堿性成纖維細胞生長因子對大鼠急性脊髓損傷后內質網應激蛋白Caspase12表達的影響

趙 琳,賈鯤鵬,沈 娟,郝 琴,陳雅慧,楊彥玲*

(1延安大學醫學院人體解剖學教研室,延安 716000;2延安大學附屬醫院兒科;*通訊作者,E-mail:yangyanling8889@163.com)

堿性成纖維細胞生長因子對大鼠急性脊髓損傷后內質網應激蛋白Caspase12表達的影響

趙 琳1,賈鯤鵬2,沈 娟1,郝 琴1,陳雅慧1,楊彥玲1*

(1延安大學醫學院人體解剖學教研室,延安 716000;2延安大學附屬醫院兒科;*通訊作者,E-mail:yangyanling8889@163.com)

目的 觀察堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)對大鼠急性脊髓損傷后內質網應激蛋白Caspase12表達的影響。 方法 90只8-10周 SD大鼠隨機分為假手術組(sham)、急性脊髓損傷(SCI)組和bFGF治療組(SCI+bFGF),分別于損傷后12 h，1 d，3 d，7 d和14 d,采用Rivlin斜板試驗評估大鼠運動功能;采用TUNEL法檢測神經細胞凋亡,免疫組化法觀察受損節段脊髓組織中Caspase12的表達。 結果 SCI組和SCI+bFGF組各個時間點斜板度數均值與sham組比較,差異有統計學意義(P<0.01);SCI+bFGF組Rivlin斜板試驗角度7 d(36.30°±2.82°)、14 d(46.50±2.98)與SCI組7 d(28.20°±2.78°)、14 d(33.30°±2.88°)比較,差異有統計學意義(P<0.05,0.01);SCI組較sham組細胞凋亡增加[(14.20±2.12)%vs(2.35±0.62)%,P<0.01],SCI+bFGF組[(10.32±1.68)%]較SCI組細胞凋亡減少(P<0.01);Caspase12的表達SCI組較sham組升高(12.20±1.02vs2.10±0.20,P<0.01),SCI+bFGF組(7.50±0.60)較SCI組降低(P<0.01)。 結論 急性脊髓損傷后Caspase12的表達明顯升高,bFGF對Caspase12的表達具有抑制作用。

bFGF; 脊髓損傷; 內質網應激; 細胞凋亡

脊髓損傷是中樞神經系統的嚴重創傷,可造成損傷平面以下運動、感覺等不完全或完全喪失,導致脊髓相關神經功能障礙甚至截癱,給家庭和社會帶來沉重的經濟負擔。脊髓損傷可由原發性損傷和繼發性損傷兩種不同機制引起[1],對繼發性損傷進行干預并促進神經功能修復是脊髓損傷后治療成功的關鍵[2]。脊髓神經元細胞凋亡是繼發性脊髓損傷加重的主要原因,既往研究認為死亡受體途徑和線粒體依賴途徑可以誘導繼發性脊髓損傷的細胞凋亡[3],近年發現內質網應激通路也可以介導神經細胞凋亡,而Caspase12是內質網應激特有的凋亡途徑[4]。

堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是成纖維細胞生長因子家族的重要成員,在創傷愈合、組織修復與再生等方面有重要作用[5],尤其在神經損傷修復方面備受人們關注。Lee等[6]研究表明,成年大鼠脊髓挫傷后,持續髓內灌注bFGF,脊髓損傷區明顯減少。Rabchevsky等[7]選用蛛網膜下腔置管,微量泵連續給予外源性bFGF 1周,發現脊髓損傷大鼠運動功能有明顯恢復。說明bFGF可以促進脊髓損傷的修復,但其機制如何,bFGF是否通過抑制內質網應激誘導細胞凋亡,發揮對脊髓損傷的保護作用鮮有報道。我們推測bFGF可能通過抑制神經細胞中Caspase12的表達,阻斷內質網應激,減輕細胞凋亡,從而發揮脊髓損傷后的神經保護作用。本研究擬通過觀察bFGF對大鼠急性脊髓損傷后內質網應激蛋白Caspase12表達及脊髓細胞凋亡的影響,探討bFGF對急性脊髓損傷后神經細胞保護作用的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SD大鼠90只,8-10周齡,SPF級,體質量220-240 g,雌性,由延安大學醫學院中心實驗室提供,許可證號:SCXK(陜)2012-003。

1.2 主要試劑

bFGF(英國abcam),兔抗Caspase12(英國abcam),抗兔生物素化二抗(深圳欣博盛生物科技有限公司),鏈親和素標記HRP(深圳欣博盛生物科技有限公司),TUNEL試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司。

1.3 制備大鼠脊髓損傷模型

2%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔麻醉大鼠,制備大鼠急性脊髓打擊損傷模型,采用HI-0400脊髓打擊器,損傷力度200 kdyn/cm2,造成大鼠脊髓不完全損傷。損傷區以下經蛛網膜下腔置入PE10細導管至脊髓損傷遠端約1 cm處,以1-0絲線依次縫合切口,絲線牢固固定導管。脊髓損傷模型造模成功標準:被打擊后,脊髓損傷處出血、水腫,大鼠出現擺尾反射、軀體及雙下肢回縮樣撲動,雙下肢呈弛緩性癱瘓。術后死亡及置管脫出的繼續造模予以補充。術后常規腹腔注射青霉素鈉20萬U/kg,每日膀胱按摩2次至大鼠自主排尿反射建立。

1.4 動物分組及給藥方法

SD大鼠隨機分成假手術組(sham)、bFGF治療組(SCI+bFGF)和急性脊髓損傷組(SCI)3組,sham組只打開椎板暴露脊髓,不進行打擊;SCI+bFGF組術后即刻及每天以微量注射器經導管注入bFGF 20 μl,7 d后每周1次;SCI組相同時相點給予等量生理鹽水;三組又各分為12 h,1 d,3 d,7 d,14 d 5個亞組(每組6只)。

1.5 脊髓組織取材

各組大鼠于不同時間點麻醉,固定,暴露心臟,自升主動脈快速灌注100 ml生理鹽水,再用4%多聚甲醛400 ml灌注固定至僵硬,以損傷中心上下各1.5 cm取脊髓組織3 cm,置于4%多聚甲醛后固定24 h,脫水、石蠟包埋、切片,片厚約5 μm。用于TUNEL染色和免疫組化染色。

1.6 Rivlin斜板試驗評估大鼠運動功能

在斜板表面墊上約5 mm厚的橡膠墊,放大鼠于斜板上,身體軸線與斜板縱軸垂直,逐漸增加斜板與水平面之間的夾角,記錄大鼠剛好在斜板上停留5 s這一角度。每只大鼠每次測量3次。

1.7 缺口原位末端標記測定法(TUNEL)檢測脊髓細胞凋亡指數

從每組隨機抽取1張脊髓損傷組織切片進行TUNEL染色。切片脫蠟入水,用3%H2O2室溫孵育10 min,接著1 ∶200蛋白酶K 37 ℃孵育10 min,在切片上滴加脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)及標記液,光鏡下控制DAB呈色,TUNEL陽性細胞的胞核呈棕黃色,計算凋亡指數并取均值,凋亡指數(%)=(凋亡細胞數/總細胞數)×100。

1.8 免疫組化染色檢測Caspase12表達

切片經脫蠟、水化、3%H2O2處理、0.01 mol/L檸檬酸緩沖液95 ℃抗原修復20 min,室溫下自然冷卻,山羊血清封閉30 min,加兔抗Caspase12 IgG(1 ∶250,Abcam)37 ℃孵育1 h、抗兔生物素化二抗(即用型,欣博盛)37 ℃過夜、鏈親和素標記HRP(即用型,欣博盛)37 ℃孵育30 min,DAB顯色,蘇木素復染5 min,0.1%鹽酸酒精分化,脫水、透明和封片。光學顯微鏡下觀察脊髓組織陽性細胞呈現棕褐色。每組選取3張不連續切片,統計每單位面積內(mm2)Caspase12陽性細胞數。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 三組大鼠不同時間點Rivlin斜板實驗臨界度數均值比較

SCI組和SCI+bFGF組各個時間點斜板臨界度數均值與sham組比較,差異有統計學意義(P<0.01);術后12 h，1 d和3 d,SCI+bFGF組和SCI組斜板臨界度數的均值比較,差異無統計學義;術后7 d, SCI+bFGF組斜板臨界度數高于SCI組,差異有統計學意義(P<0.05);術后14 d,SCI+bFGF組比SCI組高(P<0.01,見表1),而且增加更為明顯。

組別12h 1d 3d 7d 14d sham組6300±06300±06300±06300±06300±0 SCI組 880±110?1960±212?2450±252?2820±278?3330±288? SCI+bFGF組 890±120?2210±236?3020±263?3630±282?#4650±298?##

與sham組比較,*P<0.01;與SCI組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.2 脊髓細胞TUNEL染色結果

觀察三組7 d時的細胞凋亡情況發現,SCI組存在大量陽性凋亡細胞,其凋亡指數為(14.20±2.12)%,較sham組[(2.35±0.62)%]明顯增多(P<0.01),而SCI+bFGF組[(10.32±1.68)%]較SCI組細胞凋亡有所減輕(P<0.01,見圖1)。

2.3 Caspase12免疫組化結果

給予bFGF 7 d后發現,Caspase12在sham組僅有少量陽性細胞表達,SCI組Caspase12陽性細胞[(12.20±1.02)個]較sham組[(2.10±0.20)個]明顯增多(P<0.01),在脊髓灰質散在分布,以神經元細胞為主,免疫陽性細胞胞漿呈棕褐色,細胞核也呈現不同程度棕褐色(見圖2);SCI+bFGF組[(7.50±

0.60)個]陽性細胞數較SCI組減少(P<0.01)。

與sham組比較,*P<0.01;與SCI組比較,#P<0.01圖1 脊髓損傷后三組細胞凋亡指數比較Figure 1 Comparison of cellular apoptosis index after spinal cord injury in three groups

A.sham組 B.SCI組 C.SCI+bFGF組圖2 脊髓損傷后三組Caspase12陽性細胞表達比較Figure 2 Effect of bFGF on Caspase12 expression after acute spinal cord injury

3 討論

目前對于繼發性脊髓損傷的機制研究主要有鈣離子學說、自由基損傷學說、電解質失衡學說、細胞凋亡學說等,其中細胞凋亡學說被認為是繼發性脊髓損傷的一種重要機制。內質網信號通路是近年發現的介導神經細胞凋亡的新途徑,鈣超載、氧化應激及大量自由基生成等也是誘導內質網應激發生的刺激因素,當嚴重持續的內質網應激損傷內質網功能時,可能引起凋亡通路激活,內質網應激與脊髓繼發性損傷關系密切[8]

Caspase12是內質網外膜上的組成性蛋白,一種半胱天冬酶,激活前以酶原的形式存在,是介導內質網應激凋亡的關鍵因子[4]。在發生內質網應激時,經過特定位點裂解激活,Caspase12表達增加并活化,其機制可能與IRE1、Caspase7和m鈣蛋白酶三條途徑有關[9],進而激活與細胞凋亡相關的caspase級聯反應,引起細胞凋亡[10]。由于Caspase12在內質網應激細胞凋亡信號轉導中的特殊位置,Caspase12是內質網應激引起細胞凋亡的一個代表性分子和標志性蛋白,在線粒體或死亡受體凋亡途徑中不會被活化。

本研究中行為學評分采用Rivlin斜板實驗,結果顯示:sham組大鼠后肢運動功能狀況和正常大鼠相似,可以在63°傾斜角的斜板上站穩至少5 s,經打擊后的兩組大鼠后肢均癱瘓,幾乎無活動能力,說明采用本方法會造成大鼠后肢功能障礙,可以成功復制脊髓損傷動物模型。給予bFGF后,術后第7天發現SCI+bFGF組比SCI組大鼠后肢力量明顯加強,14 d更為顯著,說明bFGF可以促進脊髓損傷大鼠運動功能的恢復。

TUNEL染色結果顯示,sham組沒有檢測到明顯的凋亡細胞,而脊髓損傷后檢測到大量陽性凋亡細胞,給予bFGF干預后,凋亡細胞明顯減少,提示bFGF可以通過減輕脊髓損傷后細胞凋亡的程度,對脊髓損傷起到一定的保護作用。進一步探求bFGF減輕細胞凋亡的機制,通過免疫組化分析Caspase12在脊髓組織的表達,脊髓損傷后檢測到Caspase12陽性細胞大量表達,而bFGF可以降低Caspase12在脊髓組織的表達,說明Caspase12參與了細胞凋亡的過程,bFGF可能通過抑制Caspase12的活化,阻止細胞凋亡。表明bFGF對脊髓損傷的保護作用機制與抑制Caspase12介導的內質網應激密切相關。

綜上所述,脊髓遭受創傷后,產生較為強烈的內質網應激,引起脊髓神經細胞的各種功能障礙,最后引起神經細胞凋亡。bFGF可以對急性脊髓損傷發揮神經保護作用,可能與其抑制內質網應激相關蛋白Caspase12的表達和脊髓神經細胞的凋亡有關。這將對臨床應用bFGF治療脊髓損傷提供有力的實驗依據。

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EffectofbFGFonexpressionofendoplasmicreticulumstress-relatedproteinCaspase12afteracutespinalcordinjuryinrats

ZHAO Lin1,JIA Kunpeng2,SHEN Juan1,HAO Qin1,CHEN Yahui1,YANG Yanling1*(1

DepartmentofHumanAnatomy,MedicalCollegeofYan’anUniversity,Yan’an716000,China;2DepartmentofPediatrics,AffiliatedHospitalofYan’anUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:yangyanling8889@163.com)

ObjectiveTo explore the effect of basic fibroblast growth factor(bFGF) on the expression of Caspase12 after acute spinal cord injury in rats.MethodsNinety rats were randomly divided into sham group, acute spinal cord injury(SCI) group and bFGF group(SCI+bFGF)at 8-10 week. At 12 h, 1 d, 3 d, 7 d and 14 d after acute spinal cord injury, the movement function was evaluated in rats by Rivlin inclined plate experiment, Neural cell apoptosis was examined by TUNEL staining and the expression of Caspase12 was detected in the damaged segments of the spinal cord by immunohistochemical staining.ResultsRivlin inclined plate experiment average angle showed significantly difference between SCI group, SCI+bFGF group and sham group at each time point(P<0.01). Rivlin inclined plate experiment average angle was significantly higher in SCI+bFGF group than in SCI group at 7 d(36.30°±2.82°vs28.20°±2.78°,P<0.05)and 14 d(46.50°±2.98°vs33.30°±2.88°,P<0.01). The cell apoptosis was significantly higher in SCI group than in sham group(14.20±2.12vs2.35±0.62,P<0.01), and it was lower in SCI+bFGF group(10.32±1.68) than in SCI group(P<0.01).The expression of Caspase12 was significantly higher in SCI group than in sham group(12.20±1.02vs2.10±0.20,P<0.01), and it was lower in SCI+bFGF group(7.50±0.60)than that in SCI group(P<0.01).ConclusionThe expression of Caspase12 increases after acute spinal cord injury in rats, and bFGF can inhibit the expression of Caspase12.

bFGF; spinal cord injury; endoplasmic reticulum stress; cell apoptosis

R363

A

1007-6611(2017)09-0904-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.008

國家自然科學基金資助項目(81641048,81650022);陜西省科技廳攻關基金資助項目(2013K12-01-23)；陜西省教育廳專項科學資助項目(17JK0873)

趙琳,女,1976-07生,碩士,副教授,E-mail:jkpzhaolin@163.com

2017-05-04