活細胞內基于Diels-Alder反應的量子點標記蛋白質研究

王明秀,張加玲,劉云鳳,喬增杰

(山西醫科大學公共衛生學院衛生檢驗教研室,太原 030001)

活細胞內基于Diels-Alder反應的量子點標記蛋白質研究

王明秀,張加玲,劉云鳳,喬增杰

(山西醫科大學公共衛生學院衛生檢驗教研室,太原 030001)

目的 建立一種基于Diels-Alder環加成反應用于活細胞內量子點(quantum dots,QDs)標記蛋白質的新方法。 方法 反式環辛烯(trans-cyclooctene 2,TCO2)修飾的類轉錄激活因子效應物(transcription activator-like effectors,TALE)蛋白與偶聯四嗪(tetrazine 1,Tz1)的紅色量子點QD625在Vero活細胞內特異性結合,形成量子點熒光標記的蛋白TALE-QD625,通過激光共聚焦顯微鏡觀察TALE-QD625在Vero細胞內的熒光信號分布。 結果 基于Tz1和TCO2的Diels-Alder環加成反應在Vero活細胞內將QD625標記至TALE蛋白,并隨TALE進入細胞核內,在核內觀察到紅色的QDs熒光信號,成功建立活細胞內量子點標記蛋白方法。 結論 通過Diels-Alder環加成反應首次實現活細胞內量子點標記蛋白,為蛋白單分子成像提供一種新的標記方法。

蛋白質標記; 量子點; Diels-Alder環加成反應; 活細胞; 熒光納米材料

活細胞內單分子成像技術的發展豐富了對單個蛋白分子在其自身環境中的行為及功能的認識[1,2]。量子點(quantum dots,QDs)作為一種新型的熒光納米材料,具有獨特的光物理性質,如激發波譜寬、發射波譜窄、發光效率高、顏色可調、光穩定性好等,在單分子成像中具有突出優勢[3]。

準確有效地將QDs偶聯至待標記蛋白分子是活細胞內單分子蛋白實時可視化研究的基礎[3]。目前主要使用鏈霉親和素涂層的QDs標記生物素化蛋白,該方法是基于鏈霉親和素與生物素的親和反應實現的,具有較高的親和力與較強的特異性,且只需在蛋白中引入15個氨基酸的小肽,不干擾蛋白的結構和功能[4,5]。但是,由于鏈霉親和素表面有4個生物素結合位點、細胞內本身含有生物素以及小肽介導的QDs修飾蛋白方法較少等,限制了QDs在活細胞內蛋白單分子成像中的研究與應用[6]。

基于四嗪(tetrazine 1,Tz1)與反式環辛烯(trans-cyclooctene 2,TCO2)的Diels-Alder環加成反應可用于活細胞內熒光素標記蛋白,在待標記蛋白中引入13個氨基酸的小肽-硫辛酸連接酶受體肽(LplA acceptor peptide,LAP),不影響其生物活性[7]。同鏈霉親和素與生物素的親和反應相比,Tz1與TCO2的反應具有更為特異、高效、快速、簡便等特點[8]。本研究旨在建立基于Tz1與TCO2的Diels-Alder環加成反應用于活細胞內量子點標記蛋白技術,為活細胞內蛋白單分子成像的量子點標記技術提供一種新方法。

1 材料與方法

1.1 細胞系與質粒

非洲綠猴腎細胞(Vero)、pcDNA3.1-TALE、pEGFP-Histone由山西醫科大學衛生檢驗教研室保存,pcDNA3.1-TALE表達類轉錄激活因子效應物(transcription activator-like effectors,TALE)蛋白,該蛋白可以進入細胞核內,pEGFP-Histone表達綠色熒光蛋白EGFP標記的組蛋白(histone);pcDNA3-LplA(W37V)購自Addgene,表達硫辛酸連接酶(lipoic acid ligase,LplA);pcDNA3.1(+)購自Invitrogen,為哺乳動物表達載體。

1.2 主要試劑與儀器

Lipofectamine2000(Invitrogen,USA)、DMEM高糖培養基(Hyclone,USA)、胎牛血清FBS(Hyclone,USA)、QD625-COOH(Invitrogen,USA)、100 kDa離心式超濾管(Milipore,Germany)、玻璃底皿(Corning,USA)、KOD FX DNA聚合酶(Toyobo,Japan)、DNA Marker(TransGen Biotech,China)、限制性內切酶(Thermo Fermentas,USA)、T4 DNA連接酶(Takara,Japan)。EDC、四嗪、順式-環辛-4-烯醇、苯甲酸甲酯、乙酸乙酯、二氯甲烷、吡啶、對硝基苯基氯甲酸酯、DMF、三乙胺、5-氨基戊酸均購自美國Sigma公司。引物合成、DNA測序由武漢擎科生物技術有限公司完成。

激光共聚焦顯微鏡(UltraView VOX),美國PerkinElmer公司。核磁共振儀(AV400),德國Bruker公司。核酸電泳儀(SUB-cell GT)、凝膠成像系統(SUB-cell GT)、PCR儀(Veritee96-well),美國Bio-Rad公司。

1.3 量子點標記蛋白方法

[9]，設計基于Tz1與TCO2的環加成反應用于活細胞內量子點標記蛋白的方法以及TCO2和Tz1的結構式(見圖1)。將LAP克隆至TALE末端,構建融合蛋白TALE-LAP;在LpIA的作用下,TCO2連接至蛋白TALE(TALE-LAP-TCO2);Tz1偶聯至羧基修飾的紅色量子點QD625-COOH形成QD625-Tz1;通過TCO2和Tz1的環加成反應將TALE-LAP-TCO2與QD625-Tz1連接,即實現TALE被QD625標記(TALE-LAP-TCO2-Tz1-QD625)。

1.4 pcDNA3.1-TALE-LAP表達載體的構建

LAP的氨基酸序列為GFEIDKVWYDLDA。將LAP的核苷酸序列設計至反向引物中合成,通過PCR連接到TALE蛋白末端,經酶切位點Hind Ⅲ和BamH Ⅰ克隆至pcDNA3.1(+),雙酶切并測序驗證。正向引物:5′-GCTAAGCTTGCCACCATGGCTCCAAAGAAGAAGCGTAAG-3′,反向引物:5′-GTAGGATCCTTAGGCGTCCAGGTCGTACCACACCT-TGTCGATCTCGAAGCCGGCAACGCGATGGGATGTGCGTTCGGGAAT-3′,下劃線分別表示Hind Ⅲ和BamH Ⅰ的酶切位點,黑體為kozak序列,斜體為LAP的核苷酸序列。

1.5 TCO2合成

參照文獻[7]的方法合成,將0.25 g順式-環辛-4-烯醇與0.275 g苯甲酸甲酯溶于25 ml乙醚和正己烷(9 ∶1)的混合液中,紫外(254 nm)照射4 h,產物經硅膠銀柱(AgNO3∶SiO2=1 ∶9)洗脫(乙酸乙酯 ∶石油醚=1 ∶10),生成中間產物反式-環辛-4-烯醇。取50 mg反式-環辛-4-烯醇,溶于10 ml二氯甲烷,再加入0.2 g吡啶和100 mg對硝基苯基氯甲酸酯,混勻、攪拌過夜;產物減壓濃縮除去揮發性物質,加入10 ml DMF和0.4 ml的三乙胺混合液以及120 mg 5-氨基戊酸,室溫攪拌20 h;產物用40 ml水稀釋,分別用20 ml乙酸乙酯抽提2次、10%醋酸調節pH至4-5、50 ml二氯甲烷萃取3次,最后用Na2SO4干燥、過濾、蒸發至粉末狀產物;產物經硅膠銀柱洗脫并送核磁鑒定。

取5 mg反應產物溶解至CDCl3,經1H核磁共振(NMR)鑒定TCO2是否成功合成。

1.6 Tz1偶聯QD625-COOH(QD625-Tz1)

將8 μmol/L QD625-COOH加入到配有攪拌器的小型反應容器中,攪拌至混勻,加入5 mg/ml Tz1,攪拌5 min,降低攪拌速度,加入10 mg/ml EDC催化,室溫反應4 h;離心去除團聚物(12 000 r/min,3 min),再經0.22 μm針頭式濾器過濾;用100 kDa離心式超濾管將樣品濃縮純化5次,濃縮比為10;終產物溶于1 ml PBS溶液,合成終濃度為1 μmol/L的QD625-Tz1。分別取2 μl QD625-COOH與QD625-Tz1經1%的瓊脂糖凝膠電泳驗證偶聯是否成功[10]。

1.7 活細胞內QDs標記蛋白質

QD625-Tz1標記TCO2修飾的蛋白TALE在Vero活細胞內進行,Vero細胞采用含10%滅活FBS的DMEM培養液,在37 ℃及5 % CO2飽和濕度的條件下培養。取生長良好的細胞,以5×104個細胞濃度接種到25 cm2玻璃底培養皿,分為實驗組和對照組。實驗組培養至細胞密度為80%左右,以Lipofectamine 2000為載體將1μg pcDNA3.1-TALE-LAP、1 μg pcDNA3.1-LpIA和1 μg pEGFP-Histone共轉染至Vero細胞,培養4-6 h,加入1 μmol/L QD625-Tz1和200 μmol/L TCO2各2 μl,繼續培養20 h。對照組只需轉染1 μg pEGFP-Histone,其他操作同實驗組。培養結束后,將培養皿置于激光共聚焦顯微鏡下觀察QDs熒光信號在Vero細胞內的分布情況,并對實驗組Vero細胞Z軸層掃成像,進一步觀察QDs熒光信號在不同掃描層面成像的變化。

2 結果

2.1 融合肽TALE-LAP雙酶切、測序鑒定

重組質粒pcDNA3.1-TALE-LAP經Hind Ⅲ和BamH Ⅰ雙酶切成5 230 bp和2 430 bp兩條特異性條帶(見圖2),與TALE-LAP的大小相符。測序結果與TALE-LAP的閱讀框序列一致。

圖2 pcDNA3.1-TALE-LAP雙酶切驗證分析Figure 2 Identification of pcDNA3.1-TALE-LAP by double restriction analysis

2.2 TCO2與QD625-Tz1的合成鑒定

經鑒定,TCO2的1HNMR(400 MHz,CDCl3)波譜見圖3A,成功合成TCO2。

QD625-Tz1及QD625-COOH瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖3B,QD625-COOH帶負電荷,由陰極側向陽極側移動,而經Tz1修飾后形成的QD625-Tz1表面負電荷大部分被中和,所以QD625-Tz1在瓊脂糖凝膠電泳中的移動受阻,大部分滯留在膠孔處。這一結果說明Tz1成功偶聯QD625。

圖3 TCO2的1H核磁共振波譜與QD625-Tz1的瓊脂糖凝膠電泳結果Figure 3 1H nuclear magnetic resonance spectrum of TCO2 and agarose gel electrophoresis of QD625-Tz1

2.3 活細胞內QD625標記TALE

Vero活細胞內QD625標記TALE的激光共聚焦顯微成像結果見圖4。實驗組細胞核內可見紅色的QDs熒光信號(圖4A);對照組細胞核內未見紅色的QDs信號(圖4B)。

白色曲線包圍部分為Vero細胞的細胞核,被Histone-GFP標記為綠色,白色箭頭指示QDs的熒光信號圖4 Vero活細胞內QD625標記蛋白TALE共聚焦成像(scale bar=2 μm)Figure 4 Confocal imaging of TALE labeled with QD625 in live Vero cells(scale bar=2 μm)

為進一步證實實驗組紅色的QDs熒光信號在Vero細胞核內,激光共聚焦顯微鏡對Vero細胞Z軸層掃成像,從41張掃描圖片中選取9張(見圖5)。白色箭頭指示為QD625-Tz1的熒光信號在細胞核內的分布情況,Z軸方向QDs熒光信號從無到有,最后又消失,證實了QDs信號在Vero細胞核內,表明TALE成功將QD625帶入Vero細胞核內,說明Vero活細胞內QD625成功標記蛋白TALE。

掃描厚度:0.2μm;標尺:2 μm圖5 TALE-QD625熒光信號在Vero細胞Z軸層掃成像過程中的變化Figure 5 Changes of TALE-QD625 signal in Vero cells along the Z-axis

3 討論

活細胞內單個蛋白分子實時可視化研究對于理解生命的分子基礎有著重要的意義,而發展活細胞內蛋白分子的標記方法將有助于可視化研究的實現。QDs作為一種新型的熒光納米材料,因其獨特的光物理特性,目前已成為活細胞單個蛋白分子成像的強有力工具[11]。

本研究利用Tz1與TCO2的Diels-Alder環加成反應在Vero活細胞內實現蛋白TALE被QDs標記,首次建立了一種新的活細胞內QDs標記蛋白技術,將有望用于活細胞內以及細胞核內相關蛋白的分子影像學研究,促進對細胞質內或細胞核內特定蛋白的行為及功能的深入認識,如通過QDs標記細胞核內轉錄因子蛋白,有可能實時觀察到該蛋白在轉錄過程中所發揮的作用。此外,由于不同粒徑大小的QDs具有不同的發射光譜,在激光共聚焦顯微鏡照射下顯示出不同的顏色,結合其他標記方法,可在活細胞水平實現對不同蛋白的多色成像,動態研究不同蛋白之間的相互作用關系。

與傳統的鏈霉親和素生物素親和反應相比,Tz1與TCO2之間的反應具有更多優點,如結合特異性更強、標記效率更高、反應速度更快、原料簡單易得等。本研究不僅豐富了活細胞內QDs標記蛋白的方法,而且為活細胞內單個蛋白分子實時可視化研究提供強有力的技術支撐。

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ProteinlabelingwithquantumdotsinlivecellsbasedonDiels-Alderreactions

WANG Mingxiu,ZHANG Jialing,LIU Yunfeng,QIAO Zengjie

(DepartmentofSanitaryInspection,SchoolofPublicHealth,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)

ObjectiveTo establish a new method of labeling a protein with quantum dots(QDs) within live cells via the Diels-Alder cycloaddition.MethodsTranscription activator-like effectors(TALE) decorated with trans-cyclooctene TCO2 and tetrazine 1(Tz1)-conjugated QD625 were combined specially in the live Vero cells to yield a QD625-labelled TALE(TALE-QD625). The distribution of fluorescent signal for TALE-QD625 in Vero cells were observed through confocal microscopy.ResultsThe QD625 was conjugated with TALE based on the Tz1 and TCO2 Diels-Alder cycloaddition labeling system and subsequently entered the cell nucleus. Red fluorescent signal of TALE-QD625 was observed in the nucleus of Vero cells.ConclusionIt is the first time that QDs have been used to specially label a protein via the Diels-Alder cycloaddition within live cells, which will provide a new labeling method for single protein molecule imaging.

protein labeling; QDs; Diels-Alder cycloaddition; live cell; fluorescent nanomaterial

R113

A

1007-6611(2017)09-0895-05

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.006

病毒學國家重點實驗室開放研究基金資助項目(2017IOV005);山西醫科大學青年基金資助項目(02201512)

王明秀,女,1989-08生,碩士,助教,E-mail:wangmingxiu0818@163.com

2017-05-19