微生物修復重金屬污染土壤探究

鄧秋穗, 唐 霞, 蔡 潤, 許瀚月, 張睿韜, 李冰潔, 李司晨, 徐 恒, 汪 紅

(四川大學 生命科學學院, 四川 成都 610064)

微生物修復重金屬污染土壤探究

鄧秋穗, 唐 霞, 蔡 潤, 許瀚月, 張睿韜, 李冰潔, 李司晨, 徐 恒, 汪 紅

(四川大學 生命科學學院, 四川 成都 610064)

利用微生物對重金屬的鈍化作用，制備微生物鈍化劑并應用于重金屬污染土壤的治理。通過研究重金屬污染土壤中微生物的性質，篩選出能有效處理土壤中重金屬污染的優良菌種CQ7與FQ2;對篩選出的菌株進行表征，并測定其生長曲線,鑒定FQ2為革蘭氏陰性桿菌。進一步對篩選出的菌種進行理化條件測定，測定得CQ7與FQ2的最適生長條件均為pH=5、轉速180 r/min、溫度25 ℃。經金屬耐受和吸附實驗，選定FQ2為工程菌，測序確定其為沙雷氏菌屬(Serratiamarcuscens)。將篩選所得菌種與相應理化條件相結合，制備微生物鈍化劑，設計自動化重金屬污染土壤修復設備，對其應用前景進行了初步規劃。

微生物鈍化劑； 重金屬污染； 自動化修復儀

隨著現代社會的進步，土壤重金屬(As、Cd、Hg、Pb等)污染日益嚴重，如何修復重金屬污染土壤成為人類不可忽視的問題[1-3]。鎳鉛鉻等重金屬是某些低等生物和植物的必需微量營養元素之一，同時也是一種致癌的毒性元素[4]。

細菌尺寸小，對環境適應能力強，可以用來作為生物吸附劑[7]， 2010年， Polti報道從鉻鐵礦中分離并鑒定了一株Bacillusamyloliquefaciens(CSB 9) 。該菌可以耐受900 mg/L Cr(VI)，在最佳條件下具有較快的還原速度(2.22 mg Cr(VI)/(L·h)[8-10]。2014年，Yang 等考察了PannonibacterphragmitetusBB在強化鉻污染修復過程中的作用，并且考察了土壤土著微生物群落變化的規律。結果表明，在Cr(VI) 濃度為518.84 mg /kg、pH 8.64 的條件下，P．PhragmitetusBB可以在2 d內將Cr(VI)全部還原。該菌在接入土壤后的48 h 內數量顯著上升，相對比例由35.5%上升至74.8%，并維持穩定[11]。

已有研究人員針對微生物修復，做出了菌種對部分重金屬污染土壤修復的研究[12]，但是國內外對于重金屬污染土壤的綜合高效修復微生物設備仍鮮有報道[13]，缺少微生物鈍化劑的自動化產品。本課題綜合前人相關研究經驗，設計了針對重金屬污染土壤的高效微生物鈍化劑，并且計劃最終形成工業產品，該成果將可能成為治理重金屬污染土壤的有效途徑。

1 材料與方法

1.1高效修復重金屬污染土壤的菌種篩選及擴大培養

1.1.1 污泥稀釋液的制備

稱取污泥樣品5 g，加入到含有45 mL無菌水的錐形瓶中(放少許玻璃珠)，恒溫搖床室溫振蕩30 min；然后取1 mL污泥懸液加入到含有9 mL無菌水的試管中，充分混勻，逐級稀釋至10-5的污泥懸液[14]。

1.1.2 平板涂布

取10 mL實驗室的水樣，采用系列稀釋涂布法(10-5倍),將10-3、10-4、10-5稀釋度的水樣分別涂布于相應的培養基上，每個稀釋度涂布3個培養皿，37 ℃，培養1～2 d后觀察[15]。對部分優勢菌繼續在選擇培養基上劃線分離，直至得到單一菌落。

1.1.3 菌株篩選

挑取菌落特征明顯不同的菌株，分別采用三線法劃線移接到含重金屬離子、濃度逐步提高的LB平板上繼續培養，得到菌株后再經過多次分離純化,4 ℃保存[16]，記錄單一菌落的特征。

1.2 菌株最適生長理化條件選擇

1.2.1 基礎LB培養基正常條件下生長曲線測定

提前12 h取1%菌液于1 mL的LB培養基中進行活化；分別取1 mL活化菌液于100 mL的LB培養基中，溫度37 ℃、轉速180 r/min 培養兩株菌0～24 h及24～48 h，每間隔2 h測定一次600 nm下的吸光值，記為OD600，繪制0～48 h的菌株生長曲線，每組實驗重復做2次。

1.2.2 最適生長的pH條件篩選

提前12 h取1%菌液于1 mL的LB培養基中進行活化；分別取1 mL活化菌液于100 mL的LB培養基中，溫度37℃、轉速180 r/min，pH分別設置為4、5、6、7、8、10，分別培養兩株菌0～24 h及24～33 h，每間隔4～5 h測定一次600 nm處的OD值，繪制0～33 h的菌株生長曲線，每一組實驗重復2瓶，取樣2次作對照，比較不同pH條件下菌株的生長情況。

1.2.3 最適生長的溫度條件篩選

提前12 h取1%菌液于1 mL的LB培養基中進行活化；分別取1 mL活化菌液于100 mL的LB培養基中，轉速180 r/min，溫度分別設置為25、37、40 ℃，分別培養兩株菌0～24 h及24～33 h，每間隔4～5 h測定一次600 nm處的OD值，繪制0～33 h的菌株生長曲線，每一組實驗重復2瓶，取樣2次作對照，比較不同溫度條件下菌株的生長情況。

1.2.4 最適生長的轉速條件篩選

提前12 h取1%菌液于1 mL的LB培養基中進行活化；分別取1 mL活化菌液于100 mL的LB培養基中，溫度 37℃，設置轉速分別為140、180 r/min；分別培養2株菌0～24 h及24～33 h，每間隔4～5 h測定一次600 nm處的OD值，繪制0～33 h的菌株生長曲線，每一組實驗重復2瓶，取樣2次作對照，比較不同溫度條件下，菌株的生長情況。

1.2.5 菌對重金屬耐受力的測定

提前12 h取1%菌液于1 mL的LB培養基中進行活化；分別取2 mL活化菌液涂布于含重金屬離子，濃度逐步提高的LB平板上繼續培養(通常培養5 d左右)，觀察菌落生長情況。

1.2.6 16S rDNA序列測定

活化工程菌株生長至對數期，利用天根試劑盒提取基因組DNA，利用PCR擴增16S rDNA序列，將產物送至成都飛騰博川生物技術有限公司測序,在NCBI數據庫中進行比對，鑒定工程菌種屬。

1.2.7 掃描電鏡觀察

活化工程菌株生長至對數期，送往四川大學分析測試中心，使用掃描電鏡對FQ2菌株掃描觀察，電子能譜分析，對其吸附重金屬能力進行檢測。

1.3 自動化重金屬污染微生物修復儀初步設計

產品以現有類似機械(插秧機)為藍本，根據所需的微生物吸附(分泌)處理土壤中重金屬這一目的加以重新設計與定向改造,并基于模塊化設計理念，主要有自動化重金屬檢測連動裝置、微生物鈍化裝置、菌種保藏裝置、負重輪和發動機5大主要部件。通過借鑒現有成熟農用機械系統，降低非必需成本，以達到較高的安全性和實用性，同時間接降低維護與升級成本。

2 結果與分析

2.1高效修復重金屬污染土壤的菌種篩選及擴大培養

實驗共篩選出2株優良菌株，CQ7與FQ2。對篩選出的菌株進行表征測定，觀察其菌落形成。CQ7菌落呈圓形，形狀規則，菌落直徑約為2～3 mm，顏色為乳白色，正面與背面顏色相同，菌落表面粗糙、干燥、半透明，邊緣整齊(見圖 1(a))。FQ2菌落呈圓形，形狀規則，菌落直徑約為1～2 mm；顏色為乳白色，正面與背面顏色相同，菌落表面光滑、濕潤、半透明，邊緣整齊(見圖 1(b))；放于25 ℃左右培養時，菌表面產生紅色素(見圖1(c))，革蘭氏染色顯示為革蘭氏陽性桿菌(見圖1(d))。

圖1 CQ7及FQ2菌落形態與革蘭氏染色

2.2 菌株最適生長理化條件選擇

2.2.1 基礎LB培養基默認篩選條件下生長曲線測定

實驗結果(見圖2)表明，FQ2和CQ7 2 h后開始較快增殖，5～20 h平穩較快增殖，20 h后FQ2數目趨于穩定，CQ2數目少許增長。可見FQ2的對數生長期為5～20 h,CQ7對數生長期為5～30 h。

2.2.2 最適生長的pH條件篩選

比較對數期(FQ2為5～20 h，CQ7為5～30 h)FQ2和CQ7的生長情況可知，pH=5更有利于CQ7增殖(見圖3(a))；pH=5至pH=8都有利于FQ2增殖(見圖3(b))。pH=10時，CQ7和FQ2增殖情況較差，這兩種菌均不耐受堿性環境。pH=4時，CQ7不增殖，FQ2正常增殖。可見，FQ2比CQ7更能適應酸性環境。

圖2 基礎LB培養基正常條件下生長曲線

2.2.3 最適生長的溫度條件篩選

比較對數期時FQ2和CQ7的生長情況可知，CQ7和FQ2的最適生長溫度都為25 ℃(見圖4)。

圖4 CQ7和FQ2的最適溫度條件篩選

2.2.4 最適生長的轉速條件篩選

比較對數期時FQ2和CQ7的生長情況可知，CQ7的最適轉速為180 r/mi,轉速對FQ2的影響不大(見圖5)。

圖5 CQ7和FQ2的最適生長轉速篩選

2.3 微生物菌株鈍化劑設計

2.3.1 菌對重金屬耐受力的測定

對獲得的菌株鈍化劑進行重金屬耐受力檢測，檢測結果：CQ7抗鎳濃度為100 mg/L，抗鉛濃度為250 mg/L，在鎳和鉛同時存在的情況下最高耐受30 mg/L，耐受重金屬的能力太弱，故放棄該菌株；FQ2抗鎳濃度為500 mg/L，抗鉛濃度為900 mg/L，在鎳和鉛同時存在的情況下最高耐受100 mg/L的鎳和100mg/L的鉛。此外，還測定了CQ7和FQ2的溶磷、產IAA能力(見表1)。比較可見，FQ2具有高效修復多種重金屬污染土壤的能力。

表1 CQ7與FQ2的溶磷能力與產IAA能力

2.3.2 FQ2 16S rDNA序列測定

待活化菌株生長至對數期，提取菌株基因組DNA，PCR擴增16SrDNA序列，將產物送至成都飛騰博川生物技術有限公司測序，得FQ2菌株16S RNA序列。在NCBI數據庫中進行比對，該菌株為沙雷氏菌屬Serratiamarcuscens。菌株的16S rDNA序列如下：

2.3.3 菌株掃描電鏡觀察檢測

待活化菌株生長至對數期，取FQ2菌液進行掃描電鏡檢測。結果顯示：FQ2為桿菌表面粗糙(見圖 6(a)),加入重金屬后FQ2細胞變大，出現破裂(見圖6(b))；選定部分區域，進一步進行電子能譜分析，發現FQ2對重金屬鉛表現出較高的吸附作用(見圖6(c)和6(d)，表2)

圖6 FQ2電鏡掃描檢測

元素線類型質量分數/%原子百分比/%標準樣品標簽廠家標準CK線系64.2972.31CVit是OK線系32.5627.49SiO2是NiK線系0.000.00Ni是PbM線系3.150.21PbTe是

2.4 自動化重金屬污染微生物修復儀初步設計

2.4.1 自動化重金屬檢測連動裝置

該修復儀整體構型如一輛自動駕駛農用車(見圖7(a))，尺寸大小可根據實際需要處理的土壤面積需求而定。修復儀只需開啟便可自動運行。該修復儀中后部設置有重金屬檢測裝置，底板處檢測孔(見圖 7(c))接觸土壤，由后部的檢測裝置自動檢測，數據輸出于后上方顯示屏，當達到一定污染值時，啟動土壤pH檢測裝置，匹配對應土壤pH啟動菌種保藏箱選擇該pH最適生長的菌種，將菌種輸入插入式重金屬污染處理裝置對土壤進行處理，否則修復儀繼續向前移動。

2.4.2 菌種保藏箱

修復儀的中部為大規模的菌種保藏箱(見圖7(e))，采用最適條件培養有篩選出的具有優秀處理土壤重金屬污染能力的菌種。培養箱(保藏箱)內分多個培養空間，有兩大類使用方式。方式一：多個培養空間分別培養有不同最適pH的菌種，該菌種保藏箱與底部伸縮底盤連接，在接到pH檢測裝置的指令時，可將對應土壤pH范圍最適生長的菌種經過下行裝置排放至底板(圖 7(e))，準備對土壤進行處理；方式二：其一培養空間培養文中菌種，另有空間儲藏有石灰水等調節pH的試劑，可在土壤pH檢測后，根據菌種生存所需最適pH，先投放pH調節劑調節土壤pH至菌種生存范圍，再投放菌種。

經多方研究，補充可適用于該裝置的菌株，最適生長pH覆蓋范圍為pH 4～pH 10，范圍廣泛(見表3)。

表3 可適用于自動化土壤重金屬污染修復儀的菌株補充

表3(續)

2.4.3 插入式重金屬污染處理裝置

修復儀參照扦插裝置，在修復儀底部設置了大面積可伸縮底盤，底盤下為多排伸縮高壓槍頭(見圖7(b))。槍頭配備有防土壤堵塞的開關裝置，進入土壤過程中開關關閉，進入土壤后開關打開，可釋放菌液。修復儀可根據對該處土壤的重金屬檢測情況來選擇是否打開底盤伸出槍頭進行處理，節約微生物資源。當接收到處理土壤的指令時，對應土壤pH的最適菌種進入底盤，底盤伸出，攜帶菌株至槍頭，槍頭開關打開，經壓力裝置使菌液進入土壤中。槍頭實現可伸縮，使其對土壤的作用深度較深，由表及里，達到立體去除約1 m深的土壤中主要重金屬離子的效果。

2.4.4 負重輪和發動機

由現有的拖拉機等大型農用機械的履帶式負重輪改裝，機動性較強，可適應四川地區的多種農田作業。

采用農用機械常用的15～73.5 kW中型柴油發動機。

3 結論

實驗獲得沙雷氏菌屬Serratiamarcuscens菌株FQ2，測定得FQ2對數生長期為培養開始5 h至20 h，最適條件為pH=5、溫度25℃，轉速180 r/min與140 r/min無明顯區別。重金屬耐受實驗檢測發現，FQ2具有較強的重金屬耐受力，其抗鎳濃度為500 mg/L，抗鉛濃度為900 mg/L，在鎳和鉛同時存在的情況下最高耐受100 mg/L鎳和100mg/L鉛。電鏡檢測發現FQ2對鉛有吸附作用。

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圖7 自動化重金屬污染微生物修復儀初步設計

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Research on microbial remediation of heavy metal contaminated soil

Deng Qiusui, Tang Xia, Cai Run, Xu Hanyue, Zhang Ruitao, Li Bingjie, Li Sichen, Xu Heng, Wang Hong

(College of Life Sciences, Sichuan University, Chengdu 610064, China)

Inactivation of heavy metals by microorganisms is used for preparing the microbial passivating agent and applying it to the treatment of heavy metal contaminated soil. Through the study on the properties of microorganisms in heavy metal contaminated soil, the fine strains CQ7 and FQ2 which can effectively deal with heavy metal pollution in soil are screened out. The screened strains are characterized, their growth curves are measured, and FQ2 is identified as gram negative bacillus. The physical and chemical conditions of the screened strains are further determined. The optimum conditions for the growth of CQ7 and FQ2 are pH=5, the rotational speed is 180 r/min and the temperature is 25℃. Through the metal tolerance and adsorption experiments, FQ2 is selected as the engineering bacteria and identified as the Serratia marcuscens by the sequence test. In combination of the screened strains with the corresponding physical and chemical conditions, the microbial passivator is prepared, and the automatic remedial equipment for the heavy metal contaminated soil is designed whose application prospect is primarily planned.

microbial passivator; heavy metal contamination; automatic remedial instrument

X53

A

1002-4956(2017)10-0043-07

10.16791/j.cnki.sjg.2017.10.013

2017-08-04

國家科技支撐計劃項目(2015BAD05B01-5)； 四川省科技支撐項目(2016NZ0050)

鄧秋穗(1996—)，女，廣西北海，本科生，主要從事微生物治理重金屬污染土壤研究

汪紅(1961—)，女，四川成都，高級實驗師，主要從事微生物實驗的教學和科研工作.

E-mail：wh002008@163.com