熱水預處理生物質原料及其生物轉化研究進展*

陳 倩 陳京環 王 堃 蔣建新 孫潤倉

(1.北京林業大學 北京 100083； 2.中國制漿造紙研究院 北京 100102)

熱水預處理生物質原料及其生物轉化研究進展*

陳 倩1陳京環2王 堃1蔣建新1孫潤倉1

(1.北京林業大學 北京 100083； 2.中國制漿造紙研究院 北京 100102)

在能源問題日益緊張的時局下，尋求可再生清潔能源是亟待解決的關鍵問題。由農林廢棄物轉化獲得新能源、新材料已經成為重要的發展趨勢，其中生物乙醇作為環保、可持續的新型能源得到了廣泛關注。預處理作為生物乙醇制備的第一個重要環節備受重視，傳統化學預處理技術能量消耗大、對設備要求高、半纖維素降解嚴重且對環境造成污染，沒有充分考慮半纖維素和木質素的高值化回收利用，單一化降解纖維素使得經濟利用價值很低；生物預處理作為一種環境友好和低成本的預處理技術，也存在著轉化效率低、作用周期長和碳水化合物損失嚴重的缺點。熱水預處理通過條件參數優化可在盡量保留天然大分子原位結構的基礎上，一定程度地破壞植物細胞壁的致密結構，且僅利用水作為反應試劑，具有無化學藥劑使用、對環境友好、操作成本低等優點，其對生物質細胞壁的主要作用為使木素-碳水化合物復合體(LCC)連接鍵斷裂并除去部分半纖維素，使木質素性質發生改變并進行再分配，且在一定程度上降低了纖維素的聚合度。熱水預處理過程中生成的糠醛、5-羥甲基糠醛、甲酸、乙酸等產物，會對生物降解產生抑制作用，可以通過優化條件來控制其含量。酶解過程是指利用纖維素酶及其輔助酶將預處理后的纖維素降解為可發酵單糖，若直接將預處理后的產物進行發酵則需要較長時間且僅能獲得極低濃度的乙醇。酶水解過程中由于半纖維素和木質素的保護作用，阻礙了纖維素酶與纖維素底物的接觸，而預處理過程則會削弱或完全破壞這種阻礙作用，增大酶與纖維素的接觸面積使酶解效率提高。提高預處理溫度會使乙醇發酵得率提高，但是預處理溫度過高會導致纖維素降解從而使乙醇得率降低。本文對熱水預處理過程中纖維素、半纖維素、木質素物理化學性質的改變和處理過程中抑制物的轉化生成進行總結，分析比較在不同預處理條件下生物質中各主要組分和降解產物不同程度的變化及其對后續酶水解、酵母發酵的影響。

熱水預處理； 木質生物質； 抑制物； 酶水解； 生物乙醇

化石能源使人們生活發生了翻天覆地的變化，人們對能源的消耗也越來越多，交通運輸、制造業、電力等部門都在消耗大量能源。對化石能源的高度依賴，不僅使能源逐漸短缺，而且對環境造成了負面影響。隨著化石能源的枯竭以及面臨的全球變暖問題，人們開始尋求新型環保能源，其中使用生物質轉化為乙醇是目前最受人們關注的生產液體燃料的方法?；谀举|纖維生物質來源廣、成本低等特點，使用這類原料制備生物乙醇的研究已經取得了很大進展(李文等， 2009)； 然而，目前乙醇的生產技術還不能滿足市場要求，大規模地生產乙醇燃料需要新的思路。

木質生物質轉化為乙醇主要包括4個步驟： 1) 木質生物質的預處理； 2) 纖維素經酶水解轉化為葡萄糖； 3) 將葡萄糖發酵轉化為乙醇； 4) 乙醇的分離和脫水(Mosieretal., 2005a)。其中，木質生物質的預處理是十分關鍵的一步，其原因在于木質生物質結構的復雜性。木質生物質主要由纖維素(30%～45%)、半纖維素(20%～35%)和木質素(10%～30%)3種高分子聚合物組成，在分子水平上纖維素、半纖維素和木質素分子間存在不同的結合力。木質素為不定形、非均一、非線性的三維立體高聚物，除分子間的化學連接外，還同時以共價鍵和半纖維素結合，而纖維素線性分子間和分子內氫鍵形成的結晶結構，使其難溶于水，導致纖維素在自然條件下水解速率極低。典型的物理化學預處理方式，如蒸汽爆破、有機溶劑、硫酸和熱堿等，對反應設備要求嚴格，耗費大量的能源(Sunetal., 2002； Silversteinetal., 2007； Dataretal., 2007)，并且產生對后續酶水解有抑制作用的物質，生產成本高昂且污染環境；生物預處理作為一種環境友好和低成本的預處理技術，也存在著效率低、作用周期長和碳水化合物嚴重損失的缺點(Kelleretal., 2003； Hwangetal., 2008； Zhangetal., 2007； Shietal., 2008； 2009)。熱水預處理通過高溫高壓來處理木質纖維素，能部分水解半纖維素并破壞木質素及纖維素的結構，增加生物轉化底物的酶可及面積(Mosieretal., 2005a)，被認為是成本效益最優的木質生物質預處理方式(Yuetal., 2010a)。在120～230 ℃的溫度條件下熱水預處理生物質原料245 min，會有40%～60%的物料損失，其中包括4%～22%的纖維素、35%～60%的木質素和幾乎全部的半纖維素組分(Mosieretal., 2005a)，該預處理方法具有腐蝕性小、無沉淀產生且操作成本低等特點(Liuetal., 2010)。

1 熱水預處理對木質纖維生物質結構化學成分的影響

木質生物質具有復雜、精細的細胞壁結構，了解預處理過程中纖維素、半纖維素、木質素的化學轉化和預處理后的結構特點對于消除生物質抗降解屏障十分有幫助(Caoetal., 2012)。熱水預處理過程對細胞壁的作用可以歸結為以下3方面： 1) 木素-碳水化合物復合體(LCC)連接鍵斷裂并除去部分半纖維素； 2) 木質素性質改變和再分配； 3) 纖維素的消晶化(Chundawatetal., 2011)。

1.1熱水預處理過程木質素理化性質變化

木質素主要存在于細胞壁的次生壁S2層中，其主要結構單元為對羥苯基丙烷(H)、愈創木基丙烷(G)和紫丁香基丙烷(S)，主要通過C—C鍵和醚鍵進行連接，其中以β—O—4芳基醚鍵連接鍵最多，主要功能基團為甲氧基、羥基(酚羥基和醇羥基)和羰基。諸多因素(物種、科屬、生長環境等)會造成植物間木質素含量和組成的不同，闊葉木中木質素含有大量紫丁香基結構，其次為愈創木基結構，針葉木中以愈創木基為主，而禾本科(Gramineae)中3種結構單元均有一定分布(鄭大峰等， 2005)。圖1為不同反應條件下樣品預處理前后的掃描電鏡(SEM)圖像，試驗將高壓反應釜內進行熱水預處理后的樣品與較為溫和的處理方法——索氏提取和回流(以水為溶劑)處理后的樣品進行對比，可以觀察到后者處理的樣品其表面形態與原料相似，而在高溫水熱處理時，原料破損嚴重，顏色變深，并且表面有液滴狀顆粒(Nitsosetal., 2013)。熱水預處理可以除去一小部分木質素(溶于酸的部分)，但在處理過程中木質素熔融、固化并在纖維表面再聚合，同時也使部分木質素與碳水化合物之間的連接斷裂，改變了木質素的化學結構和分布狀況(Aitaetal., 2010)。一些研究表明，酸不溶木素經過酸性條件處理后會比處理前的含量更高，這種現象被認為是多糖降解產物(如糠醛)重新聚合或者多糖與木素聚合形成的木素類化合物，被稱為“假木素”(Jungetal., 2010； Maoetal., 2010； Lietal., 2005)?！凹倌舅亍敝泻恤然Ⅳ驶⒅咀搴头枷阕褰Y構，并且在不同預處理條件下分子質量變化不大(Mn～1 000 g·mol-1; Mw～5 000 g·mol-1)(Huetal., 2012)。與此同時，木質素在高溫水解離的H離子的作用下會形成芐醇結構中間體，醚鍵不穩定容易發生斷裂，斷裂后的木素碎片與相鄰芳香環中的正碳離子形成C—C連接。在較為劇烈的條件下，木質素再縮合阻礙了熱水預處理過程中的解聚作用和木質素的脫除，雖然醚鍵斷開，但是β—O—4′鍵脫除的速率接近于0(Lietal., 2007)。

圖1 原料和不同溫度熱水預處理后樣品的掃描電鏡(SEM)圖像(Nitsos et al., 2013)Fig.1 SEM images of the parent and representative hydrothermally treated biomass samples at increasing temperature and constant reaction time (15 min) (Nitsos et al., 2013)

1.2熱水預處理過程纖維素理化性質變化

經熱水預處理后，固體殘渣中纖維素含量隨預處理強度的增加而減少，同時，水解液中葡萄糖、纖維二糖、纖維素低聚物等纖維素降解產物的含量相應增加(Petersenetal., 2009； Liuetal., 2003)。在不同熱水預處理溫度下，進一步分析處理液中的產物發現，纖維素無定形結構中的一些短鏈仍與結晶纖維素通過氫鍵等連接在一起(Yuetal., 2010b)。在較低的預處理溫度(100 ℃)下，無定形區內的短分子鏈會生成C4-C13的低聚物，而完全斷裂糖苷鍵形成葡萄糖單體的最低溫度為150 ℃左右，纖維素結晶區開始水解為葡萄糖單體的溫度為180 ℃左右，這是由于纖維素結晶區分子內和分子間的氫鍵作用，極大削弱了H離子對糖苷鍵的作用效果。纖維素無定形區與結晶區之間的氫鍵和鏈長也存在差異，這些差異會在很大程度上影響熱水預處理水解液中葡萄糖低聚物的分布。通常，在相同水解溫度下，無定形纖維素相對于結晶部分在主要降解物中會生成更多葡萄糖及其低聚物，但生成低聚物的選擇性并不隨纖維素聚合度的降低而增加(Yuetal., 2010b)。徐紹華等(2013)利用X射線衍射法研究經高溫熱水預處理后的桉木(Eucalyptus)發現，纖維素的結晶度在高溫熱水預處理前后變化很小，但在微觀形態(圖2)上，處理后的桉木比原料纖維長度明顯變短，碎片化現象顯著，纖維之間的結合變得松弛，可以清晰觀察到纖維的斷裂。Saha等(2013)以麥草桿為原料在200 ℃下進行熱水預處理，處理時間小于25 min時，隨著時間增加，越來越多的纖維素被水解，但是處理時間超過25 min直至60 min，纖維素的水解量緩慢降低。

圖2 桉木高溫熱水預處理前后及酶解殘渣的掃描電鏡(SEM)圖像(徐紹華等， 2013)Fig.2 SEM images of Eucalyptus before and after hot water pretreatment and enzymolysis (Xu et al., 2013)a.桉木原料Eucalyptus materials; b.預處理后 Materials after pretreatment.

1.3熱水預處理過程半纖維素理化性質變化

與纖維素不同，半纖維素的組成與細胞組織、植物種類、糖苷鍵類型、側鏈組成和聚合度有關(Fengeletal., 1984； Jeffries, 1994)。聚木糖的水解機制通常采用擬均相反應動力學模型和預處理強度參數來表達，但是聚木糖的動力學研究非常困難，不僅反應步驟復雜，而且還受很多因素影響(馬靜， 2015)。Conner等(1986)提出，木聚糖水解為低分子質量的木寡糖為第1階段，第2階段的主要產物為木糖。在熱水預處理過程中，木質生物質中的碳水化合物會發生降解反應或者溶解在水溶液中，尤其是半纖維素主要分解為可溶性低聚物和單糖。隨著預處理溫度和時間增加，更多的木聚糖被降解，在糖苷鍵斷裂的同時，從半纖維素上脫離下來的乙?；谒芤褐行纬梢宜?，己糖降解產生5-羥甲基糠醛而戊糖降解為糠醛，并可進一步降解生成甲酸(Klinkeetal., 2003； Larssonetal., 1999； Luetal., 2009)。反應過程中生成的乙酸可以促進水解，乙酸中的水合氫離子比水中產生的水合氫離子對水解過程的作用更大(Garroteetal., 1999)。Yu等(2013)在熱水預處理過程中根據木糖和降解產物的變化，得出在較高的預處理溫度和壓強下，體系中的木糖分解得更多更快。李海龍等(2012)用熱水對相思木(Acacia)進行預處理發現，處理液pH隨著預處理時間增加逐漸下降，水解結束時pH最低可達到3.0，期間處理液中的糖含量呈現先增加后降低的趨勢。當處理液pH達到3.2左右時，糖的含量達到最大值，然后隨著pH下降，糖含量以較快的速度下降。

2 熱水預處理對抑制物的影響

熱水預處理過程中會生成許多化學中間體和副產物，對水解酶(包括纖維素酶、木聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等)和發酵微生物產生抑制作用，從而使水解和發酵速率減慢。Kont等(2013)通過高效液相色譜和質譜分析證實熱水預處理過程中會生成抑制纖維素酶活性的低聚糖(聚合度7～10)，主要由半纖維素斷裂形成并溶解在處理液中(Puetal., 2013; Holopainen-Mantilaetal., 2013)。在乙醇發酵過程中，抑制物主要包括3類： 弱酸(甲酸、乙酸、葡萄糖醛酸、乙酰丙酸、阿魏酸和對香豆酸)、呋喃醛類(糠醛、羥甲基糠醛)和酚類(對苯二酚)，其中弱酸會使細胞內環境酸化，是抑制細胞生長的主要原因，呋喃醛類化合物對釀酒酵母的影響主要是抑制酵母生長，而酚類化合物對發酵具有最強的抑制作用，并且低分子質量酚類化合物毒性更強(李洪興等， 2009； 李志強等， 2015； 肖領平， 2014)。在熱水預處理的初始階段，基本沒有糠醛生成，當預處理溫度從25 ℃升至170 ℃、升溫速率為1.2 ℃·min-1、保溫時間為120 min的條件下，反應時間和H-因子(不同溫度下相對反應速率常數與其時間的函數的積分面積)分別達到150 min和450時，生成的糠醛含量隨著反應時間和H-因子增加呈直線增加；在熱水預處理溫度140～160 ℃時得到的糠醛[(0.31±0.00) mg·g-1)]和5-羥甲基糠醛[(0.11±0.01) mg·g-1]含量較低，在180 ℃糠醛含量增加到(0.63±0.02) mg·g-1，5-羥甲基糠醛含量依然為(0.11±0.01) mg·g-1，在200 ℃時二者生成含量分別為(12.00±2.00) mg·g-1和(1.00±0.10) mg·g-1(李海龍等， 2012)。乙酸在熱水解過程中的含量與糠醛和5-羥甲基糠醛類似，200 ℃時每克原料可以生成(32±0.0) mg乙酸(Sahaetal., 2013)。Min等(2015)將熱水預處理分2步進行，證明當第1步熱水預處理低溫、較長時間進行，第2步熱水預處理高溫、較短時間進行，相比單一的在較高或較低熱水預處理強度下，可以更有效地減少抑制物含量從而提高糖的生物轉化效率。

3 熱水預處理對酶水解的影響

通過酶水解和微生物降解從植物細胞中獲得較高得率的葡萄糖，預處理是十分關鍵的一步。植物細胞中的木質素和半纖維素對纖維素具有保護作用，預處理過程可以破壞或除去木質素和半纖維素，使酶更容易接觸到纖維素從而促進酶解效率(Kumaretal., 2009； Mosieretal., 2005a)。在熱水預處理過程中，木質素從木材細胞中轉移到纖維素表面，可降低酶的可及度，減慢酶水解速率，但是這種抑制作用隨著水解時間增加會有所減弱，在纖維素轉化率較高的情況下幾乎消除。研究表明，生物酶制劑與木質素液滴之間的結合并不是抑制作用的主要原因，纖維素表面的木質素液滴形成的阻礙作用才是抑制酶水解的重要因素，其作用大小主要取決于木質素聚合物分子的化學性質和粒徑大小(Lietal., 2014)。Jeoh等(2007)認為，預處理強度會影響酶解過程中酶與底物的反應程度。熱水預處理后的酶水解效率主要取決于預處理溫度和時間，較長的預處理時間不利于半纖維素的回收，但是隨著預處理時間增加纖維素的水解是先增加后降低的。熱水預處理溫度對于酶水解過程十分重要，在預處理溫度達到160 ℃之前，隨著預處理溫度升高，酶解糖含量緩慢增加，但是在溫度達到180 ℃時得到的酶解糖比160 ℃時增加了55%，預處理溫度200 ℃又比180 ℃時增加了43.5%(Sahaetal., 2013)。Dien等(2006)通過對比經熱水預處理和未經預處理的無淀粉玉米纖維，發現在經熱水預處理原料上培育的真菌產生的酶活性更強，并且當預處理時間從20 min增加到30 min時，木糖的得率增加了14%，延長預處理時間可以除去更多非碳水化合物的側鏈基團或者更進一步使細胞結構打開從而增加木糖的可消化性。Mosier等(2005b)對比研究了190 ℃、15 min和200 ℃、5 min 2種熱水預處理強度后發現，二者的固體損失分別為35%和30%，而前者最終經酶水解后的總糖得率較高，說明對于總碳水化合物利用的生物轉化效率與熱水預處理過程中的物料損失有關，其中主要是半纖維素過度降解。Park等(2010)通過X射線衍射和核磁共振等方法測定纖維素結晶度對酶解效率的影響，結果發現結晶度對酶解效率的影響并不清晰，除了結晶度外，木質素/半纖維素含量和分布、孔隙率和顆粒大小也會產生影響。一些研究甚至認為結晶度指數在酶水解過程中是增加的，但是增加量很少(Caoetal., 2005； Chenetal., 2007； Wangetal., 2006)。

4 熱水預處理對乙醇濃度的影響

Negro等(2003)對經熱水處理后的黑楊(Populusnigra)進行同步糖化發酵發現，隨著預處理溫度升高，糖化發酵得率升高，最大得率達到理論值的60%(理論值為原料中含有的葡萄糖成分全部進行糖化發酵，每克葡萄糖可以生成0.51 g乙醇)。Díaz等(2010)研究表明，油菜(Brassicacampestris)籽經217.7 ℃、42.2 min熱水預處理和酶水解處理后，得到了原料中葡萄糖含量的70%，相應地，同步糖化發酵也會得到了較高的得率；但是如果預處理強度過于劇烈，會造成部分纖維素降解，使生物乙醇得率降低。Romaní等(2010)用桉木在195～250 ℃下進行預處理，經酶解糖化發酵后發現，當預處理溫度達到210 ℃時，全部纖維素已為葡萄糖，當預處理溫度超過230 ℃時，部分纖維素降解損失，導致乙醇得率降低。Da Cruz等(2012)以甘蔗(Saccharumofficinarum)作為原料優化熱水預處理條件，當處理條件為190 ℃、17.2 min時，用重組啤酒酵母進行發酵乙醇得率最高(理論最高產量的50.1%)，并且熱水預處理后的酶水解產物無需進行脫毒操作即可直接進行發酵操作(Sahaetal., 2013)。

5 問題與展望

在能源問題日益緊張的時局下，尋求可再生清潔能源是亟待解決的關鍵問題，而乙醇燃料無疑是化石能源的最佳替代者?；谀举|纖維生物質來源廣、成本低等特點，使用這類原料制備生物乙醇的研究取得了很大進展。作為地球上儲量最豐富的生物有機質，木質纖維素每年通過光合作用固定的太陽能達4×1021J，但是其利用率僅為0.27%(Márquezetal., 2007)，如何合理利用這一巨大的生物質資源已成為該領域研究的重點和熱點。木質生物質細胞壁結構復雜，導致纖維素在自然條件下水解速率極低，預處理是生產乙醇燃料十分關鍵的一步。熱水預處理是成本效益最優的木質生物質預處理方式之一，且對環境友好，雖然通常要在高溫下進行，需要配備耐高壓的反應容器，但是反應過程中不需要添加其他化學試劑，反應時間較短，在盡量保留天然大分子原位結構的基礎上一定程度地破壞了植物細胞壁的致密結構。木質生物質復雜的理化組成和多級結構的不均一性，是阻礙其經濟高效水解產糖的另一關鍵問題，盡管輔助一些經濟有效的預處理手段，但添加單一纖維素酶實現木質纖維素-糖轉化依然難以跨越酶解成本過高的障礙，常常需要由纖維素酶和輔助酶(其他水解酶)構成的組合酶(催化水解同一底物但不同來源和特性的2種或2種以上酶配合而成的酶制劑，這些酶之間具有互補性)、復合酶(催化水解不同底物的多種酶混合而成的酶制劑，這些酶的來源相同或不同)或組合型復合酶等混合酶共同作用，才能實現預期目標(馮定遠等， 2008)。熱水預處理過程中生成的副產物可以通過進一步處理生成更有價值的產品，其中糠醛用途廣泛，可以應用在醫藥、塑料、橡膠等領域，5-羥甲基糠醛的化學性質也較為活潑，可以應用在化工領域，甲酸和乙酸在諸多領域中均有良好應用，乙酸還可以作為催化劑促進生物質原料中化學鍵的斷裂。熱水預處理作為一種預處理方式具有很多優勢，相信經過不斷努力和發展，可以得到更廣泛的應用，為實現生物質能源工業化生產帶來更多契機。

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(責任編輯 石紅青)

ResearchProgressontheHydrothermalPretreatmentofLignocellulosicBiomassandItsBioconversion

Chen Qian1Chen Jinghuan2Wang Kun1Jiang Jianxin1Sun Runcang1

(1.BeijingForestryUniversityBeijing100083； 2.ChinaNationalPulpandPaperResearchInstituteBeijing100102)

With the energy problem increasingly serious, to seek renewable clean energy has become the key problem to be solved. Transformation of agricultural and forestry wastes into new materials, calorific value of energy, chemical materials are becoming an important new tendency. Bioethanol is attacking more and more attentions since it is a sustained development model of environmental protection type. Pretreatment is an initial step in ethanol preparation process and traditional chemical-pretreatment methods consume a lot of energy, require highly on equipment, seriously degrade hemicellulose and pollute environment seriously. Besides, the traditional pretreatment methods were not focused on hemicellulose and lignin for high value applications, facing the low-coefficient utilization of whole biomass and the financial upside of single product model. As one of the pretreatment methods, biological process is an eco-friendly and low-cost process, but it also has disadvantages of hydrothermal pretreatment tries to keep the structure of natural macromolecules, and break plant cells at a certain degree, in which water is the only reagent. It has such advantages as lower chemical dosage, environmental friendly, low operation costs and the major effects of hydrothermal pretreatment on biomass cell wall are breaking the bonds of lignin-carbohydrate connection (LCC), removing parts of hemicellulose, modifying lignin and reducing cellulose crystallinity. Inhibitors (furfural, 5-hydroxymethyl furfural, formic acid, acetic acid) are generated in the hydrothermal pretreatment process and restrain the biological degradation process. The quantity of inhibitors varies indifferent pretreatment conditions and can be controlled by changing the conditions. Enzyme hydrolysis is a bioprocess transforming cellulose into monosaccharide, more time and lower ethanol content could be obtained by direct fermentation of pretreated substrate. Hemicellulose and lignin hinder enzyme contacting with cellulose. When hemicellulose and lignin are broken by pretreatment, the contacting efficiency of enzyme and cellulose could be increased. The yield of ethanol increased with the increasing temperature, however, the yield decreased when the temperature was too high. The chemical and structural changes of cellulose, lignin and hemicelluloses are summarized, in this paper, as well as the generated inhibition in the hydrothermal process. The effects of various pretreatment conditions on enzyme hydrolysis and ethanol fermentation are also discussed in detail.

hydrothermal pretreatment； lignocellulosic biomass； inhibitors； enzyme hydrolysis； bioethanol

TQ35

A

1001-7488(2017)09-0097-08

10.11707/j.1001-7488.20170912

2016-04-05；

2016-06-20。

北京市自然科學基金項目(6174046)； 北京林業大學材料科學與技術學院創新計劃項目。

*王堃為通訊作者。