脂聯素基因多態性與冠心病的相關性

閻嬌娟,張春艷,王聰霞*

(1銅川市人民醫院心血管內科,銅川 727000;2西安交通大學第二附屬醫院心血管內科;*通訊作者,E-mail:wcx622@163.com)

脂聯素基因多態性與冠心病的相關性

閻嬌娟1,張春艷2,王聰霞2*

(1銅川市人民醫院心血管內科,銅川 727000;2西安交通大學第二附屬醫院心血管內科;*通訊作者,E-mail:wcx622@163.com)

目的 探討中國陜西地區漢族人群脂聯素基因rs266729和rs1501299兩個位點的多態性是否是冠心病的遺傳易感因素。 方法 應用聚基質輔助激光解吸附電離飛行時間質譜方法(matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight,MALDI-TOF),檢測105例冠心病患者和75例非冠心病患者的脂聯素基因2個位點rs266729、rs1501299的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP),判定其基因型并統計各基因型及等位基因的頻率。 結果 rs1501299的基因型以及等位基因頻率在冠心病組和對照組間差異有統計學意義(均P<0.05);rs266729的基因型以及等位基因頻率在冠心病組和對照組間差異無統計學意義(均P>0.05);應用Logistic回歸分析調整了其他相關因素后顯示,rs1501299位點攜帶G等位基因為冠心病發病的獨立危險因素(OR=1.731,95% CI 1.091-2.747,P<0.05)。 結論 rs1501299位點可能與冠心病發病相關,G等位基因可能是冠心病的遺傳易感基因。

冠心病; 脂聯素; 單核苷酸多態性

脂聯素(adiponectin,APN)是一種脂肪細胞分泌的特異性細胞因子,研究表明脂聯素與胰島素抵抗、2型糖尿病、肥胖、動脈粥樣硬化等密切相關[1],已成為目前研究的熱點,但其多位點的基因多態性與冠心病的相關性目前國內外研究結論不一[2]。本研究選擇了rs266729、rs1501299兩個SNP位點為主要研究指標,擬從基因水平探討脂聯素與冠心病發病的關系,從而確定基因型與臨床表型的關系,尋找冠心病的易感基因,為冠心病的診斷和治療提供理論和實驗依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2015-12～2016-12因胸痛于我院心內科住院的患者,病例組選取冠心病患者105例,經冠狀動脈造影證實主要冠狀動脈血管(左前降支、左回旋支、右冠狀動脈)至少有1支狹窄≥50%。選擇同期住院的經冠狀動脈造影排除冠心病的患者75例為對照組。所有受試者均排除嚴重肝、腎疾病及急、慢性感染性疾病、甲狀腺功能亢進或減退、全身大動脈疾病、結締組織病、良惡性腫瘤。

1.2 研究方法

1.2.2 PCR聯合MALDI-TOF法檢測rs266729、rs1501299位點SNPs ①引物設計:采用Sequenom公司Genotyping Tools及MassARRAY Assay Design軟件設計rs266729、rs1501299位點的PCR擴增引物及單堿基延伸引物,引物序列由上海生工生物公司合成。引物信息見表1。②PCR擴增:采用多重PCR擴增技術,每個反應總體積5 μl,包含模板DNA10 ng,擴增引物每條0.5 pmol,Hotstar Taq 0.5 U,25 mmol/L dNTP 0.1 μl,反應條件為94 ℃ 4 min;94 ℃ 20 s, 56 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,45個循環;72 ℃ 3 min。③PCR產物純化:PCR反應產物使用蝦堿性磷酸酶(shrimp alkaline phosphatase,SAP)0.5 U處理,去除游離的dNTP,確保進行延伸反應時只延伸一個堿基。配制SAP反應液,然后將其加入PCR擴增后的孔板中,降解dNTP,反應程序為37 ℃ 20 min;85 ℃ 5 min。④單堿基延伸反應:配制iPLEX反應體系,并在SAP處理后的每個孔板中加入iPLEX反應體系,體系內進行單堿基延伸反應。反應程序為94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s;52 ℃ 5 s,80 ℃ 5 s 5個循環;返回94 ℃ 5 s共40個循環;72 ℃ 3 min。⑤樹脂純化:用6 mg Clean Resin樹脂對每個延伸反應產物進行純化。⑥點樣和質譜檢測:在384孔SpectroCHIP芯片上將純化產物置入后,進行上機測定。SpectroCHIP芯片使用MALDI-TOF分析,最后結果使用TYPER 4.0軟件分型得出結果。

表1rs266729、rs1501299位點目的片段擴增引物

Table1TheamplificationprimersofSNPsrs266729,rs1501299

位 點 正向引物 反向引物 延伸引物 rs266729ACGTTGGATGATGTGTGGCTTGCAAGAACCACGTTGGATGCTTTCTTGGCACGCTCATGTGCTCATGTTTTGTTTTTGAAG rs1501299ACGTTGGATGCTCTTTCATCACAGACCTCCACGTTGGATGGCTTTGCTTTCTCCCTGTGTAGGCCTTAGTTAATAATGAATG

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 一般臨床資料的比較

兩組患者在年齡、性別、BMI、糖尿病史、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白、肌酐方面比較差異無統計學意義(均P>0.05),在吸煙史、高血壓病史、心血管疾病家族史方面,兩組間比較存在統計學差異(均P<0.05,見表2)。

2.2 rs266729、rs1501299位點PCR擴增產物質譜分析

rs266729存在G和C兩種等位基因,存在GG、CG以及CC三種基因型,rs1501299存在G和T兩種等位基因,存在GG、GT以及TT三種基因型(見圖1,2)。

表2兩組患者一般臨床資料的比較

Table2Clinicalcharacteristicsofthepatientsinthetwogroups

指標 冠心病組(n=105)對照組(n=75)t/χ2P年齡(歲)6471±7986591±118604180411BMI(kg/m2)2524±2772541±31305270653男/女(例)64/4141/3413190251吸煙史[例(%)]48(4571)22(2933)41100032心血管病家族史[例(%)]11(1048)2(267)39230046糖尿病[例(%)]40(3809)21(2800)25710141高血壓病[例(%)]65(6190)33(4400)40850039總膽固醇(mmol/L)427±082438±09304260494低密度脂蛋白(mmol/L)266±085270±09303150765高密度脂蛋白(mmol/L)189±025111±02303100796甘油三酯(mmol/L)165±080166±08102360810肌酐(μmol/L)8173±12767703±143916680053

2.3 單個位點基因型及等位基因的分布

經Hardy-Weinberg平衡檢驗后,在兩組中的基因型頻率的分布,rs266729、rs1501299位點均符合Hardy-Weinberg平衡狀態(P>0.05),說明本研究對象具有群體代表性。兩組間比較,rs266729位點基因型及等位基因分布差異無統計學意義(P>0.05,見表3);rs1501299位點的基因型及等位基因分布差異有統計學意義(P<0.05,見表4)。rs1501299位點GG基因型及G等位基因在冠心病組的頻率明顯高于對照組,差異具有統計學意義(P<0.05,見表4)。

A.GG基因型B.CG基因型C.CC基因型圖1 rs266729基因不同基因型的質譜結果Figure 1 The mass spectrum of SNP rs266729

A.GG基因型B.GT基因型C.TT基因型圖2 rs1501299基因不同基因型的質譜結果Figrure 2 The mass spectrum of SNP rs1501299

表3兩組間rs266729基因型及等位基因的分布例(%)

Table3Thefrequenciesofgenotypesandallelesofrs266729andrs1501299inthetwogroupscases(%)

組別基因型頻率等位基因頻率GGCGCCχ2PGCχ2P冠心病組6(57)47(448)52(495)4105012859(281)151(719)17720203對照組 11(147)30(400)34(453)52(347)98(653)

表4兩組間rs1501299基因型及等位基因的分布例(%)

Table4Thefrequenciesofgenotypesandallelesofrs1501299inthetwogroupscases(%)

組別基因型頻率等位基因頻率GGGTTTχ2PGTχ2P冠心病組46(438)25(238)34(324)74930024117(557)93(443)86450004對照組 18(240)24(320)33(440)60(400)90(600)

2.4 多因素回歸分析

為了進一步確定rs1501299 G等位基因與冠心病的這種關聯性是否是因為其他危險因素所致,是否攜帶G等位基因是冠心病發生的獨立危險因素,我們進行了Logistic多因素逐步回歸分析,將因變量設為是否存在冠心病,將上述結果中存在明顯差異的指標和各位點突變型等位基因作為自變量一起放入Logistic回歸中進行分析,結果顯示,經上述因素調整后,rs1501299位點G等位基因的OR值為1.731(95% CI 1.091-2.747,P<0.05，見表5),表明攜帶G等位基因是冠心病發生的一項獨立危險因素。

表5rs1501299G等位基因與冠心病的Logistic回歸分析

Table5TheLogisticregressionanalysisofGalleleofSNPrs1501299andcoronaryheartdisease

自變量BSEWalddfSig．exp(B)95%CIforexp(B)LowerUpper 吸煙08020232791610011223119874076 高血壓病07710419513010027216315113644 心血管家族史04240891432910037152811953123 rs150129905490236542410020173110912747 常量-130906094620100320270

3 討論

近年來,冠心病發病率逐年升高,血脂異常、糖代謝異常、高血壓及高尿酸血癥等是目前已知的冠心病危險因素。大量研究[3-5]表明,脂聯素水平與血脂異常、動脈粥樣硬化等具有明顯相關性,脂聯素因具有明顯調節血脂、逆向發展冠狀動脈粥樣硬化進程及抗炎等效應而被視為冠心病的保護性因素。

脂聯素基因位于染色體3q27區,是冠心病的易感基因所在區域。脂聯素基因多態性影響脂聯素結構、功能、分泌。目前研究發現脂聯素基因不同位點的多態性與心血管疾病的發生存在明顯差異[6]。有研究表明,rs1501299 T等位基因攜帶者心肌梗死風險明顯增高[7]。國內一項研究納入了438例冠狀動脈造影診斷的冠心病患者,并設對照組,測定兩組人群rs1501299位點基因多態性以及部分患者血清脂聯素水平,結果顯示rs1501299 G>T 突變使冠心病發病風險增加,但對脂聯素水平無明顯影響[8]。Oliveira等[9]研究了脂聯素SNP基因多態性、血清脂聯素水平與具有高危心血管風險因素患者糖尿病及冠心病發病率的關系,結果顯示,rs1501299 G等位基因與冠心病風險增高有關。關于rs266729的研究結果也不一致,有研究提示rs266729 G等位基因增加心血管病風險[10],薈萃分析顯示rs266729與心血管疾病之間的相關性僅在亞洲人群中是顯著的[11]。本研究結果顯示,rs1501299位點的基因型及等位基因分布差異有統計學意義(P<0.05),rs1501299位點GG基因型及G等位基因在冠心病組的頻率明顯高于對照組,差異具有統計學意義(P<0.05),Logistic回歸分析顯示,rs1501299位點G等位基因的OR值為1.731(95% CI 1.091-2.747,P<0.05),表明攜帶G等位基因是冠心病發生的一項獨立危險因素。rs266729則與冠心病無明顯相關性,可能與人群種族差異及本研究樣本量較小有關。

綜上所述,脂聯素作為一個脂肪細胞分泌的細胞因子,是連接代謝紊亂與心血管疾病的重要環節,早期監測脂聯素基因多態性,并以其作為治療靶點,可能成為冠心病患者一級預防與二級預防的重要措施。

[1] Villarreal-Molina MT, Antuna-Puente B. Adiponectin: anti-inflammatory and cardioprotective effects[J]. Biochimie, 2012, 94 (10):2143-2149.

[2] Zhang H, Mo X, Hao Y,etal. Association befween polymorphisms in the adiponectin gene and cardiovascular disease: a meta-analysis[J]. BMC Med Genec,2012, 13: 40.

[3] 王聰霞,張巖.易損性動脈粥樣硬化斑塊評價指標的研究進展[J].西安交通大學學報,2016,37(3):307-312.

[4] Foucan L, Maimaitiming S, Larifla L,etal. Adiponectin gene variants, adiponectin isoforms and cardiometabolic risk in type 2 diabetic patients[J]. J Diabetes Investig, 2014, 5 (2): 192-198.

[5] Suriyaprom K, Phonrat B, Tungtrongchitr R. Association of adiponectin gene-11377C> G polymorphism with adiponectin levels and the metabolic syndrome in Thais[J]. Asia Pac J Clin Nutr, 2014, 23 (1): 167-173.

[6] Francke S, Manraj M, Lacquemant C,etal. A genome-wide scan for coronary heart disease suggests in Indo-Mauritians a susceptibility locus on chromosome 16p13 and replicates linkage with the metabolic syndrome on 3q27[J]. Hum Mol Genet, 2001, 10(24): 2751-2765.

[7] Antonopoulos AS, Tousoulis D, Antoniades C,etal. Genetic variability on adiponectin gene affects myocardial infarction risk: the role of endothelial dysfunction[J]. Int J Cardiol, 2013, 168(1): 326-330.

[8] Gui MH, Li X, Jiang SF,etal. Association of the adiponectin gene rs1501299 G>T variant, serum adiponectin levels, and the risk of coronary artery disease in a Chinese population[J]. Diabetes Res Clin Pract, 2012, 97(3): 499-504.

[9] Oliveira CS, Saddi-Rosa P, Crispim F,etal. Association of ADIPOQ variants, total and high molecular weight adiponectin levels with coronary artery disease in diabetic and non-diabetic Brazilian subjects[J]. J Diabetes Complications, 2012, 26(2): 94-98.

[10] Yang Y, Zhang F, Ding R,etal. Association of ADIPOQ gene polymorphisms and coronary artery disease risk: a meta-analysis based on 12 465 subjects[J]. Thromb Res,2012,130(1):58-64.

[11] Zhang H, Mo X, Hao Y,etal. Association between polymorphisms in the adiponectin gene and cardiovascular disease: a meta-analysis[J]. BMC Med Genet,2012,13:40.

Associationbetweenadiponectingenepolymorphismwithcoronaryarterydisease

YAN Jiaojuan1,ZHANG Chunyan2,WANG Congxia2*(1DepartmentofCardiology,People’sHospitalofTongchuan,Tongchuan727000,China;2

DepartmentofCardiology,SecondAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity;*Correspondingauthor,E-mail:wcx622@163.com)

ObjectiveTo investigate the relationship between adiponectin rs266729 and rs1501299 gene polymorphism and the risk of coronary heart disease(CHD).MethodsThe adiponectin rs266729 and rs1501299 single nucleotide polymorphism(SNP) were geno-typed in CHD patients(n=105) and non-CHD patients(n=75) using matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight(MALDI-TOF). The genotype and the frequency of each genotype and allele were determined.ResultsThere was statistical difference in rs1501299 genotypes and allele gene between CHD group and control group(bothP<0.05). The frequency distribution of each genotype and allele gene of rs266729 showed no statistical difference between CHD group and control group(bothP>0.05).Logistic regression analysis revealed that adiponectin rs1501299 locus with G allele was independently associated with CHD(OR=1.731,95% CI 1.091-2.747,P<0.05).ConclusionThe rs1501299 site may be associated with the incidence of CHD, and the G allele may be the genetic susceptibility gene for CHD.

coronary heart disease; adiponectin; single nucleotide polymorphism

R541.4

A

1007-6611(2017)09-0879-04

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.09.002

國家自然科學基金資助項目(81273878)

閻嬌娟,女,1986-12生,碩士,主治醫師,E-mail:yanjiaojuan-12@126.com

2017-05-31