上調microRNA- 214表達對肺癌細胞凋亡及耐藥性的影響

常芬，肖貴華，李琪

(武漢市普仁醫院 呼吸內科，湖北 武漢 430081)

·論著·

上調microRNA-214表達對肺癌細胞凋亡及耐藥性的影響

常芬，肖貴華，李琪

(武漢市普仁醫院 呼吸內科，湖北 武漢 430081)

目的探究microRNA- 214過表達是否可以通過調節凋亡過程影響肺癌細胞的多藥耐藥性。方法選擇2種不同的人小細胞肺癌細胞株和人非小細胞肺癌細胞株作為實驗組，分別是H69細胞實驗組和H446細胞實驗組；A549細胞實驗組和H1299細胞組；選擇正常人肺上皮細胞(BEAs- 2B)作為對照組。Real- time PCR法進行檢測肺癌細胞株內miR- 214的表達量。上調miR- 214表達后給予不同的抗腫瘤藥物刺激，并MTT比色法檢測肺癌細胞株對藥物的敏感性；CCK- 8法檢測細胞存活率和TUNEL法流式細胞儀檢測細胞凋亡；Western blot法檢測肺癌細胞株中Bcl- 2和p53的蛋白表達水平。結果Real- time PCR法檢測結果發現，實驗組細胞中miR- 214表達量明顯低于對照組BEAs- 2B，差異有統計學意義(P<0.05)；CCK- 8結果顯示，上調miR- 214表達后肺癌細胞的存活率顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；MTT法結果顯示，上調miR- 214表達后肺癌細胞對抗腫瘤藥物的敏感性顯著降低(P<0.05)；Western blot結果表明，上調miR- 214基因表達后肺癌細胞Bcl- 2和p53蛋白的異常表達，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)；結論上調miR- 214表達能夠顯著降低肺癌細胞的存活率并加速凋亡的發生；同時miR- 214過表達可以調控凋亡蛋白并降低肺癌細胞對藥物的敏感性。

小分子核糖核酸- 214； 肺癌； 凋亡； 多藥耐藥性

肺癌是對人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一[1]。肺癌一般可分為兩大類：小細胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)和非小細胞肺癌(non- small cell lung cancer,NSCLC)[2]。肺癌具有高侵襲性、高復發性及生長迅速的生物學特點，預后極差[2]，如何提高肺癌的治療效果已成為當今的重要課題。近年來microRNAs已經成為腫瘤生物治療領域的一個新亮點[3]，研究表明，miR- 214可參與多種途徑調節腫瘤的發生和發展過程，miR- 214可以調控細胞的凋亡通路，影響腫瘤細胞增殖，同時調控miR- 214也可以作為腫瘤抑制劑對細胞的對藥耐藥性產生影響[4]。多藥耐藥性的產生是由多種基因共同調控的復雜過程，其中細胞凋亡相關蛋白Bcl- 2、p53在此過程中起重要作用[5]。但miR- 214是否可以通過調節凋亡過程影響肺癌細胞的多藥耐藥性仍在探索階段。在本研究中，我們通過上調幾種肺癌細胞中miR- 214的表達，觀察miR- 214對肺癌細胞增殖和凋亡的影響，闡明miR- 214在肺癌發生發展中的作用及miR- 214對凋亡蛋白的調節作用治療腫瘤細胞的多藥耐藥性的機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

BEAs- 2B細胞、H69細胞、H446細胞、A549細胞和H1299細胞，購自美國培養物保藏中心(ATCC，Manassas，VA)，為本實驗室保存。

1.2 藥品與試劑

阿霉素(ADM)、長春新堿(VCR)、吉西他濱(GEM)、依托泊苷(VP- 16)和順鉑(DDP)，均購于美國Sigma公司；miR- 214質粒及RealTime- PCR配套引物，均購自廣州RiboBio公司；一抗Bcl- 2、p53單克隆抗體，購于美國Abcam公司；二抗，購自北京中杉金橋公司；CCK- 8試劑盒，購自日本同仁化學研究所；Real- Time PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司；熒光素酶報告實驗試劑盒，購自美國Promega公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養 選擇正常人肺上皮細胞(BEAs- 2B)，作為對照組；分別選擇2種不同的人小細胞肺癌細胞株和人非小細胞肺癌細胞株作為實驗組，分別是H69細胞實驗組和H446細胞實驗組；A549細胞實驗組和H1299細胞組。細胞在含10%胎牛血清的RPMI培養液中培養，37 ℃、5% CO2條件下培養。

1.3.2 Real- time PCR法檢測不同肺癌內miR- 214的表達水平 Trizol法提取細胞內總RNA。用含有gDNA Eraser的PrimeScriptRT試劑盒逆轉錄合成cDNA，用SYBR Premix Ex TaqII試劑盒進行實時熒光定量Real- time PCR分析。每個實驗至少重復3次。分析：通過計算循環閾值CT值來確定基因的表達量。公式:ΔΔCT=(CT.實驗組的基因- CT.實驗組管家基因)- (CT.對照組目的基因- CT.對照組管家基因)。目的mRNA的量=2-ΔΔCT。其引物序列為：

miR- 214 Forward 5′- GGACAGCAGGCGCAGACA- 3′，

Reverse:5′- CAGTGCAGGGTCCGAGGT- 3′，

β- actin Reverse:5′- TGTTGGCATAGAGGTCTTTACGG- 3′，

Reverse: 5′- TGGGTATGGAATCCTGTGGCA- 3′

1.3.3 細胞miR- 214 mimics質粒轉染 將細胞接種到六孔板中，當細胞融合達40%左右時進行轉染。將10 μl的LipofectaminTM2000和250 μl Opti- MEM混合，同時將5 μl的miR- 214 mimics與250 μl Opti- MEM混合孵育，靜置5 min后將兩者混合。細胞用PBS清洗一次并加入1.5 ml的Opti- MEM培養基。將轉染混合物靜置20 min后加滴加到六孔板中，置于上述條件培養。6 h后換含10%胎牛血清的RPMI培養液中繼續培養，確保各組細胞轉染效率高于80%，48 h后收集細胞。miR- 214 mimics質粒序列為：

miR- 214 mimics Forward:5′- ACAGCAGGCACAGACAGGCAGU- 3′，

Reverse:5′- UGCCUGUCUGUGCCUGCUGUUU- 3′，

mimics control Forward:5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3′，

Reverse:5′- ACGUGACACGUUCGGAGAATT- 3′，

1.3.4 CCK- 8法檢測細胞存活率 將miR- 214 mimics質粒轉染進入細胞后制備成細胞懸液，接種到96孔板中(100 μl/孔)，37 ℃、5% CO2條件下過夜培養。更換培養基后加入10 μl CCK8，37 ℃、5% CO2條件下培養2 h，使用酶標儀在450 nm波長處測定OD值，計算細胞存活率。

1.3.5 TUNEL流式細胞術檢測細胞凋亡率 將miR- 214 mimics質粒轉染進入細胞后制備成細胞懸液，調整細胞濃度為1×106接種于6孔板中培養，收集不同肺癌細胞用PBS洗滌2次，按試劑盒說明書說明分別加入FITc標記的AnnexinV和PI，用流式細胞儀激發波長488 nm，收集波長630 nm檢測各組細胞的熒光強度，檢測各組細胞的凋亡百分比。

1.3.6 MTT比色法檢測細胞對藥物的敏感性 用MTT法檢測不同肺癌細胞對藥物的敏感性。阿霉素(ADM)、長春新堿(VCR)、依托泊苷(VP- 16)和順鉑(DDP)分別處理細胞48 h。PBS清洗細胞一次并加入MTT試劑37 ℃、5% CO2條件下繼續培養4 h。棄去培養基并加入DMSO，用酶標儀在540 nm波長處測定OD值，測定細胞對不同藥物的敏感程度(即細胞IC50)，每個實驗至少重復3次。

1.3.7 免疫印跡法檢測細胞中凋亡蛋白表達水平 收集對數生長期細胞，加入裂解液冰上裂解2 h。用BCA試劑盒進行蛋白濃度檢測，將各組蛋白濃度總量調整為30 μg·μl-1。將各組蛋白樣品加入到10% SDS聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，轉膜至PVDF膜后按1∶1000 的稀釋比例加入一抗和二抗。用ECL顯色劑顯色，并對各泳道條帶進行灰度掃描，計算蛋白的表達量。

1.4 統計學處理

2 結 果

2.1 肺癌細胞內miR- 214的表達量

Real- time PCR法檢測發現，miR- 214在小細胞肺癌細胞株H69細胞、H446細胞及在非小細胞肺癌細胞株A549細胞和H1299細胞的表達量明顯低于對照組BEAs- 2B細胞，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1。

2.2 肺癌細胞miR- 214過表達檢測細胞的存活率

CCK- 8法檢測細胞存活率顯示，與對照組的細胞

注：**與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)

圖1不同肺癌細胞株中miR-214的表達量

Fig1ExpressionofmiR-214indifferentlungcancercells

存活率相比，上調miR- 214表達后小細胞肺癌細胞株和非小細胞肺癌細胞株細胞存活率明顯降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖2。

注：**與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)

圖2miR-214過表達降低肺癌細胞的細胞存活率

Fig2miR-214overexpressiondecreasescellviabilityoflungcancercells

2.3 肺癌細胞miR- 214過表達檢測細胞的凋亡率

細胞凋亡率結果顯示，與對照組相比，上調miR- 214表達后小細胞肺癌細胞株和非小細胞肺癌細胞株細胞凋亡率明顯上升，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖3。

注：**與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)

圖3miR-214過表達上調肺癌細胞的細胞凋亡率

Fig3miR-214overexpressionincreasescellapoptosisoflungcancercells

2.4 肺癌細胞miR- 214過表達后對藥物的敏感性降低

MTT比色法檢測上調miR- 214表達后肺癌細胞對藥物的敏感性。結果顯示miR- 214過表達后，與對照組相比，小細胞肺癌細胞株H69細胞、H446細胞及在非小細胞肺癌細胞株A549細胞和H1299細胞對阿霉素(ADM)、長春新堿(VCR)、吉西他濱(GEM)、依托泊苷(VP- 16)和順鉑(DDP)藥物的敏感性降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

表1miR-214過表達會降低肺癌細胞對藥物的敏感性

Tab1miR-214overexpressiondecreasesthedrugsensitivityinlungcancercells

DrugBEAs-2BH69H446A549H1299ADM0.598±0.1430.416±0.091**0.364±0.078**0.477±0.053*0.367±0.041**VCP1.753±0.1310.552±0.164**0.715±0.123**0.614±0.078**1.039±0.114*VP-162.512±0.2232.024±0.158*1.674±0.188**1.949±0.207*1.319±0.169**DDP1.154±0.2310.727±0.128*0.548±0.092**0.642±0.073**0.815±0.147*GEM0.831±0.1520.614±0.113*0.523±0.078**0.601±0.058**0.742±0.122*

注：*與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)；**與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.01)

2.5 肺癌細胞miR- 214過表達后細胞中凋亡蛋白表達水平

Western blot技術檢測上調miR- 214表達后肺癌細胞中Bcl- 2、p53蛋白表達情況。結果表明miR- 214過表達后，小細胞肺癌細胞株H69細胞、H446細胞及在非小細胞肺癌細胞株A549細胞和H1299細胞中的Bcl- 2表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；miR- 214過表達后，小細胞肺癌細胞株H69細胞、H446細胞及在非小細胞肺癌細胞株A549細胞和H1299細胞中的p53表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。

注：*與對照組control相比，差異有統計學意義(P<0.05)；**與對照組control相比，差異有統計學意義(P<0.01)

圖4miR-214過表達會降低肺癌細胞中CPD的表達

Fig4miR-214overexpressiondecreasestheexpressionofBcl-2andincreasedtheexpressionofp53inlungcancercells

3 討 論

肺癌是對人類健康和生命危害最大的惡性腫瘤之一[1]。目前對于肺癌的治療方法為三種：手術切除、化學藥物治療(化療)和放射性治療(放療)，主要治療手段主要為藥物治療[2,6]。由于其極易發生腫瘤多藥耐藥性(multidrug resistance，MDR)，且肺癌具有高侵襲性、高復發性及生長迅速的生物學特點，容易導致化療失敗，臨床預后極差[2,7]。因此如何提高肺癌的治療效果及降低化療藥物的耐藥性是函待解決的重要問題。miR- 214已被發現可在多種腫瘤細胞種異常表達并調節細胞凋亡過程，包括胰腺癌、乳腺癌、胃癌和卵巢癌等[8- 11]。miR- 214作為腫瘤抑制因子其表達與惡性癌癥呈負相關性[12]，可對細胞的多藥耐藥性產生影響[6,13]。研究表明，miR- 214位于1號染色體的長臂上，它能調節抑癌基因 PTEN 并能調控腫瘤細胞的增殖和凋亡。PTEN的抑制可以激活 PI3K/AKT通路，從而增加使用藥物化療的腫瘤細胞的生存，而下調miR- 214 的表達可以減少腫瘤細胞的生存和誘導凋亡，但miR- 214是否可以通過調節凋亡過程影響肺癌細胞的多藥耐藥性仍在探索階段[6,13]。

本實驗中，我們對肺癌細胞進行miR- 214的過表達轉染實驗，我們通過上調BEAs- 2B細胞、H69細胞、H446細胞、A549細胞和H1299細胞中miR- 214的含量發現，過表達miR- 214可以顯著降低肺癌細胞的細胞存活率，并促進H69細胞、H446細胞、A549細胞和H1299細胞的細胞凋亡發生。miR- 214基因過表達對肺癌增殖起到明顯的抑制作用，并可以顯著加速細胞凋亡的發生，說明miR- 214在肺癌細胞的存活和凋亡的調控過程中起到重要的作用，其表達水平的高低與小細胞肺癌和非小細胞肺癌的增殖狀態密切相關，細胞內miR- 214的異常表達可以作為臨床上診斷和判斷肺癌發生的指標之一。同時，MTT比色法結果可知，miR- 214過表達可對細胞的多藥耐藥性能力起到明顯的抑制作用，說明肺癌細胞的多藥耐藥性受miR- 214基因的顯著調控。

現已證實 ，Bcl- 2蛋白主要通過線粒體介導途徑引起細胞凋亡[14]，p53作為Bcl- 2的基因轉錄的負調控因子也參與了細胞凋亡的過程[15]。我們發現miR- 214基因過表達后，肺癌細胞內凋亡相關蛋白Bcl- 2和p53的表達具有顯著的差異性。結果表明，Bcl- 2的蛋白含量明顯降低，p53的蛋白含量顯著上升，這說明了miR- 214過表達可以激活細胞的凋亡途徑，引起肺癌細胞的凋亡和壞死，對肺癌細胞的多藥耐藥性產生影響，起到主要的調控作用。

綜上所述，上調miR- 214基因的表達可對肺癌細胞的增殖及凋亡能力產生顯著的調控作用；并可以誘導凋亡蛋白發揮作用啟動細胞凋亡過程，調節肺癌細胞的多藥耐藥能力。但是miR- 214是否可以作為臨床治療肺癌的靶點，其具體參與機體調節肺癌的機制還需進一步研究和探討。

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EffectsofmicroRNA-214up-regulationonapoptosisanddrugresistanceoflungcancercells

CHANGFen,XIAOGui-hua,LIQi

(DepartmentofRespiratoryMedicine,WuhanPurenHospital，Wuhan430081,China)

Objective: To investigate whether microRNA- 214 overexpression could affect multidrug resistance of lung cancer cells by regulating the process of apoptosis.MethodsHuman small cell lung cancer cell lines and human non- small cell lung cancer cell lines were selected for H69 cell group, H446 cell group, A549 cell group and H1299 cell group; Lung epithelial cells (BEAs- 2B) were served as control group. Real- time PCR was used to detect the expression of miR- 214. After up- regulated microRNA- 214 expression, MTT colorimetry was used to detect the sensitivity of lung cancer cells; CCK- 8 assay was used to detect cell viability; TUNEL assay was used to detect the levels of apoptosis by flow cytometry; the protein expression of Bcl- 2 and p53 were detected by Western blot.ResultsReal- time PCR showed that the expression of miR- 214 was significantly decreased in the lung cancer cell groups(P<0.05); CCK- 8 results showed that miR- 214 overexpression was significantly down- regulated the cell viability (P<0.05); miR- 214 overexpression was significantly decreased the drug sensitivity in lung cancer cells by MTT assay(P<0.05); compared with the control group, the protein expression of Bcl- 2 and p53 in lung cancer cells were significantly abnormally expressed (P<0.05).ConclusionUp- regulation of miR- 214 could decrease cell viability of the lung cancer and increase cell apoptosis, which may also regulate the apoptosis - related proteins and decrease the drug sensitivity in lung cancer cells.

MicroRNA- 214; lung cancer; apoptosis; multidrug resistance

2017- 05- 02

2017- 09- 12

常芬(1988-)，女，湖北武漢人，主治醫師， 主要研究方向：慢性阻塞性肺病、支氣管哮喘、肺癌等方面。E- mail：changfen1428@163.com

常芬，肖貴華，李琪.上調microRNA- 214表達對肺癌細胞凋亡及耐藥性的影響分析[J].東南大學學報：醫學版，2017，36(5)：811- 815.

R734.2

A

1671- 6264(2017)05- 0811- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.05.026

(本文編輯：孫茂民)