瘤苗聯合CpG ODN對白血病小鼠Treg細胞的影響

楊 云,白 菊,何愛麗,王芳俠,沈 瑩

(西安交通大學第二附屬醫院血液科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:yangyun108@163.com)

瘤苗聯合CpGODN對白血病小鼠Treg細胞的影響

楊 云*,白 菊,何愛麗,王芳俠,沈 瑩

(西安交通大學第二附屬醫院血液科,西安 710004;*通訊作者,E-mail:yangyun108@163.com)

目的 探討紅白血病FBL-3細胞瘤苗聯合CpG 1826治療白血病小鼠時調節性T細胞(regulatory T cells,Treg)的變化及其意義。 方法 50只小鼠隨機分為對照組、PBS組、瘤苗組、CpG 1826組和瘤苗加CpG 1826組,皮下注射紅白血病FBL-3細胞建立小鼠白血病模型,絲裂霉素C滅活FBL-3細胞制備瘤苗。PBS組、瘤苗組、CpG 1826組和瘤苗加CpG 1826組分別利用PBS、瘤苗、CpG 1826和瘤苗加CpG 1826進行治療,而對照組不進行任何處理。流式細胞術檢測小鼠脾細胞中Treg細胞百分率,逆轉錄聚合酶鏈反應(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)測定Foxp3 mRNA的表達,ELISA法檢測血清中IL-10水平。 結果 與對照組小鼠相比,PBS組、瘤苗組小鼠CD4+FoxP3+Treg細胞百分率、Foxp3 mRNA的表達水平、血清中IL-10水平明顯增高,差異具有統計學意義(P<0.05),而PBS組與瘤苗組小鼠之間差異無統計學意義(P>0.05)。CpG 1826組、瘤苗聯合CpG 1826組小鼠CD4+FoxP3+Treg細胞百分率、Foxp3 mRNA的表達水平、血清中IL-10水平比PBS組及瘤苗組明顯下降,差異具有統計學意義(P<0.05)。 結論 瘤苗聯合CpG 1826治療小鼠白血病時Treg細胞減少,Treg細胞在白血病及免疫治療中可能發揮了重要作用。

白血病; 免疫治療; 瘤苗; 調節性T細胞

目前白血病的治療主要依靠化療,但由于化療的毒副作用、耐藥及復發等原因限制了療效,隨著生物學技術的發展,白血病的免疫治療特別是腫瘤疫苗受到重視[1-4]。CpG ODN是指一類人工合成的含CpG基序的寡聚脫氧核糖核苷酸,可以激活小鼠或人的B淋巴細胞、NK細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞,動物實驗發現CpG ODN作為疫苗佐劑可以增強瘤苗的抗白血病效果[5-7]。Treg細胞是不同于Th1和Th2細胞、具有特異細胞膜表面分子和核轉錄因子的一類細胞亞群,在自身免疫、腫瘤免疫、移植免疫耐受及抗感染免疫等方面發揮重要的作用[8-10]。目前認為瘤苗和CpG ODN主要激活機體CTL、NK細胞發揮抗腫瘤作用[5,6],關于瘤苗及CpG ODN對Treg細胞的影響研究甚少。本實驗利用白血病FBL-3細胞建立白血病小鼠模型,并用絲裂霉素C滅活FBL-3細胞制備瘤苗,對白血病小鼠采用瘤苗聯合CpG ODN進行治療,觀察小鼠體內Treg細胞的變化。

1 材料和方法

1.1 細胞株及小鼠

小鼠紅白血病細胞株FBL-3細胞由西安交通大學生命科學院惠贈。6-8周齡雌性C57BL/6小鼠50只,清潔級,體質量18-21 g,由西安交通大學醫學院動物中心提供。小鼠生產許可證號為scxk(陜)2012-003。

1.2 主要試劑與儀器

TRIzol液為美國Invitrogen公司產品,逆轉錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司,SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ為大連寶生物工程有限公司產品,CpG 1826及PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成,小鼠IL-10 ELISA檢測試劑盒為美國R&D公司產品,PE anti-mouse FoxP3、FITC anti-mouse CD4購自美國eBioscience公司。冷凍高速離心機(5804)購自德國Eppendorf公司,酶標儀(ELx808)購自美國bio-tek公司,熒光定量PCR擴增儀(CFX96)購自美國Bio-Rad公司,FACS Calibur流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 小鼠白血病動物模型的建立及瘤苗制備

大量收集對數生長期小鼠紅白血病細胞FBL-3細胞,調整細胞濃度4×106/ml,取0.5 ml細胞懸液分別接種于C57BL/6小鼠皮下(對照組不接種細胞)制作白血病小鼠模型。

取對數生長期FBL-3細胞,加入絲裂霉素C(終濃度為100 μg/ml)滅活,37 ℃水浴30 min,2 000 r/min離心5 min,棄上清液,用PBS洗滌3次,調整細胞濃度至2×107/ml用作瘤苗備用。

1.4 實驗分組及免疫治療

6-8周齡雌性C57BL/6小鼠50只被隨機分為5組:對照組、PBS組、瘤苗組、CpG 1826組和瘤苗加CpG 1826組,每組10只。PBS組:0.2 ml PBS;瘤苗組:0.1 ml瘤苗+0.1 ml PBS;CpG 1826組:0.1 ml CpG 1826+0.1 ml PBS;瘤苗加CpG 1826組:0.1 ml CpG 1826+0.1 ml瘤苗。

小鼠接種白血病細胞7 d后開始給予免疫治療,兩肋皮下注射,每周1次,共4周。對照組為正常小鼠不做任何處理。

1.5 療效觀察

每天觀察各組小鼠注射部位有無紅腫、硬結、潰瘍等;觀察一般狀況、腫瘤緩解率、瘤結節生長、消退、復發、轉移情況及生存期;每周稱量小鼠體質量1次;觀察小鼠若處在瀕死狀態,則及時處死小鼠,分離脾臟組織,制備脾細胞懸液。

1.6 流式細胞術檢測脾細胞中Treg細胞

制備脾細胞單細胞懸液,調整細胞濃度至1×106/ml,取100 μl單細胞懸液加入FITC-CD4抗體,溫和混勻,常溫下避光孵育20 min。2 ml PBS洗滌、離心后棄上清;重懸細胞,加入2 ml 4 ℃ 1×固定液,溫和混勻后4 ℃避光孵育30 min。離心棄上清后加入2 ml 1×破膜液,37 ℃避光孵育30 min,離心棄上清后PBS洗滌細胞后重懸細胞,每管加入20 μl PE-Foxp3抗體,輕輕混勻后室溫避光孵育20 min。PBS洗滌2次,重懸細胞,應用FACS Calibur型流式細胞儀檢測,以CD4+T細胞為門通過Cellquest軟件進行收集分析數據。

1.7 RT-PCR測定Foxp3 mRNA的表達

采用TRIzol液提取脾細胞總RNA,利用逆轉錄試劑盒進行cDNA第一鏈合成,嚴格按照試劑盒說明書進行操作。根據文獻[11]報道合成Foxp3及內參HPRT引物,Foxp3上游引物:5′-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3′,下游引物:5′-TTCTCACAACCAGGCCACTTG-3′,產物大小89 bp;HPRT上游引物:5′-TGATTAGCGATGATGAACCAG-3′,下游引物:5′-AGAGGGCCACAATGTGATG-3′,產物大小171 bp。20 μl PCR擴增體系包括10 μl SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ(2×)、上下游引物各0.8 μl、2.0 μl DNA模板、6.4 μl ddH2O(滅菌蒸餾水),擴增條件為:95 ℃預變性30 s,95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,40個循環。擴增結束后采用Bio-Rad iQ520 Standard Edition Optical System Software V2.0分析數據。

1.8 ELISA檢測小鼠血清中IL-10水平

小鼠眼球取血后1 000 r/min離心5 min后收集上清,采用ELISA試劑盒進行檢測IL-10水平,試劑盒檢測范圍為15.6-1 000 pg/ml,嚴格按照試劑盒說明進行操作。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 各組小鼠一般狀況的觀察

免疫治療結束后觀察各組小鼠的一般狀況,對照組毛發正常有光澤,活動正常,精神好,進食活躍,體質量平穩增加;PBS組小鼠活動遲緩,毛發無光澤,精神萎靡,活動力明顯下降,有的最后喪失活動能力,瘤結節增長比較快,瘤體局部出現破潰;瘤苗組、CpG 1826組及瘤苗加CpG1826組小鼠毛發尚可、活動、進食正常,體質量變化不明顯,瘤體體積減小,瘤苗加CpG1826組小鼠在免疫治療后瘤體體積減小明顯。

2.2 生存分析

PBS組最長的生存時間是45 d,其中位生存時間是35 d;瘤苗組小鼠有2只長期存活(大于90 d),其中位生存時間為58 d;CpG 1826組小鼠有2只長期存活,中位生存時間為54 d;瘤苗加CpG 1826組有3只小鼠長期存活,中位生存期78 d;CpG 1826組、瘤苗加CpG 1826組的中位生存期均明顯長于PBS組,且瘤苗加CpG 1826組中位生存時間最長。

2.3 白血病小鼠免疫治療前后CD4+FoxP3+Treg細胞變化

取出小鼠脾臟后制備單細胞懸液,進行細胞內Foxp3染色后進行流式細胞檢測,以CD4+細胞設門進行分析,結果見圖1，2。結果顯示:對照組小鼠脾細胞中CD4+FoxP3+Treg細胞百分比為11.84%±1.56%,而PBS組小鼠體內CD4+FoxP3+Treg細胞數量明顯增多,為23.17%±3.89%,兩組相比差異有統計學意義(P<0.05)。瘤苗組小鼠體內CD4+FoxP3+Treg細胞百分比為21.41%±3.57%,與PBS組相比差異無統計學意義(P>0.05)。CpG 1826組小鼠體內CD4+FoxP3+Treg細胞數量明顯減少,百分比為15.57%±2.01%,與PBS組相比差異有統計學意義(P<0.05),瘤苗聯合CpG 1826時,CD4+FoxP3+Treg細胞百分比為15.09%±1.82%,明顯低于PBS組及瘤苗組(P<0.05),也高于對照組，差異有統計學意義(P>0.05)。

圖1 不同分組小鼠外周血CD4+FoxP3+Treg細胞百分比變化Figure 1 Percentage of CD4+FoxP3+Treg cells in peripheral blood of mice in different groups

與對照組比較,*P<0.05;與PBS組及瘤苗組比較,#P<0.05圖2 不同分組小鼠外周血CD4+FoxP3+Treg細胞百分比變化Figure 2 Percentage of CD4+FoxP3+Treg cells in peripheral blood of mice in different groups

2.4 白血病小鼠免疫治療前后核轉錄因子Foxp3 mRNA的表達變化

利用熒光定量PCR檢測了不同分組Treg細胞核轉錄因子Foxp3 mRNA表達情況,結果顯示,PBS組小鼠Foxp3 mRNA水平明顯高于對照組,差異具有統計學意義(P<0.05),瘤苗組小鼠Foxp3 mRNA與PBS組比較差異沒有統計學意義(P>0.05,見表1)。CpG 1826組、瘤苗聯合CpG 1826組小鼠Foxp3 mRNA水平均比PBS組及瘤苗組小鼠明顯下降,差異具有統計學意義(P<0.05),也明顯高于對照組(P<0.05,見表1)。

組別nFoxp3mRNAIL?10(pg/ml)對照組10734±196 2815±624 PBS組101585±357?15723±3125?瘤苗組101438±275?14358±2879?CpG1826組101019±228?#5776±1327?#瘤苗+CpG1826組10938±203?#5148±1247?#

與對照組比較,*P<0.05;與PBS組及瘤苗組比較,#P<0.05

2.5 白血病小鼠免疫治療前后小鼠血清中IL-10的水平變化

利用ELISA法檢測小鼠血清中IL-10水平,與對照組小鼠相比,PBS組小鼠血清中IL-10水平明顯增高,差異具有統計學意義(P<0.05),瘤苗組小鼠血清中IL-10水平與PBS組比較差異沒有統計學意義(P>0.05)。CpG 1826組、瘤苗聯合CpG 1826組小鼠血清中IL-10水平比PBS組及瘤苗組明顯下降,差異具有統計學意義(P<0.05),而且明顯高于對照組(P<0.05,見表1)。

3 討論

1995年Sakaguchi等[12]首先報道了小鼠體內天然存在一類CD4+T細胞表面持續表達CD25(IL-2受體α鏈),這群細胞占小鼠外周淋巴器官中CD4+T細胞的5%-10%。越來越多研究證實CD4+Foxp3+Treg細胞是一群有特異細胞膜表面分子和核轉錄因子并具有免疫抑制作用的T細胞亞群,在自身免疫、腫瘤免疫、移植免疫耐受及抗感染免疫等方面發揮重要的作用[8-10]。國內外研究證實CD4+Foxp3+Treg細胞在肺癌、胰腺癌、惡性黑色素瘤、胃腸道腫瘤、卵巢癌、肝癌等多種實體瘤中數量增多[13-17],研究還發現在白血病[18-21]、淋巴瘤[22,23]、多發性骨髓瘤[24-26]等惡性血液病中CD4+CD25+Treg細胞數量也增多,參與了疾病的發生發展過程。本實驗利用注射FBL-3細胞建立白血病小鼠模型,分離小鼠脾細胞進行研究后發現白血病小鼠體內CD4+FoxP3+Treg細胞數量明顯增多,Foxp3 mRNA及血清中IL-10水平升高,與對照小鼠相比差異有統計學意義(P<0.05),這與以往的臨床研究基本一致[18-21],說明Treg細胞參與了白血病的發病過程,在白血病的免疫逃逸中發揮重要作用。

腫瘤疫苗包括自體腫瘤細胞疫苗、多肽疫苗及DNA疫苗等，為腫瘤的免疫治療展示了新的前景。在動物實驗中,單獨應用或和其他的抗腫瘤制劑聯合應用的CpG ODN表現出了抗腫瘤的活性[27,28]。CpG ODN能增強MS11C6(抗淋巴瘤抗體)體內抗小鼠38C13淋巴瘤的功能[29],采用可移植的同系前B細胞急性白血病模型小鼠的研究發現,給小鼠先注射模擬最低疾病殘余狀態的ALL細胞,7 d后應用CpC ODN治療,小鼠的緩解期超過了6個月,研究發現CpGODN可通過激活固有免疫誘導早期急性白血病細胞的殺傷,從而產生治療作用,同時緩解的小鼠可抵抗ALL細胞的再次攻擊,這說明小鼠體內出現了ALL細胞的免疫記憶[30]。CpG 1826屬于B型CpG ODN,具有全硫代修飾骨架,其序列為5′-TCCATCACGTTCCTGACGTT-3′,研究發現可以刺激免疫細胞增殖,分化和分泌,產生IFN-α、IL-6等細胞因子,在抗白血病中發揮一定作用[7]。本實驗利用絲裂霉素C滅活FBL-3細胞制成瘤苗,對白血病小鼠進行瘤苗、CpG 1826治療,實驗結果顯示瘤苗聯合CpG 1826組生存時間最長,治療效果最好。分離小鼠脾細胞進行研究后發現利用瘤苗治療后,CD4+FoxP3+Treg細胞與白血病小鼠相比無顯著性差異,提示瘤苗發揮抗白血病作用不是通過減少Treg細胞來發揮的。單獨用CpG 1826治療時,小鼠體內CD4+FoxP3+Treg細胞數量明顯減少,Foxp3 mRNA及血清中IL-10水平降低,提示CpG 1826可以通過下調Foxp3使CD4+FoxP3+Treg細胞減少,IL-10分泌降低,從而發揮抗白血病作用。瘤苗聯合CpG 1826治療時,CD4+FoxP3+Treg細胞數量與CpG 1826治療組差異沒有統計學意義,但小鼠生存時間最長,治療效果最好,說明瘤苗聯合CpG 1826治療可以提高療效。

總之,本研究結果提示瘤苗聯合CpG 1826治療白血病時小鼠體內Treg細胞減少,Treg細胞可能在白血病及免疫治療中發揮了重要作用,但需要更進一步的實驗來研究Treg細胞在免疫治療中的具體作用,以期為白血病的免疫治療提供新的靶點。

[1] Lichtenegger FS, Krupka C, K?hnke T,etal. Immunotherapy for Acute Myeloid Leukemia[J]. Semin Hematol, 2015, 52(3):207-214.

[2] Smahel M. Antigens in chronic myeloid leukemia: implications for vaccine development[J]. Cancer Immunol Immunother, 2011, 60(12):1655-1668.

[3] Rezvani K. Peptide vaccine therapy for leukemia[J]. Int J Hematol, 2011, 93(3):274-280.

[4] Hofmann S, Mead A, Malinovskis A,etal. Analogue peptides for the immunotherapy of human acute myeloid leukemia[J]. Cancer Immunol Immunother, 2015, 64(11):1357-1367.

[5] Ursu R, Carpentier AF. Immunotherapeutic approach with oligodeoxynucleotides containing CpG motifs (CpG-ODN) in malignant glioma[J]. Adv Exp Med Biol, 2012, 746:95-108.

[6] Lin X, Chen J, Huang H. Immunostimulation by cytosine-phosphate-guanine oligodeoxynucleotides in combination with IL-2 can improve the success rate of karyotype analysis in chronic lymphocytic leukaemia[J]. Br J Biomed Sci, 2016, 73(3):110-114.

[7] 何愛麗,陳虹,張王剛,等.兩種CpG ODN佐劑對小鼠白血病局灶瘤的抗瘤作用研究[J].中國實驗血液學雜志,2007,15(5):1042-1045.

[8] Persa E, Balogh A, Sfrny G,etal. The effect of ionizing radiation on regulatory T cells in health and disease[J]. Cancer Lett, 2015, 368(2):252-261.

[9] Alroqi FJ, Chatila TA. T regulatory cell biology in health and disease[J]. Curr Allergy Asthma Rep, 2016, 16(4):27.

[10] Teh PP, Vasanthakumar A, Kallies A. Development and function of effector regulatory T cells[J]. Prog Mol Biol Transl Sci, 2015, 136:155-174.

[11] 李潔瓊,紀玉強,楊威,等.CpG ODN對Treg細胞及Th17細胞分化的影響[J].華中科技大學學報(醫學版),2015,44(4):383-389.

[12] Sakaguchi S,Sakaguchi N,Asano M,etal.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol,1995,155(3):1551-1164.

[13] Tanaka A, Sakaguchi S. Regulatory T cells in cancer immunotherapy[J]. Cell Res, 2017, 27(1):109-118.

[14] Singh M, Loftus T, Webb E,etal. Minireview: regulatory T cells and ovarian cancer[J]. Immunol Invest, 2016, 45(8):712-720.

[15] Wang K, Vella AT. Regulatory T cells and cancer: a two-sided story[J]. Immunol Invest, 2016, 45(8):797-812.

[16] Takeuchi Y, Nishikawa H. Roles of regulatory T cells in cancer immunity[J]. Int Immunol, 2016, 28(8):401-409.

[17] Roychoudhuri R, Eil RL, Restifo NP. The interplay of effector and regulatory T cells in cancer[J]. Curr Opin Immunol, 2015, 33:101-111.

[18] Ureshino H, Shindo T, Nishikawa H,etal. Effector Regulatory T Cells Reflect the Equilibrium between Antitumor Immunity and Autoimmunity in Adult T-cell Leukemia[J]. Cancer Immunol Res, 2016, 4(8):644-649.

[19] Idris SZ, Hassan N, Lee LJ,etal. Increased regulatory T cells in acute lymphoblastic leukemia patients[J]. Hematology, 2015, 20(9):523-529.

[20] Jadidi-Niaragh F, Ghalamfarsa G, Yousefi M,etal. Regulatory T cells in chronic lymphocytic leukemia: implication for immunotherapeutic interventions[J]. Tumour Biol, 2013, 34(4):2031-2039.

[21] Ustun C, Miller JS, Munn DH,etal. Regulatory T cells in acute myelogenous leukemia: is it time for immunomodulation?[J]. Blood, 2011, 118(19):5084-5095.

[22] Pizzi M, Boi M, Bertoni F,etal. Emerging therapies provide new opportunities to reshape the multifaceted interactions between the immune system and lymphoma cells[J]. Leukemia, 2016, 30(9):1805-1815.

[23] Grygorowicz MA, Biernacka M, Bujko M,etal. Human regulatory T cells suppress proliferation of B lymphoma cells[J]. Leuk Lymphoma, 2016, 57(8):1903-1920.

[24] Ercetin AP, Ozcan MA, Aktas S,etal. Ex vivo evaluation of the effect of regulatory T cells on the anti-tumor activity of bortezomib in multiple myeloma[J]. Exp Hematol, 2016, 44(4):223-230.

[25] Ma Y, Lei H, Tan J,etal. Characterization of γδ regulatory T cells from peripheral blood in patients with multiple myeloma[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2016, 480(4):594-601.

[26] Raja KR, Hajek R. Contribution of regulatory T cells to immunosuppression and disease progression in multiple myeloma patients[J]. Oncoimmunology, 2013, 2(9):e25619.

[27] Yan W, Sun TY, Yang CM,etal. CpG ODN 1826 enhances radiosensitivity of the human lung cancer cell line A549 in a rat model[J]. Genet Mol Res, 2015, 14(3):9804-9812.

[28] Makkouk A, Joshi VB, Wongrakpanich A,etal. Biodegradable microparticles loaded with doxorubicin and CpG ODN for in situ immunization against cancer[J]. AAPS J, 2015, 17(1):184-193.

[29] Wooldridge JE, Ballas Z, Krieg AM,etal. Immunostimulatory oligodeoxynucleotides containing CpG motifs enhance the efficacy of monoclonal antibody therapy of lymphoma[J]. Blood, 1997, 89(8): 2994-2998.

[30] Seif AE, Barrett DM, Milone M,etal. Long-term protection from syngeneic acute lymphoblastic leukemia by CpG ODN-mediated stimulation of innate and adaptive immune responses[J]. Blood, 2009, 114(12): 2459-2466.

EffectoftumorvaccinecombinedwithCpGODNonTregcellsinmicewithleukemia

YANG Yun*,BAI Ju,HE Aili,WANG Fangxia,SHEN Ying

(DepartmentofHematology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710004,China;*Correspondingauthor,E-mail:yangyun108@163.com)

ObjectiveTo explore the effect of tumor vaccine combined with CpG ODN on change of regulatory T(Treg) cells in mice with leukemia.MethodsFifty mice were randomly divided into control group, PBS group, tumor vaccine group, CpG 1826 group and tumor vaccine with CpG group(combination group).The animal model of mouse with leukemia was established by subcutaneous injection with erythroleukemia FBL-3 cells. Tumor vaccine was prepared by mitomycin C inactivating FBL-3 cells. The mice in PBS group, tumor vaccine group, CpG 1826 group and combination group were treated with PBS, tumor vaccine, CpG 1826 and tumor vaccine+CpG, respectively. The mice in control group

no treatment. The percentages of Treg cells were detected by flow cytometry and the expression levels of Foxp3 mRNA were detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). Serum IL-10 levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA).ResultsCompared with normal control group, the percentages of CD4+FoxP3+Treg cells,the mRNA expression of Foxp3 and the serum IL-10 levels in PBS group and tumor vaccine group were statistically increased(P<0.05), but there was no significant difference between PBS group and tumor vaccine group(P>0.05). The percentage of CD4+FoxP3+Treg cells,the mRNA expression of Foxp3 and the serum IL-10 levels in CpG 1826 group and combination group were statistically lower than those in PBS group and tumor vaccine group(P<0.05).ConclusionThe tumor vaccine combined with CpG ODN may reduce Treg cells in mice with leukemia, and Treg cells may play roles in lukemia and immunotherapy.

leukemia; immunotherapy; tumor vaccine; regulatory T cells

R733.7

A

1007-6611(2017)09-0930-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.014

西安市科技計劃基金資助項目(SF1418)

楊云,女,1970-10生,博士,副主任醫師,E-mail:yangyun108@163.com

2017-04-24