甲基強的松龍聯合過表達BDNF的ADSCs在治療大鼠急性脊髓損傷中的作用

姬文晨,蔣婉婷,張黨鋒,馮 嬌,韓亞紅,李 萌*

(1西安交通大學第一附屬醫院骨科,西安 710061;2西安市第四醫院超聲診斷科;*通訊作者,E-mail:drleemon@163.com)

甲基強的松龍聯合過表達BDNF的ADSCs在治療大鼠急性脊髓損傷中的作用

姬文晨1,蔣婉婷2,張黨鋒1,馮 嬌1,韓亞紅1,李 萌1*

(1西安交通大學第一附屬醫院骨科,西安 710061;2西安市第四醫院超聲診斷科;*通訊作者,E-mail:drleemon@163.com)

目的 觀察甲基強的松龍(MP)聯合過表達腦源性神經生長因子(BDNF)的脂肪干細胞(ADSCs)在治療大鼠急性脊髓損傷(SCI)中的作用。 方法 48只SD大鼠脊髓損傷模型分為4組:對照組(切斷脊髓,未給予治療措施)、甲基強的松龍組[MP組:脊髓損傷后,首次30 mg/kg的劑量尾靜脈內注射MP,之后5.4 mg/(kg·h)的劑量維持23 h]、過表達BDNF的ADSCs組(ADSCs/BDNF-GFP組：尾靜脈注入BDNF基因轉染的ADSCs 10 μl)和聯合組(ADSCs/BDNF-GFP+MP組)。術后1，2，4周,比較各組大鼠后肢功能恢復情況(BBB評分)、脊髓組織中BDNF的表達情況和脊髓組織細胞的凋亡率。術后4周,檢測脊髓組織凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2的表達情況。 結果 聯合組的BBB評分和BDNF表達高于其余3組(P<0.05)。聯合組凋亡率低于其余3組(P<0.05),Western blot結果顯示聯合組可以降低脊髓組織中Bax的含量,提高Bcl-2的含量。 結論 甲基強的松龍聯合過表達BDNF的ADSCs有利于大鼠脊髓損傷功能的修復,可能與增加BDNF的表達和減少脊髓細胞的凋亡有關。

甲基強的松龍; 腦源性神經生長因子; 脂肪間充質干細胞; 脊髓損傷

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)是由于車禍傷、墜落傷等創傷原因引起的脊髓橫慣性損害,會導致損傷平面以下運動、感覺、括約肌及自主神經等功能障礙,造成患者中樞神經系統感覺運動功能不可逆性損傷,進而嚴重影響患者的生活質量[1,2]。SCI的治療方法主要是手術減壓和激素沖擊,但這些方法效果有限[3]。近年來干細胞移植治療SCI逐漸受到人們重視,其中最有潛力的是脂肪干細胞(adipose-derived stem cells,ADSCs),ADSCs具有定向遷移分化的能力以及旁分泌神經營養因子的特點,為治療SCI提供了新的思路[4,5]。然而,既往研究表明單純使用ADSCs治療SCI雖然有一定的效果,但距離預期效果相差甚遠,究其原因在于:脊髓損傷局部免疫炎癥反應導致移植遷移至損傷處的ADSCs難以存活;ADSCs分泌促神經修復因子的時間較短,導致修復效果受限[6-8]。甲基強的松龍(methylprednisolone,MP)是治療急性SCI的常用藥物,可以有效抑制SCI局部的炎癥反應[9]。腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)作為一種神經生長因子,對于神經的修復、干細胞的存活及分化有著重要意義[10]。所以,本研究利用甲基強的松龍聯合過表達BDNF的ADSCs治療SCI,期待這種方法可以提高修復效果,為后期實驗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3月齡雌性SD大鼠60只,清潔級,體質量200-250 g。其中48只用于SCI造模,12只用于提取ADSCs。動物由西安交通大學醫學部動物實驗中心提供,生產許可證號:SCXK(陜)08-018。本研究經西安交通大學醫學部倫理委員會批準。

1.2 主要試劑與儀器

pAdEasy-BDNF-GFP病毒液,由西安交通大學第一附屬醫院轉化醫學中心實驗室構建;甲基強的松龍(輝瑞公司,美國,規格40 mg/支,批號:1005231),Ⅰ型膠原酶(Sigma,美國),TUNEL凋亡試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司),RIPA蛋白提取液(武漢博士德生物工程有限公司),β-actin、Bcl-2、Bax抗體(Abcam公司,美國),ReverTra Ace qPCR逆轉錄試劑盒及定量試劑盒(Takara公司,日本),倒置相差顯微鏡(Olympus,日本,型號:CKX53);數碼顯微照相系統(Nikon公司,日本,型號:DS-Ri1-U2)。

1.3 ADSCs分離與培養

參照課題組前期獲得ADSCs的實驗方案[11,12]:戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉SD大鼠,無菌切取脂肪組織,剪碎,移至50 ml離心管中,加入等體積0.1%Ⅰ型膠原酶，37 ℃、150 r/min震蕩消化50 min,加入含20%FBS的DMEM/F12終止消化,2 700 r/min離心10 min,棄上清,加入PBS,吹打均勻;用200目濾網過濾,以1 600 r/min離心10 min,沉淀物用DMEM/F12培養液重懸,以1×105個/ml的細胞密度接種于25 cm2培養瓶中,置入CO2孵育箱中,細胞融合達90%后,按1 ∶3的比例傳代。此時的細胞稱為第1代細胞。

1.4 pAdEasy-BDNF-GFP感染ADSCs

參照宋晨陽等的實驗方法[13]:取第3代ADSCs,按照1×106個/孔的密度接種于48孔板中,培養2 d,移除培養液,取pAdEasy-BDNF-GFP病毒液(實驗組)和pAdEasy-GFP病毒液(對照組),各制備成1×105,1×106,1×107,1×108,1×109,1×1010PFU/ml 6種不同滴度的病毒滴度,每種滴度病毒液加入4孔,另設4孔作為空白對照,細胞于孵箱內繼續培養48 h,定期檢測轉染率并確定最佳病毒滴度。本實驗的最佳病毒滴度為1.25×1010PFU/ml。

1.5 脊髓損傷模型的建立與動物分組

參照陳霄雷等[14]制作大鼠脊髓損傷打擊模型。造模成功后,將大鼠隨機分為4組,每組12只(ADSCs密度均為1×106/ml)。對照組:SCI后不給任何處理措施;MP組:首次30 mg/kg的劑量尾靜脈內注射MP,之后5.4 mg/(kg·h)的劑量維持23 h;BDNF轉染ADSCs組(ADSCs/BDNF-GFP):尾靜脈注入BDNF基因轉染的ADSCs 10 μl;聯合組:MP+ADSCs/BDNF-GFP。

1.6 術后大鼠后肢功能恢復情況評估(BBB評分)

術后1,2,4周對大鼠活動進行記錄,根據后肢體位、活動范圍、活動方式等進行BBB評分。評分越高說明大鼠運動功能恢復越好,完全正常為21分,沒有功能為0分,可以間接反映大鼠脊髓損傷后功能的恢復情況。

1.7 BDNF mRNA的表達檢測

術后1,2,4周,各組取3只SD大鼠斷頸處死,提取脊髓總RNA,使用ReverTra Ace qPCR逆轉錄試劑盒合成cDNA。BDNF引物:5′-CTACGAGACCAAGTGCAATCC-3′(上游);5′-AATCGCCAGCCAATTCTCTTT-3′(下游)。β-actin引物:5′-AGATCCTGACCGAGCGTGGC-3′(上游);5′-CCAGGGAGGAAGAGGATGCG-3′(下游)。使用SYBR?Green Real-time PCR Master Mix試劑盒進檢測。采用2-ΔΔCt法對數據進行統計處理。

1.8 TUNEL檢測脊髓組織細胞凋亡

術后1,2,4周各組取出3只SD大鼠,切取包括脊髓損傷處上下各1 cm的組織,放置于4%的多聚甲醛中固定2 d,梯度脫水后,石蠟包被切片。TUNEL染色具體步驟按照試劑盒說明書進行,陽性細胞的細胞核呈棕色。細胞凋亡率(%)=凋亡細胞數/鏡下細胞總數×100%。

1.9 Western blot檢測Bcl-2、Bax及NSE的相對表達量

術后4周,各組取出3只SD大鼠,切除包括脊髓損傷處上下各1 cm的脊髓組織,RIPA裂解液提取脊髓總蛋白。使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量。取各組等量(50 μg)總蛋白在SDS-PAGE上電泳,之后轉移到硝酸纖維膜上。5%去脂奶粉封閉2 h,一抗β-actin、Bcl-2和Bax(1 ∶10 000稀釋)4 ℃孵育過夜,按1 ∶10 000稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育,曝光洗片后,用Image Lab 8.0軟件檢測各組蛋白的相對表達量。

1.10 統計學分析

采用SPSS18.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差表示,組間比較采用單因素方差分析,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 術后大鼠后肢功能恢復情況

術后1周,各組BBB評分差異無統計學意義(見表1)。術后2周和4周,MP組、ADSCs/BDNF-GFP組、聯合組與對照組相比,BBB評分差異有統計學意義(P<0.05);聯合組與MP組和ADSCs/BDNF-GFP組相比,BBB評分差異有統計學意義(P<0.05);MP組和ADSCs/BDNF-GFP組相比,BBB評分差異無統計學意義。4周時,聯合組BBB評分升高到12.12±1.11。

表1術后大鼠后肢功能恢復(BBB評分)情況

Table1Functionalrecovery(BBBscores)ofhindlimbsafteroperation

分組n術后1周 術后2周 術后4周 對照組12050±002083±018#△192±043#△MP組12058±011233±027?598±077?ADSCs/BDNF?GFP組12061±008275±015?611±071?聯合組12072±010475±011?#△1212±111?#△

與對照組相比,*P<0.05;與MP組相比,#P<0.05;與ADSCs/BDNF-GFP組相比,△P<0.05

2.2 術后BDNF表達情況

術后1周,與對照組相比,ADSCs/BDNF-GFP組和聯合組差異有統計學意義(P<0.05);聯合組與MP組和ADSCs/BDNF-GFP組相比,BDNF表達差異有統計學意義(P<0.05);MP組與ADSCs/BDNF-GFP組相比,差異有統計學意義(P<0.05)。術后2周和4周,MP組、ADSCs/BDNF-GFP組、聯合組與對照組相比,差異有統計學意義(P<0.05);聯合組與MP組和ADSCs/BDNF-GFP組相比,差異有統計學意義(P<0.05);MP組和ADSCs/BDNF-GFP組相比,差異無統計學意義(見表2)。

表2術后各組BDNF表達量情況

Table2ExpressionofBDNFineachgroupatdifferenttimeafteroperation

分組n術后1周 術后2周 術后4周 對照組3021±002△016±003#△007±001#△MP組3025±004△051±004?039±004?ADSCs/BDNF?GFP組3085±007?#062±003?043±011?聯合組3111±004?#△125±028?#△194±021?#△

與對照組相比,*P<0.05;與MP組相比,#P<0.05;與ADSCs/BDNF-GFP組相比,△P<0.05

2.3 各組凋亡率的比較

術后1周,各組凋亡率差異無統計學意義(見表3)。術后2周和4周,MP組、ADSCs/BDNF-GFP組、聯合組與對照組相比,差異有統計學意義(P<0.05);聯合組與MP組和ADSCs/BDNF-GFP組相比,差異有統計學意義(P<0.05),其中4周時,聯合組細胞凋亡率進一步下降到6.13±2.73(見圖1);MP組和ADSCs/BDNF-GFP組相比,差異無統計學意義。

表3各組脊髓凋亡率比較(%)

Table3Comparisonoftheapoptosisrateamongfourgroups(%)

分組n術后1周 術后2周 術后4周 對照組32858±2264032±769#△2764±330#△MP組32536±1382015±232?1429±004?ADSCs/BDNF?GFP組32632±2152125±003?1326±218?聯合組32412±3211725±165?#△613±273?#△

與對照組相比,*P<0.05;與MP組相比,#P<0.05;與ADSCs/BDNF-GFP組相比,△P<0.05

A.對照組;B.MP組;C.ADSCs/BDNF-GFP組;D.聯合組;箭頭為陽性細胞,胞質呈棕褐色圖1 術后4周各組脊髓組織細胞凋亡TUNEL染色(×200)Figure 1 TUNEL staining of cell apoptosis in each group at 4 week after operation (×200)

2.4 各組凋亡蛋白與抗凋亡蛋白的比較

術后4周,Western blot結果顯示,MP組、ADSCs/BDNF-GFP組、聯合組Bax的表達量低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05);其中,聯合組與MP組和ADSCs/BDNF-GFP組相比,Bax的表達量較低,差異有統計學意義(P<0.05);MP組與ADSCs/BDNF-GFP組相比,差異無統計學意義。

MP組、ADSCs/BDNF-GFP組、聯合組Bcl-2的表達量高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05，見圖2);其中,聯合組與MP組和ADSCs/BDNF-GFP組相比,Bcl-2的表達量較高,差異有統計學意義(P<0.05);MP組和ADSCs/BDNF-GFP組相比,差異無統計學意義(見圖2)。

與對照組相比,*P<0.05圖2 術后4周各組Bax以及Bcl-2蛋白表達Figure 2 Expression of Bax and Bcl-2 proteins in each group at 4 week after operation

3 討論

SCI主要包括原發性損傷(機械性創傷)和繼發性損傷(缺血、缺氧、自由基的形成)[16]。目前,治療SCI主要集中于減輕繼發性損傷,防止并發癥的發生,治療原則包括以下幾方面:①減少神經元細胞的死亡;②抑制膠質瘢痕增生;③促進軸突生長;④抑制免疫炎癥反應;⑤促進再生軸突建立功能性突觸;其中治療的關鍵是抑制免疫炎癥反應和減少神經元的死亡[17,18]。近年來干細胞移植治療SCI逐漸成為研究熱點,干細胞具有歸巢能力,可以遷移至損傷處,在微環境下分化為神經元,從而代替死亡的神經元;可以分泌神經生長因子,改善局部微環境,從而有利于軸突生長[19,20]。但是,既往研究表明,單一使用干細胞治療SCI效果不佳,分析原因在于:①SCI局部存在免疫炎癥反應,導致遷移至損傷處的干細胞難以從活；②干細胞分泌神經生長因子量較少,難以滿足SCI修復需求[21]。

甲基強的松龍(MP)治療急性SCI是臨床常用且公認的治療方案,傷后8 h內,首次30 mg/kg靜脈推注,繼以5.4 mg/(kg·h)的劑量維持23 h,主要作用機制為減少氧自由基形成,抑制脂質過氧化反應,減輕細胞水腫和炎癥反應,逆轉細胞內Ca2+凝聚[22,23]。BDNF可以作用于感覺神經元、小腦神經元、運動神經元、海馬區的神經元以及視網膜節細胞等,是最為常見的一種神經生長因子;劉志剛等[24]在其實驗中證實腺病毒介導hBDNF修飾BMSCs靜脈移植治療大鼠SCI,能促進神經結構的修復及神經功能的恢復。康德智等[25]用BDNF轉染ADSCs治療SCI,發現轉染后的干細胞可以遷移到損傷部位分化為神經元,與此同時他們認為BDNF的高表達是ADSCs向神經元樣細胞分化的重要原因。基于此,我們將MP聯合過表達BDNF的ADSCs移植治療SCI,期待可以提高SCI的修復效果。

本研究中,術后2周和4周,聯合組的BBB評分高于其余三組(P<0.05),表明聯合組可提高SCI后動物肢體的運動能力;聯合組的凋亡率低于其余三組(P<0.05),表明聯合組可以降低SCI后細胞凋亡率。術后4周Western blot結果顯示聯合組可以降低Bax的含量,提高Bcl-2的含量,進一步驗證了MP聯合ADSCs/BDNF-GFP可以降低脊髓細胞的凋亡率。另外,術后1,2,4周,聯合組BNDF表達高于ADSCs/BDNF-GFP組(P<0.05),這是因為聯合組中的MP可以減輕局部免疫炎癥反應,使得遷移至損傷處存活的干細胞增多,從而使得BDNF表達量增多。1周時,ADSCs/BDNF-GFP組BDNF表達高于MP組(P<0.05),2周和4周時二者差異無統計學意義,這是由于經腺病毒轉染的ADSCs,僅能實現BDNF一過性呈高表達,隨著時間的推移BDNF表達逐漸減弱。由上可知,聯合組BBB評分高,BDNF表達高,凋亡率低,對照組評分低,BDNF表達低,凋亡率高,這就說明聯合組促進大鼠后肢功能的恢復可能與抗凋亡作用和BDNF過表達有關,分析其可能的機制如下:①MP可以減輕SCI局部的免疫炎癥反應,使得遷移至損傷處存活的ADSCs的數量增加;②ADSCs過表達BDNF,一方面可以改善微環境,維持神經元存活,最大程度抑制SCI后神經細胞的凋亡,保護殘存神經元的功能;另一方面可以促進ADSCs向神經元分化代替死亡神經元。

本研究證實甲基強的松龍聯合過表達BDNF的ADSCs有利于大鼠SCI后功能的修復,其可能與增加BDNF的表達和減少脊髓細胞的凋亡有關,這一結果對于后期進一步研究SCI的修復機制有著重要意義。

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Roleofcombinationofmethylprednisoloneandadipose-derivedstemcells(ADSCs)overexpressingbrain-derivedneurotrophicfactor(BDNF)inthetreatmentofacutespinalcordinjuryofrats

JI Wenchen1,JIANG Wanting2,ZHANG Dangfeng1,FENG Jiao1,HAN Yahong1,LI Meng1*(1

DepartmentofOrthopaedics,FirstAffiliat-edHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China;2DepartmentofUltrasoundDiagnosis,theFourthHospitalofXi'an;*Correspondingauthor,E-mail:drleemon@163.com)

ObjectiveTo evaluate efficacy of the combination of methylprednisolone(MP) and adipose-derived stem cells(ADSCs) with over-expressed brain-derived neurotrophic factor(BDNF) in the treatment of acute spinal cord injury of rats.MethodsForty-eight rat models with spinal cord injuries were divided into four groups: control group (spinal cord was cut off but not treated), methylprednisolone(MP) group, ADSCs with over-expressed BDNF(ADSCs/BDNF-GFP) group and combination group(ADSCs/BDNF-GFP+MP group). The rats were injected with the first dose of 30 mg/kg MP into the caudal vein after spinal cord injury and then 5.4 mg/(kg·h) MP for 23 h in MP group. The rats were injected with 10 μl of ADSCs transfected with BDNF via caudal vein in ADSCs/BDNF-GFP group. The functional recovery of the hind limbs(BBB scores),BDNF expression in the spinal cord tissues and the cell apoptosis rate in the spinal cord tissues were compared at 1 week, 2 week and 4 week after the operation. Expression of Bax and Bcl-2 proteins was detected at 4 week after the operation.ResultsBBB scores and BDNF expression in combination group were higher than those in the other three groups(P<0.05). The apoptosis rate was lower in combination group than in the other three groups(P<0.05). Western blot results showed that the expression of Bcl-2 was increased and the expression of Bax was inhibited in combination group.ConclusionThe combination of MP and ADSCs with over-expressed BDNF is favorable for functional recovery of rats with spinal cord injuries, which may be related to the increase of BDNF expression and the reduction of apoptosis of spinal cord cells.

methylprednisolone; brain-derived neurotrophic factor; adipose-derived stem cells; spinal cord injury

R681

A

1007-6611(2017)09-0908-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.009

西安市科技計劃基金資助項目(2016050SF/YX06-1);西安交通大學第一附屬醫院院基金資助項目(2015YK27)

姬文晨,男,1985-05生,博士,主治醫師,助理研究員,E-mail:jiwenchenbaoyan@163.com

2017-05-04