蠟至水洗。枸櫞酸鹽緩沖液修復。10%山羊血清室溫下封閉。一抗溶液(兔抗人GRHL2多克隆抗體，稀釋度為1∶200)，4 ℃過夜孵育，第2天二抗溶液室溫下孵育，DAB顯色后沖洗。蘇木素復染、1%鹽酸分化，氨水反藍。梯度酒精中脫水，二甲苯中透明，中性樹脂封片，并于顯微鏡下觀察。以PBS液代替一抗作為陰性對照。

1.9 Western Blot檢測GRHL2，E-cadherin，α-SMA，vimentin，β-catenin，LEF1及MMP7蛋白表達

取石蠟肺組織標本勻漿，加入RIPA裂解液裂解，離心收集上清液就是總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白濃度。制作濃縮膠，分離膠，室溫水封靜置30 min。蛋白變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，后濕法轉膜。一抗溶液(兔抗GRHL2多克隆抗體，兔抗E-cadherin，α-SMA，vimentin，β-catenin，LEF1及MMP7單克隆抗體，大鼠抗GAPDH單克隆抗體，稀釋度均為1∶100)孵育，4 ℃過夜；次日于二抗溶液室溫孵育1 h。于凝膠成像系統中曝光。

1.10統計學分析

2 結果

2.1各組大鼠肺組織HE染色結果

HE染色結果：正常對照組肺泡結構正常，無炎性細胞浸潤；模型組肺泡結構被破壞，大量炎性細胞浸潤，丙戊酸鈉組肺組織結構較為完整，肺泡腔還存在，炎性細胞浸潤較少。見圖1。

2.2各組大鼠肺組織Masson染色結果及染色面積比的測定

Masson染色結果顯示：正常對照組幾乎不見藍色膠原纖維沉積；模型組可見大量膠原纖維沉積，丙戊酸鈉組膠原纖維沉積程度較輕。同時定量結果表明：與正常對照組比較，模型組染色面積比顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，丙戊酸鈉組染色面積比顯著降低(P<0.01)。見圖2及圖3。

*P<0.01，與正常對照組比較；#P<0.01，與模型組比較。

2.3各組大鼠肺組織HYP含量及Ashcroft評分的測定

與正常對照組比較，模型組中HYP含量及Ashcroft評分顯著提高(P<0.01)；與模型組比較，丙戊酸鈉組HYP含量及Ashcroft評分顯著降低(P<0.01)。見圖4。

*P<0.01，與正常對照組比較；#P<0.01，與模型組比較。

2.4各組大鼠肺組織中GRHL2的表達

與正常對照組比較，模型組中GRHL2陽性率及蛋白表達量顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，丙戊酸鈉組GRHL2陽性率及蛋白表達量顯著提高(P<0.01)。見圖5及圖6。

*P<0.01，與正常對照組比較；#P<0.01，與模型組比較。

2.5各組大鼠肺組織中E-cadherin，α-SMA及vimentin蛋白的表達

與正常對照組比較，模型組中E-cadherin表達量下調，α-SMA及vimentin表達量上調(P<0.01)；與模型組比較，丙戊酸鈉組E-cadherin表達量上調，α-SMA及vimentin表達量下調(P<0.01)。見圖7。

2.6各組大鼠肺組織中β-catenin，LEF1及MMP7的表達

與正常對照組比較，模型組中β-catenin，LEF1及MMP7表達量顯著上調(P<0.01)；與模型組比較，丙戊酸鈉組β-catenin，LEF1及MMP7表達量顯著下調(P<0.01)。見圖8。

3 討論

EMT是研究肺纖維化最為經典的方式之一，2型EMT與肺纖維化的發生發展密切相關。在組織器官缺氧，遭受炎癥作用后，組織上皮失去了極性，細胞之間的黏附能力降低，細胞形態向紡錘型轉變，逐漸喪失了上皮形態并具有了間質細胞的特性，此過程EMT上皮標記物如E-cadherin表達量下調，間質標記物α-SMA，vimentin表達量上調，促使細胞骨架發生重組向間質細胞轉變，同時使細胞具有遷移運動能力。在上皮間質轉化過程中涉及多種信號通路，Wnt/β-catenin信號通路是其中一種，并處于異常激活的狀態[3-4]。Wnt/β-catenin信號通路參與細胞增殖，分化，凋亡等生物學過程，在支氣管上皮肺泡的再生及EMT過程中發揮著重要作用[4,11-12]。其核心蛋白β-catenin是黏附分子/連環蛋白(cadherin/catenin)重要組成成分，能夠與E-cadherin相互作用，維持著上皮細胞正常形態結構及連接，而在E-cadhein表達缺失或下調情況下，β-catenin被釋放出來，在細胞漿中積累并進入細胞核，與轉錄因子T細胞因子(TCF)/淋巴樣增強結合因子(LEF)結合形成復合物，調控靶基因的轉錄，如MMPs，MDR等蛋白的表達，進而促進EMT的發生[4,11-12]。因此通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路，繼而扭轉EMT的發生已逐漸成為肺纖維化治療的靶點之一。

GRHL包括GRHL1，GRHL2，GRHL3三種亞型，其中GRHL2是2002年Wilanowski等[6]學者發現的一種類似于果蠅粒狀頭樣的轉錄因，在維持上皮細胞的形態，黏附等結構功能方面起著重要作用。GRHL2能夠維持著人正常肺泡上皮細胞的完整性，且Varma等[7]研究還證實GRHL2不僅能夠表達于早期胚胎時期的人正常肺間質，還能夠表達于特發性肺纖維化間質，但是表達量下調。同時GRHL2在博來霉素誘導的HPS1及HPS2小鼠特異性肺纖維化損傷中的間質中及化療誘導的小鼠肺纖維化間質中的表達具有差異性。另外還有學者證實GRHL2表達量降低能夠通過下調E-cadherin表達，繼而促進vimentin的表達，促使EMT的產生[8-9]。而E-cadherin表達的下調與Wnt/β-catenin信號通路的激活具有相關性[4-5,12]。進而提示GRHL2可能通過調控Wnt/β-catenin信號通路進而影響EMT的生成最終參與肺纖維化的發展，因此以GRHL2為靶點，通過構建慢病毒轉染GRHL2繼而探討GRHL2在肺纖維化進程中作用對于肺纖維化的治療將具有重要意義。但是慢病毒構建復雜且不合適臨床應用，因此本研究將利用藥物代替進行間接的探討GRHL2在肺纖維化上皮間質轉化中的作用及機制。

丙戊酸鈉是一種組蛋白去乙酰基轉移酶抑制劑，能夠通過抑制組蛋白去乙?；?HDACs)繼而促使組蛋白過度的乙?；瑓⑴c多種基因的轉錄調控。HADCs能夠結合于E-cadherin啟動子，繼而使得組蛋白去乙酰化，丙戊酸鈉通過抑制HADCs表達，繼而阻斷TGF-β1誘導的A549細胞的EMT生成[13]。另外有研究還證實丙戊酸鈉能夠通過下調α-SMA表達，上調E-cadherin表達，繼而減輕博來霉素誘導的大鼠肺纖維化[10]。但是丙戊酸鈉是否能夠通過Wnt/β-catenin信號通路減輕大鼠肺纖維化及GRHL2在其中所起的作用如何尚未可知，因此本研究將對此展開研究。

博來霉素經氣管內注射是目前構建動物肺纖維化模型最為常用的誘導劑，其誘發的動物模型肺組織病理變化與人肺纖維化病理特點一致，且操作較為方便，造模成功率高[14-15]。因此本研究首先參考相關文獻[14-15]并利用預實驗采用5 mg/kg的博來霉素來構建大鼠肺纖維化模型，在28 d時HE染色，Masson染色及HYP含量的測定結果均證實本研究所構建的大鼠肺纖維化模型均已成功。接著探討丙戊酸鈉對大鼠肺纖維化的抑制作用及GRHL2在大鼠肺纖維化EMT中的作用。HE染色，Masson染色及HYP含量表明丙戊酸鈉能顯著的改善模型大鼠肺細胞結構，減輕膠原纖維的沉積，降低HYP含量，說明丙戊酸鈉對大鼠肺纖維化具有治療作用，與高淑艷等[10]研究一致。進一步利用免疫組化探討GRHL2在模型大鼠肺組織中的表達，結果表明模型組中GRHL2陽性率顯著低于正常組，與Varma等[7]研究一致，而丙戊酸鈉組GRHL2陽性率顯著高于模型組，此結果在后續的western blot研究中進一步得到證實，從而說明GRHL2在大鼠肺纖維化中含量減少，而當GRHL2表達量上調后，大鼠肺纖維化進程被抑制，且丙戊酸鈉對大鼠肺纖維化的減輕作用與調控GRHL2表達有關。然后本研究繼續利用western blot檢測各組大鼠肺組織中EMT相關蛋白的表達，結果表明與模型組比較，丙戊酸鈉組肺組織中E-cadherin表達量上調，α-SMA及vimentin下調，說明丙戊酸鈉通過抑制EMT的形成，減輕大鼠肺纖維化，進一步推測GRHL2表達量的提高可通過阻斷EMT的發生，阻止大鼠肺纖維化的發展。最后本研究探討GRHL2，丙戊酸鈉與Wnt/β-catenin信號通路的關系，結果證實丙戊酸鈉組中β-catenin，LEF1及MMP7表達量顯著低于模型組，從而說明丙戊酸鈉通過抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，繼而阻止EMT的產生，達到減輕大鼠肺纖維化的過程，進一步推測GRHL2表達量上調后通過阻斷Wnt/β-catenin信號通路，繼而抑制EMT的形成，最終阻止大鼠肺纖維化的進一步發展。

綜上所述，在大鼠肺纖維化過程中GRHL2表達量下調，進而激活Wnt/β-catenin信號通路，促進EMT的發生，加劇大鼠肺纖維化程度，而丙戊酸鈉能夠通過上調GRHL2表達，阻斷Wnt/β-catenin信號通路，進而抑制EMT的形成，最終減輕大鼠肺纖維化。

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ResearchofGRHL2inepithelialmesenchymaltransitionofpulmonaryfibrosis

SUN Jian,DAI Wen-jing,QIU Jing,LI Wan-cheng

(DepartmentofRespiratoryMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollege,Chengdu610500,Sichuan,China)

Objective：To explore the function of grainyheas-like2 (GRHL2) on the epithelial-mesenchymal transition (EMT) in pulmonary fibrosis rats.Methods45 rats were randomly divided into normal control group,model group and sodium valproate group,15 rats in each group.Rats in the model group and sodium valproate group were injected with bleomycin along air tube to construct pulmonary fibrosis model,and rats in the normal control group was given the same amount of normal saline by the same method.The rats were injected with 200 mg·kg-1·d-1sodium valproate by intraperitoneally in sodium valproate group,the rats were injected with the same amount of normal saline in the normal control group and the model group for 28 d continuously.The pathological changes of lung tissue was detected by HE staining.The fibrosis of lung tissue was detected by Masson staining.The content of hydroxyproline (HYP) was detected by alkaline hydrolysis.The expression of GRHL2 was detected by immunohistochemistry and Western blot.The expression of EMT related protein E-cadherin,alpha smooth muscle cell actin (α-SMA),Vimentin,Wnt/β-catenin signaling pathway related proteins was detected by Western blot.ResultsCompared with the normal control group,the alveolar structure of lung tissue was destroyed,a large number of collagen fibers were deposited,the collagen staining area ratio,Ashcroft score and HYP content were increased (P<0.01),the positive rate and expression of GRHL2 was decreased (P<0.01),the expression of E-cadherin was down-regulated (P<0.01),the expression of α-SMA,Vimentin,β-catenin,lymphoid enhancer-binding (LEF1) and matrix metalloproteinase 7 (MMP7) up-regulated in model group(P<0.01).Compared with the model group,the structure of alveolar tissue was more complete,the degree of collagen fiber deposition was lighter,the collagen staining area ratio,Ashcroft score and HYP content decreased (P<0.01),the positive rate and expression of GRHL2 was increased (P<0.01),the expression of E-cadherin was up-regulated (P<0.01),the expression of α-SMA,Vimentin,β-catenin,LEF1 and MMP7 down-regulated (P<0.01).ConclusionIn rats with pulmonary fibrosis,the expression of GRHL2 is down regulated,which activates the Wnt/beta-catenin signaling pathway,promotes the formation of EMT and aggravates the pulmonary fibrosis in rats,and valproate can reverse the process.

Grainyheas-like2 (GRHL2);Sodium valproate;Pulmonary fibrosis;Rats;Epithelial-mesenchymal transition (EMT);Wnt/β-catenin signaling pathway

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.05.001

四川省教育廳科研計劃項目(16ZB0292)

2017-06-01

孫建(1981-)，男，碩士，副主任醫師。E-mail：xuerl61@126.com

李萬成，E-mail：xuerl61@126.com

時間： 2017-10-10 02∶27

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20171010.0227.004.html

1005-3697(2017)05-0650-06

R563

A

(學術編輯陳小菊)

本刊網址：http：//www.nsmc.edu.cn作者投稿系統http：//noth.cbpt.cnki.net郵箱xuebao@nsmc.edu.cn