CD36在糖尿病腎病患者腎組織中的表達及調控Wnt/β- catenin信號通路對人腎小管上皮細胞增殖凋亡的實驗研究

韓昕健，郝偉，孫秀燕，劉曄，李明明

(棗莊礦業集團中心醫院 內分泌科，山東 棗莊 277000)

·論著·

CD36在糖尿病腎病患者腎組織中的表達及調控Wnt/β-catenin信號通路對人腎小管上皮細胞增殖凋亡的實驗研究

韓昕健，郝偉，孫秀燕，劉曄，李明明

(棗莊礦業集團中心醫院 內分泌科，山東 棗莊 277000)

目的探討CD36在糖尿病腎病患者腎組織中的表達及調控Wnt/β- catenin信號通路對人腎小管上皮細胞增殖凋亡的影響。方法Western blot檢測CD36在糖尿病腎病中的表達；CD36小干擾RNA(CD36- siRNA)和陰性對照(siRNA- NC)轉染人腎小管上皮細胞HKC，以空脂質體轉染的細胞作為對照組，Western blot檢測轉染48 h后各組細胞中CD36蛋白表達；將后續實驗分為低糖組、高糖組、siRNA- NC+高糖組、CD36- siRNA+高糖組，各實驗組細胞培養48 h后，CCK8試驗檢測細胞增殖，流式細胞術檢測細胞凋亡，Western blot檢測B細胞淋巴瘤/白血病- 2(Bcl- 2)、Bcl2- Associated X的蛋白質(Bax)、p53、β- 連環蛋白(β- catenin)、細胞周期素D1(CyclinD1)蛋白表達。結果CD36在糖尿病腎病的表達顯著高于正常腎組織(P<0.01)；CD36- siRNA組CD36蛋白表達水平顯著低于對照組(P<0.01)；高糖組細胞存活率及Bcl- 2、β- catenin、CyclinD1蛋白表達顯著低于低糖組，細胞凋亡率及Bax、p53蛋白表達顯著高于低糖組(P<0.01)，siRNA- NC+高糖組細胞存活率、細胞凋亡率及Bcl- 2、Bax、p53、β- catenin、CyclinD1蛋白表達與高糖組比較差異無統計學意義(P>0.05)；CD36- siRNA組細胞存活率及Bcl- 2、β- catenin、CyclinD1蛋白表達顯著高于高糖組，細胞凋亡率及Bax、p53蛋白表達顯著低于高糖組(P<0.01)。結論CD36在糖尿病腎病中高表達，高糖能抑制人腎小管上皮細胞HKC的增殖，促進細胞凋亡，而沉默CD36基因的表達能減弱這種效果，其機制與Wnt/β- catenin信號通路的調控有關。

CD36基因； 糖尿病腎??； 人腎小管上皮細胞； Wnt/β- catenin信號通路； 增殖； 凋亡

糖尿病腎病(DN)是1型和2型糖尿病常見的和嚴重的慢性并發癥之一，據統計，有30%～40%的1型糖尿病患者和5%～10%的2型糖尿病患者在終末期會發展為慢性腎功能衰竭，而腎功能衰竭是引起糖尿病患者死亡的重要原因[1- 2]。因此，深入探究引起DN的發病機制并尋找延緩和預防DN的有效措施，對于DN的治療具有重要意義。

CD36是B族清道夫受體家族細胞表面的一種糖蛋白，可以與多種配體結合發揮生物學作用[3]。已有研究證實CD36參與糖尿病、動脈粥樣硬化、胰島素抵抗等疾病的病理過程， 而CD36在DN中的作用尚不清楚[4- 6]。Wnt信號通路在器官發生、胚胎發育及維持組織器官的穩定等方面發揮重要作用，且有研究顯示Wnt/β- catenin信號通路與糖尿病的發生有關[7- 8]。因此，本研究的目的是證實CD36在DN患者腎組織中的表達及調控Wnt/β- catenin信號通路對人腎小管上皮細胞增殖凋亡的影響，以期為DN的治療研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織和細胞 收集棗莊礦業集團中心醫院2011年3月至2016年9月DN患者的腎組織石蠟切片，經腎活檢病理檢查確診為DN，其中男25例，女15例，平均年齡(54.6±6.2)歲。對照組為2011年3月至2016年9月保存的腎癌患者手術切除的腎臟病灶以遠的正常腎組織的石蠟切片，其中男15例，女10例，平均年齡(44.6±7.2)歲，術前腎功能、血糖、尿蛋白均正常，且無心、肝疾病。人腎小管上皮細胞HKC購自上海信裕生物科技有限公司。

1.1.2 試劑和儀器 胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素、RPMI 1640培養基均購自美國Gibco公司；siRNA- NC、CD36- siRNA購自上海生工生物工程有限公司；p53、B細胞淋巴瘤/白血病- 2(B cell lymphoma/lewkmia- 2，Bcl- 2)、Bcl2- Associated X的蛋白質(Bax)、β- 連環蛋白(β- catenin)、細胞周期素D1(CyclinD1)單克隆抗體及辣根過氧化物標記的二抗均購于美國 Abcam公司；CCK- 8細胞增殖試劑盒和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Promega生物技術有限公司；Annexin V- FITC凋亡試劑盒及流式細胞儀購自美國BD公司；酶標儀購自美國BIO- RAD公司；倒置熒光顯微鏡購于日本Olympus公司；CO2細胞培養箱購自美國SIM公司。

1.2 方法

1.2.1 DN患者中CD36的表達檢測 將40例DN患者的腎組織及25例腎癌患者腎臟病灶以遠的正常腎組織放入預冷的研缽中，在液氮中將組織研磨成粉末。加入適量的裂解液冰上裂解反應30 min，4 ℃、12 000 r·min-1離心5 min,收集上清。按照BCA試劑盒說明測定提取的蛋白濃度。蛋白樣品在100 ℃變性3～5 min，取80 μg變性蛋白與上樣緩沖液充分混勻，恒壓電泳。當行濃縮膠時把電壓調成90 V，行分離膠時把電壓調成120 V，當電泳至距離分離膠下端約1 cm處時停止電泳。取出凝膠，轉膜，轉膜完成后用5%的脫脂奶粉封閉2 h，依次加入稀釋后的一抗(CD36單克隆抗體，1∶1000稀釋)、二抗(辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG，1∶1000稀釋)中反應后，滴加顯色液，轉移至暗室中，曝光，以甘油醛- 3- 磷酸脫氫酶(glyceraldehyde- 3- phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參，分析蛋白水平。

1.2.2 細胞培養 取出保存于液氮罐中的人腎小管上皮細胞HKC，水浴鍋中溶解，轉移融化的凍存細胞至無菌的離心管中，加入37 ℃預熱的低糖培養基，1 000 r·min-1離心5 min，再加入含有10%FBS、100 μg·ml-1鏈霉素和100 U·ml-1青霉素的RPMI1640低糖培養基，1 200 r·min-1離心5 min，去除上清。向細胞沉淀中加入細胞培養液懸浮細胞，接種到細胞培養皿中，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養。待細胞融合度達到80%以上時，棄去培養液。胰酶消化細胞，細胞收縮變圓后加入完全培養基終止消化，傳代。待細胞進入對數生長期后再用于實驗研究。

1.2.3 細胞轉染 按照2×105個·ml-1的濃度將生長至對數期的細胞接種到6孔細胞培養板中，每孔加2 ml細胞懸浮液，培養過夜。按照對照組(空脂質體轉染組)、siRNA- NC組(轉染100 nmol·L-1的NC- siRNA)、CD36- siRNA組(轉染100 nmol·L-1的CD36- siRNA)的分組進行轉染后，放置室溫下靜置20 min后形成轉染復合物。取500 μl轉染復合物加入到細胞中，放在37 ℃、5% CO2的培養箱中培養6 h，更換細胞培養液繼續培養。

1.2.4 轉染效果檢測 取轉染48 h的1.2.3中各組細胞，按照細胞蛋白提取試劑盒步驟提取細胞中的總蛋白。按照1.2.1方法檢測CD36蛋白表達。

1.2.5 實驗分組 將實驗分為5組：(1)低糖組：細胞中加入5.5 mmol·L-1的葡萄糖；(2)高糖組：細胞中加入25 mmol·L-1的葡萄糖；(3)siRNA- NC+高糖組：細胞中加入100 nmol·L-1的NC- siRNA和25 mmol·L-1的葡萄糖；(4)CD36- siRNA組+高糖組：細胞中加入100 nmol·L-1的CD36- siRNA和25 mmol·L-1的葡萄糖。

1.2.6 CCK- 8 檢測細胞增殖 將細胞以每孔200 μl、密度3×103個·ml-1接種到96孔細胞培養板上，細胞貼壁24 h后吸除上清，加入200 μl無血清的培養基再孵育24 h，使細胞同步化。按照1.2.5分組加入各組細胞，每組設置6個重復孔，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養48 h，每孔加入 CCK- 8試劑10 μl，37 ℃孵育4 h后，酶標儀在490 nm波長處測定并記錄各組的吸光度(OD)值。計算細胞增殖率。

1.2.7 流式細胞術檢測細胞凋亡 將生長至對數期的細胞以1×106個·ml-1接種于96孔細胞培養板中，細胞培養48 h后按照1.2.5分組加入各組細胞，每組設置6個重復孔，置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養48 h，取1 ml細胞懸液至離心管中，4 ℃、1 000 r·min-1離心5 min，棄上清，兩次洗滌細胞后在細胞沉淀中加入200 μl緩沖液，充分混勻后分別加入5 μl 碘化丙錠(PI)和膜聯蛋白(Annexin- V)，室溫避光靜置20 min，加300 μl緩沖液，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.8 Western blot檢測蛋白表達 取培養48 h的1.2.5分組的各組細胞，按照細胞蛋白提取試劑盒步驟提取細胞中的蛋白。按照1.2.1方法檢測Bcl- 2、Bax、p53、β- catenin、CyclinD1蛋白表達。

1.3 統計學處理

所有實驗數據采用SPSS 21.0軟件進行分析，結果用均數±標準差表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗，以P<0.01為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 CD36在DN中的表達

DN腎組織中CD36的蛋白表達顯著高于正常腎組織(P<0.01)(圖1)。

2.2 CD36- siRNA沉默效果檢測

siRNA- NC組CD36蛋白表達水平與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，CD36- siRNA組CD36蛋白表達水平顯著低于對照組(P<0.01)(圖2)。

2.3 CD36基因對人腎小管上皮細胞HKC增殖的影響

高糖組細胞存活率顯著低于低糖組(P<0.01)，siRNA- NC+高糖組細胞存活率與高糖組比較差異無統計學意義(P>0.05)，CD36- siRNA+高糖組細胞存活率顯著高于高糖組(P<0.01)(圖3)。

與正常腎組織比較，aP<0.01

A.Western blot檢測結果圖；B.CD36蛋白相對表達量

圖1CD36在DN及正常腎組織中的表達

與對照組比較，aP<0.01

A.Western blot檢測結果圖；B.蛋白表達率

圖2轉染后各組細胞中CD36蛋白表達水平

與低糖組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP>0.05,cP<0.01

圖3CD36基因對人腎小管上皮細胞HKC增殖的影響

2.4 CD36基因對人腎小管上皮細胞HKC凋亡的影響

高糖組細胞凋亡率及p53和Bax蛋白表達顯著高于低糖組，Bcl- 2蛋白表達顯著低于低糖組(P<0.01)；siRNA- NC+高糖組細胞凋亡率及Bcl- 2、Bax、p53蛋白表達與高糖組比較差異無統計學意義(P>0.05)；CD36- siRNA組細胞凋亡率及p53和Bax蛋白表達顯著低于高糖組，Bcl- 2蛋白表達顯著高于高糖組(P<0.01)(圖4)。

2.5 CD36基因對β- catenin、CyclinD1蛋白表達的影響

高糖組β- catenin、CyclinD1蛋白表達顯著低于低糖組(P<0.01)，siRNA- NC+高糖組β- catenin、CyclinD1蛋白表達與高糖組比較差異無統計學意義(P>0.05)，CD36- siRNA組β- catenin、CyclinD1蛋白表達顯著高于高糖組(P<0.01)(圖5)。

3 討 論

CD36是一種糖蛋白，位于多種細胞表面，在內皮細胞、脂肪細胞、巨噬細胞等都有表達。其功能包括與TSP- 1等膜蛋白一起誘導細胞凋亡、去除血漿中被氧化的低密度脂蛋白等[9- 10]。有研究指出，CD36的表達可能參與腎組織的損傷[11]。在研究DN的機制中發現CD36的表達伴隨腎小管上皮細胞變性及凋亡，高糖刺激可上調CD36的表達[12]。本研究中我們首先確定CD36在DN中的表達，并進一步研究沉默CD36的表達對高糖誘導的人腎小管上皮細胞增殖及凋亡的影響，將實驗分為低糖組、高糖組、siRNA- NC+高糖組、CD36- siRNA組+高糖組，結果顯示，高糖能誘導人腎小管上皮細胞凋亡，而沉默CD36的表達能減弱這種作用。

與低糖組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP>0.05,cP<0.01

A.流式細胞術檢測結果；B.細胞凋亡率；C.Western blot檢測結果圖；D.蛋白表達率

圖4CD36基因對人腎小管上皮細胞HKC凋亡的影響

與低糖組比較，aP<0.01；與高糖組比較，bP>0.05,cP<0.01

A.Western blot檢測結果圖；B.蛋白表達率

圖5CD36基因對β-catenin、CyclinD1蛋白表達的影響

細胞凋亡是指機體在一系列基因的調控作用下所引起的細胞的程序性死亡過程，對于維持機體的穩定發揮重要作用。若調控細胞凋亡的機制發生紊亂，可誘導多種疾病的發生[13]。目前證實有多種基因參與調控細胞的凋亡過程。p53可抑制腫瘤發生，參與調控細胞周期、DNA轉錄過程及一些代謝途徑[14]。有研究顯示，p53活化后能啟動與凋亡相關的基因，從而誘導細胞的凋亡[15]。Bax、Bcl- 2是Bcl- 2家族兩個重要的調節蛋白，分別發揮促凋亡和抑凋亡作用。且Bcl- 2/Bax的比例是啟動細胞凋亡的關鍵因素。當兩者之間的比率上調時，可抑制細胞凋亡，當兩者之間的比率下調時，可誘導細胞的凋亡[16- 17]。本研究中檢測p53、Bax、Bcl- 2蛋白表達，結果顯示，高糖組p53、Bax蛋白表達顯著高于低糖組，Bcl- 2蛋白表達顯著低于低糖組(P<0.01)，CD36- siRNA組p53、Bax蛋白表達顯著低于高糖組，Bcl- 2蛋白表達顯著高于高糖組。這說明沉默CD36的表達可通過調控p53、Bax、Bcl- 2蛋白表達抑制細胞凋亡。

Wnt/β- catenin信號通路是研究較多的Wnt信號轉導通路的一個分支，當Wnt信號通路被激活時，β- catenin在胞質內積累進而進入細胞核，與核內Tcf/Lef轉錄因子形成復合體，激活下游的CyclinD1、c- myc等一系列靶基因，當這些靶基因被激活后可對多種基因的表達進行調控，對細胞的增殖、凋亡等過程發揮重要作用[18- 19]。研究顯示，在正常腎臟中Wnt信號是靜默的，胞質中也僅有很少的β- catenin，當腎發生損傷后可引起腎小管上皮及間質細胞中β- catenin的活化[20]。本研究中檢測β- catenin、CyclinD1蛋白表達，結果顯示，高糖組β- catenin、CyclinD1蛋白表達顯著低于低糖組(P<0.01)，CD36- siRNA組β- catenin、CyclinD1蛋白表達顯著高于高糖組(P<0.01)。

綜上所述，CD36在DN患者腎組織中高表達，高糖能抑制人腎小管上皮細胞HKC的增殖，促進細胞凋亡，而沉默CD36基因的表達能減弱這種效果，其機制與Wnt/β- catenin信號通路的調控有關。本研究為DN的治療提供了理論依據。

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ExpressionofCD36indiabeticnephropathyandregulationofWnt/β-cateninsignalingexperimentalstudyonproliferationandapoptosisofhumanrenaltubularepithelialcells

HANXin-jian,HAOWei,SUNXiu-yan,LIUYe,LIMing-ming

(DepartmentofEndocrinology,CentralHospitalofZaozhuangMiningGroup,Zaozhuang277000,China)

Objective: To investigate the expression of CD36 in diabetic nephropathy and regulation of Wnt/β- catenin signaling experimental study on proliferation and apoptosis of human renal tubular epithelial cells.MethodsThe expression of CD36 in diabetic nephropathy was detected by Western blot; CD36 small interfering RNA (CD36- siRNA) and negative control (siRNA- NC) were transfected into human renal tubular epithelial cells HKC, and empty liposome transfected cells as the control group; the expression of CD36 protein after transfected for 48 h was detected by Western blot; the subsequent experiments were divided into low glucose group, high glucose group, siRNA- NC+high glucose group, and CD36- siRNA+high glucose group, the experimental group cell were cultured for 48 h, cell proliferation was detected by CCK8 test, apoptosis was detected by flow cytometry, the expression of p53, Bax, Bcl- 2, β- catenin and CyclinD1 protein were detected by Western blot.ResultsThe expression of CD36 in diabetic nephropathy was significantly higher than that in normal renal tissue (P<0.01); the expression level of CD36 protein in CD36- siRNA group was significantly lower than the control group (P<0.01); cell survival rate and Bcl- 2, β- catenin and CyclinD1 protein expression in high glucose group was significantly lower than in low glucose group, while the apoptosis rate and the expression of Bax and p53 protein was significantly higher than low sugar group (P<0.01); cell survival rate, apoptosis rate and Bcl- 2, Bax, p53, β- catenin and CyclinD1 protein expression in siRNA- NC+high glucose group compared with high glucose group had no significant difference (P>0.05); the survival rate and Bcl- 2, β- catenin and CyclinD1 protein expressionin in CD36- siRNA+high glucose group was significantly higher than in high glucose group, while the expression of Bax and p53 protein and the apoptosis rate was significantly lower than the high glucose group (P<0.01).ConclusionThe expression of CD36 in diabetic nephropathy is higher, high glucose can inhibit cell proliferation of human renal tubular epithelial cells HKC, promote cell apoptosis , and Silencing the expression of the CD36 gene could attenuate this effect, and its mechanism is related to the regulationof Wnt/β- catenin signaling pathway.

CD36 gene; diabetic nephropathy; human renal tubular epithelial cells; Wnt/β- catenin signaling pathway; proliferation; apoptosis

2016- 11- 24

2017- 06- 23

韓昕健(1983- )，男，山東棗莊人，主治醫師，醫學碩士。E- mail:qiuqiuli133@126.com

韓昕健，郝偉，孫秀燕，等.CD36在糖尿病腎病患者腎組織中的表達及調控Wnt/β- catenin信號通路對人腎小管上皮細胞增殖凋亡的實驗研究[J].東南大學學報:醫學版,2017,36(5)：704- 710.

Q255；R692.6

A

1671- 6264(2017)05- 0704- 07

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.05.005

(本文編輯：何彥梅)