CNPs對腎結石大鼠尿液NGAL、MCP- 1水平和腎功能的影響

張林超，孫繼建，潘世杰，高世玉

(河南省中醫院/河南中醫藥大學第二附屬醫院 泌尿外科, 河南 鄭州 450002)

·論著·

CNPs對腎結石大鼠尿液NGAL、MCP-1水平和腎功能的影響

張林超，孫繼建，潘世杰，高世玉

(河南省中醫院/河南中醫藥大學第二附屬醫院 泌尿外科, 河南 鄭州 450002)

目的探討鈣化性納米微粒(CNPs)建立大鼠腎結石模型對其尿液中中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)、單核細胞趨化蛋白- 1(MCP- 1)水平和腎功能的影響。方法選取SPF級雄性SD大鼠24只，采用隨機數字表法分為實驗組、空白組各12只，實驗組采取靜脈注射CNPs建造大鼠腎結石模型，空白組注射等量生理鹽水，檢測實驗后不同時間點兩組大鼠尿液中NGAL、MCP- 1的水平,結石形成情況，大鼠腎臟病理變化及腎功能變化。結果實驗組大鼠在鼠造模后4h、12h、24h、1周、2周、8周尿液中NGAL、MCP- 1水平呈現逐漸升高的趨勢，并且每一個時間點對應的尿液NGAL水平均高于空白組(P<0.05)，造模后第1周、2周、8周時對應的尿液MCP- 1水平均高于空白組(P<0.05)；實驗組大鼠尿素氮、血肌酐水平在造模后第8周均高于空白組(P<0.05)；實驗組大鼠腎臟病理檢查均發現結石結晶形成，空白組未發現結石結晶形成。結論CNPs建立大鼠腎結石模型的作用機制可能與升高NGAL、MCP- 1水平有關，CNPs可造成腎臟功能的損傷。

鈣化性納米微粒； 腎結石； 中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白； 單核細胞趨化蛋白- 1； 大鼠

腎結石是一種常見的泌尿科疾病，其發病率較高，且近些年我國的患病人數持續增多，給家庭和社會帶來了沉重的負擔[1- 2]。自然環境、社會環境的影響以及個體的遺傳因素、飲食、生活習慣等都與腎結石的發生有一定關系，但對于結石產生的機制目前尚不完全清楚[3]。有研究[4]表明，腎小管細胞的損傷會促進草酸鈣晶體的成核和聚集,而結石的內部結構成分主要由草酸鈣構成。鈣化性納米微粒(calcifying nanoparticles,CNPs)是一種礦化蛋白復合體，其在生理性鈣磷濃度下能產生磷酸鈣鹽結晶，而進入體內后可在腎臟聚集，這可能與結石的形成過程有關[5]。為了進一步探討CNPs與腎結石形成的關系，本研究利用CNPs建立了大鼠腎結石模型，并對其尿液中中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白(NGAL)、單核細胞趨化蛋白- 1(MCP- 1)水平進行了檢測分析，為臨床提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選取SPF級雄性SD大鼠24只，3月齡，體重150～200g，平均(172.9±12.8)g，購買自西南醫科大學動物研究中心，喂養于22～25℃、相對濕度40%～60%、光照交替12h的環境中。

1.2 實驗儀器、藥品

γ射線滅活的胎牛血清購自美國Sigma公司，二甲苯、酒精、蘇木精、伊紅等均購自天津大茂試劑公司，NGAL、MCP- 1檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物有限公司。酶標儀為德國拜發儀器公司生產，顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.3 實驗動物分組及造模

將24只大鼠采用隨機數字表法分為實驗組、空白組各12只，實驗組采取靜脈注射CNPs混懸液(2ml·只-1)的方式建造大鼠腎結石模型，空白組注射等量生理鹽水。CNPs混懸液的制備方法如下：選取術中無菌收集“經皮腎鏡取石術”患者的結石標本，依次進行去礦物質、中和、洗滌、研磨處理后經濾器過濾，以2 000 r·min-1離心10 min后取管底液。取少量管底液接種于含 10%(體積分數)熱滅活胎牛血清(γ- FBS)的 1640 培養基中，于 37℃、5%CO2條件下培養 6～8 周，每30d換液1次。經形態學鑒定和染色鑒定后篩選出無污染的標本并制成CNPs 混懸液。

1.4 觀察指標及檢測方法

分別檢測兩組大鼠造模后4 h、12 h、24 h、1周、2周、8周尿液中NGAL、MCP- 1的水平；分別于建模后第8周檢測兩組大鼠的尿素氮、血肌酐水平；于第8周處死兩組大鼠，采用HE染色后進行顯微鏡觀察，觀察腎臟內結晶情況：無結晶(-)、腎髓質內結晶(+)、腎皮質內結晶(++)、腎乳頭內結晶(+++)、腎盂內結晶(++++)。

將收集尿液以3 000 r·min-1離心10min后取上清液，利用酶標儀采用酶聯免疫吸附法測定上清液中NGAL、MCP- 1水平，具體檢測步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

造模第8周時處死大鼠并摘下腎臟，沿縱軸剖開后利用 10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋后作連續切片，脫蠟后進行HE染色，光鏡下觀察腎臟組織內的結晶形成情況以及有無病理改變。

1.5 統計學處理

采用SAS10.0統計軟件進行數據統計分析，尿液中NGAL、MCP- 1、尿素氮、血肌酐水平采用均數±標準差進行統計描述，比較采用t檢驗，結石形成率比較采用兩獨立樣本的χ2檢驗；P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組實驗動物尿液中NGAL水平的變化

實驗組大鼠在鼠造模后4 h、12 h、24 h、1周、2周、8周尿液中NGAL水平呈現出逐漸升高的趨勢，并且每一個時間點對應的尿液NGAL水平均高于空白組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組實驗動物尿液中NGAL水平的變化 ng·L-1

2.2 兩組實驗動物尿液中MCP- 1水平的變化

實驗組大鼠在鼠造模后4 h、12 h、24 h、1周、2周、8周尿液中MCP- 1水平呈現出逐漸升高的趨勢，并且造模后第1周、2周、8周時對應的尿液MCP- 1水平均高于空白組(P<0.05)，見表2。

表2 兩組實驗動物尿液中MCP- 1水平的變化 μg·L-1

2.3 兩組實驗動物腎功能指標的比較

實驗組大鼠尿素氮、血肌酐水平在造模后第8周均高于空白組(P<0.05)，見表3。

2.4 兩組實驗動物的腎臟病理觀察

實驗組12只大鼠腎臟病理檢查均發現結石結晶形成，空白組均未發現結石結晶形成，實驗組的結石結晶形成率顯著的高于空白組(χ2=24.000,P=0.000),見圖1。

3 討 論

腎結石是一種較為常見的結石類型，屬于上尿路結石，主要是指腎、腎盂結石并能引起疼痛和血尿等癥狀，嚴重影響患者的生活質量[6- 7]。結石形成的原因有很多，多數認為與尿中形成結石晶體的鹽類呈飽和狀態有關，而年齡、性別、職業、社會經濟地位、飲食成份和結構、水分攝入量、氣候、代謝和遺傳等因素都會影響結石的發生和發展，但對于結石形成的具體機制目前尚不完全清楚[8- 9]。有研究[10]認為，絕大多數結石的形成過程都可能與間質內的磷酸鈣沉積有關，其形成機制可能跟一些感染性或者其他可傳播的物質如CNPs有關。CNPs具有獨特的生化礦化活性，可加速草酸鈣晶體的生長，進而可能參與了結石的形成過程[11]。Garcia等[12]將培養出的CNPs直接經皮向腎內注射，成功建立了CNPs致腎結石大鼠的動物模型。因此，本研究也參照Garcia的方法，將由腎結石患者術后所得的結石標本分離培養出CNPs并制成CNPs混懸液，經靜脈注射后建立腎結石模型，并進一步探討了CNPs對大鼠腎功能指標的影響。

組 別n尿素氮/mmol·L-1血肌酐/μmol·L-1實驗組1237.24±4.06114.27±13.93空白組127.33±0.8249.16±4.85t值25.01515.291P值 <0.001<0.001

A.實驗組大鼠HE染色結果，可見黃色結晶物質形成；B.驗組大鼠HE染色結果，可見圖中央腎小管處結石結晶，上方可見間質纖維增生；C.空白組大鼠HE染色結果，可見腎小管、腎小球形態正常

圖1第8周腎臟組織HE染色結果×200

3.1 CNPs對大鼠尿液中NGAL水平的影響分析

NGAL是一種相對分子量為25kDa的lipocalin家族蛋白，主要由受損的腎小管上皮細胞分泌和產生，是腎損傷的早期敏感標志物之一[13]。本研究通過對實驗組大鼠和空白組大鼠尿液中NGAL進行檢測比較發現，實驗組大鼠在鼠造模后4h、12h、24h、1周、2周、8周時尿液中NGAL水平呈現出逐漸升高的趨勢，并且每一個時間點對應的尿液NGAL水平均高于空白組，提示CNPs對腎小管上皮細胞具有一定的損傷作用，同時也表明CNPs導致結石形成的機制可能與上調NGAL表達水平有關。

3.2 CNPs對大鼠尿液中MCP- 1水平的影響分析

MCP- 1又稱單核細胞趨化和激活因子，屬于 CC亞族成員，其對單核細胞具有趨化活性，可激活單核細胞和巨噬細胞，并能趨化單核細胞和氧自由基進入炎癥組織，進而參與腎損傷的過程[14]。Habibzadegah- Tari等[15]的研究也證實，草酸鈣晶體可以促進腎小管上皮細胞合成和分泌 MCP- 1，而使用抗氧化劑可以抑制鈣鹽沉積，進而抑制腎結石的形成。本研究發現，實驗組大鼠在鼠造模后4 h、12 h、24 h、1周、2周、8周時尿液中MCP- 1水平呈現出逐漸升高的趨勢，并且造模后第1周、2周、8周時對應的尿液MCP- 1水平均高于空白組，提示CNPs能夠刺激和促進大鼠腎臟表達產生 MCP- 1，這可能也是CNPs促進結石形成的機制之一。本研究同時顯示，實驗組大鼠的尿素氮、血肌酐水平在造模后第8周均高于空白組，提示CNPs會對大鼠腎功能造成一定的損害，其原因可能與CNPs對大鼠腎小管上皮細胞的損傷有關。

本研究通過對大鼠靜脈注射CNPs后制作腎結石模型，實驗組大鼠腎臟病理檢查均顯示結石結晶形成，而空白組未發現結石結晶形成，實驗組大鼠的NGAL和MCP- 1表達水平均明顯升高，提示 CNPs建立大鼠腎結石模型的作用機制可能與升高NGAL、MCP- 1水平有關，但具體機制仍需做進一步的深入研究。

綜上所述，CNPs建立大鼠腎結石模型的作用機制可能與NGAL、MCP- 1水平有關，CNPs可造成腎臟功能的損傷。

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AnalysisofNGALandMCP-1levelsinratswithkidneystonesafterCNPsmodeling

ZHANGLin-chao,SUNJi-jian,PANShi-jie,GAOShi-yu

(DepartmentofUrology,theSecondAffiliatedHospitalofUniversityofTraditionalChineseMedicine,Zhengzhou450002,China)

Objective: To investigate the effects of the calcifying nanoparticles (CNPs) to establish a rat model of kidney stones on the levels of urine neutrophil gelatinase associated lipid carrier pale(NGAL), white light monocyte chemoattractant protein - 1 (MCP- 1) and kidney function.Methods24 male SD SPF rats were randomly divided into experimental group and control group with 12 rats in each group, the experimental group adopted intravenous injection of CNPs to build rat renal calculus model, the control group was injected with saline. The level of MCP- 1 and NGAL in rat urine, stone formation in rat kidney, pathological changes and the changes of renal function were measured at different time points.ResultsThe urine NGAL and MCP- 1 levels in the experimental group after modeling 4h, 12h, 24h, 1 week, 2 weeks and 8 weeks showed increasing tendency, and the urine NGAL levels at each time point were higher than that in control group (P<0.05), after modeling 1 week, 2 weeks and 8 weeks the urine MCP- 1 levels were higher than those of control group (P<0.05). The level of serum creatinine, urea nitrogen in rats of the experimental group in 8 weeks after surgery were higher than that in control group (P<0.05). Renal biopsy were found in the formation of stone crystals in the experimental group, the control group did not find the crystal stones form.ConclusionThe mechanism of CNPs to establish rat kidney stones model may be related to the increase of NGAL and MCP- 1 levels, and CNPs can cause kidney functional damage.

calcifying nanoparticles; renal calculi; neutrophil gelatinase associated lipid carrier pale; monocyte chemoattractant protein - 1; rats

2017- 02- 28

2017- 06- 12

張林超(1972-)，男，河南新密人，副主任醫師, 醫學碩士。E- mail: liushan12345624437@126.com

張林超，孫繼建，潘世杰，等. CNPs對腎結石大鼠尿液NGAL、MCP- 1水平和腎功能的影響[J].東南大學學報：醫學版，2017，36(5)：768- 772.

R692.4； R33- 33

A

1671- 6264(2017)05- 0768- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264. 2017. 05.017

(本文編輯：何彥梅)