偏腫革裥菌錳過氧化物酶酶學性質和染料脫色*

張玉龍 池玉杰 馮連榮，2

(1. 東北林業大學林學院 哈爾濱 150040； 2. 遼寧省楊樹研究所 蓋州 115213)

偏腫革裥菌錳過氧化物酶酶學性質和染料脫色*

張玉龍1池玉杰1馮連榮1，2

(1. 東北林業大學林學院 哈爾濱 150040； 2. 遼寧省楊樹研究所 蓋州 115213)

【目的】 研究白腐菌偏腫革裥菌(Lenzitesgibbosa)所產錳過氧化物酶(MnP)純酶的序列特征、酶學性質及其對染料的脫色能力，為其應用于木質素降解、染料脫色奠定基礎。【方法】 將純化后的樣品經SDS-PAGE檢測后獲得的唯一L.gibbosaMnP條帶切割，采用Nano液相色譜-電噴霧串聯質譜法聯用(Nano LC-ESI-MS/MS)多肽測序技術對蛋白氨基酸序列進行測定。利用該SDS-PAGE圖譜，建立蛋白分子量與遷移率的標準直線，從標準直線上求出MnP純酶樣品的表觀分子量；參照酶活測定方法檢測最適反應溫度及溫度穩定性、最適反應pH值及pH穩定性；采用lineweaver-Burk雙倒數作圖法求解米氏動力學常數Km值。研究L.gibbosa菌種培養液和MnP純酶液對蒽醌類的茜素紅、偶氮類的剛果紅、雜環類的中性紅和三苯基甲烷類的結晶紫等4種不同類型染料的脫色能力。【結果】 串聯質譜掃描出2條MnP的保守序列肽段，與克隆到的基因Lg-mnp1編碼的Lg-MnP1(GenBank登錄號：ACO92620)序列完全吻合，表明其所代表的酶蛋白Lg-MnP1就是唯一電泳帶中主要的蛋白。Lg-MnP1的表觀分子量為45.39 kDa，最適反應溫度為35 ℃，在低于40 ℃的條件下都具有一定的催化能力，但溫度超過50 ℃后迅速失活；其最適反應pH值為3.5，pH超過4.5反應程度就迅速下降，在pH為2～3時最穩定；在以2, 6-DMP為底物時，在21 ℃條件下其米氏常數Km為6.124 mmol·L-1。L.gibbosa培養液對染料在1 h的脫色率分別為茜素紅100%、中性紅22.17%、剛果紅19.09%，對結晶紫的脫色率很低，在36 h脫色率僅為0.018%。純化后的Lg-MnP1溶液對染料的最大脫色率在2 h分別為中性紅100%、剛果紅95.55%、茜素紅75.85%和結晶紫36.57%。【結論】 SDS-PAGE得到的唯一一條電泳帶中的MnP是Lg-MnP1。Lg-MnP1是一種中溫性、偏酸性的酶，與2, 6-DMP的親和力較大。L.gibbosa含有菌絲的培養液對茜素紅具有徹底的降解效果，但Lg-MnP1純酶液對中性紅、剛果紅和結晶紫的降解效率要遠高于同時含有菌絲、漆酶和MnPs的培養液。

偏腫革裥菌； 錳過氧化物酶； 純化； 酶學性質； 染料脫色

白腐真菌分泌的錳過氧化物酶(MnPs)能裂解木質素聚合物、多環芳烴、多氯聯苯等農藥和染料中的側鏈和芳環部分，近年來國內外很多的研究者都進行了白腐菌的酶學性質及MnPs、漆酶等在染料脫色領域的研究(Luetal., 2007; 趙麗紅, 2008; Sietal., 2013)。對MnPs的酶學性質的研究主要集中在對MnP 相對分子量、等電點和米氏常數(Km)的測定；MnP 最適反應溫度及pH 值；MnP 對溫度及pH 值的穩定性(Chengetal., 2007)；Mn2+、Cu2+、Fe3+、Zn2+、Ca2+、Co3+、Mg2+等金屬離子對MnP 穩定性的影響(Caietal., 2010)；不同底物如2,6-二甲氧基苯酚(2,6-DMP)、ABTS [2,2'-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽]、藜蘆醇、愈創木酚對MnP 穩定性的影響(Périéetal., 1996)。每種白腐菌所產的MnPs是有差別的，而且同一種白腐菌也可以產生幾種催化特性不完全相同的MnP同工酶(Steffenetal., 2002)。本試驗在對偏腫革裥菌(Lenzitesgibbosa)分泌的MnPs進行純化、獲得Lg-MnP純酶的基礎上，用SDS-PAGE檢測了MnP表觀分子量，對純化后的酶進行氨基酸序列鑒定與酶學性質研究，并用菌種培養液和純酶對茜素紅、剛果紅、中性紅和結晶紫等4種染料進行了脫色降解研究，以期詳細了解Lg-MnP的性質，以期了解菌種培養物和純酶各自對染料的脫色降解能力及其在木質素降解、染料脫色領域的實際應用奠定酶學基礎。

1 材料與方法

1.1純化后的電泳樣品中氨基酸序列的測定

凝膠過濾柱層析后經濃縮和冷凍干燥的MnP蛋白純化樣品(總MnP活力和比活力分別為43.38 U和33.63 U·mg-1)，經SDS-PAGE后，將獲得的唯一MnP條帶切割，送ProtTech公司采用納米液相色譜-電噴霧電離串聯質譜法聯用(Nano LC-ESI-MS/MS)多肽測序技術進行蛋白氨基酸序列的測定。對從凝膠中回收的唯一條帶中所含有的蛋白質樣品，利用根據測序梯度改良的胰蛋白酶消化后的多肽混合物用LC-ESI-MS/MS 測序系統進行具體分析，這一過程中，高效液相色譜(HPLC)和帶有一個離子捕捉器的質譜儀聯機工作，HPLC中具有一個內徑為75 nm的反相C18毛細管分離柱的測微計，獲得的質譜數據在ProtTech公司軟件中搜索最新的非冗余蛋白序列數據，在得出報告之前還要對數據庫的輸出結果進行手動驗證，更多試驗的細節可參閱www.prottech.com。LC-ESI-MS/MS法的結果是基于獨立的肽段測序，可得到確切存在于樣品中的蛋白質名單，對蛋白質的鑒定有近100%的可靠性，一般情況下由2個或以上的多肽組成的蛋白質可靠性大于99.99%。

1.2SDS-PAGE檢測純化后的MnP蛋白表觀分子量

上述MnP蛋白純化樣品，用SDS-PAGE檢測分子量。計算已知分子量的蛋白質Marker在電泳譜帶圖中的相對遷移率Rf，并和已知分子量作圖，建立標準直線，根據MnP酶液樣品唯一條帶的Rf值，從標準直線上求出MnP純酶的表觀分子量。

1.3MnP酶學性質研究

1.3.1 最適反應溫度及溫度穩定性 參照酶活測定方法：分別向8只1 mL的比色皿中依次加入pH4.5的840 μL 50 mmol·L-1的丙二酸鈉、50 μL 10 mmol·L-1的MnSO4、50 μL 10 mmol·L-1的2, 6-DMP，在15、25、35、45、55、65、75、85 ℃下保溫5 min，再迅速加入50 μL純酶樣品和10 μL 10 mmol·L-1的H2O2，啟動反應，測定MnP酶活，以相同溫度1 mL去離子水作為對照，以溫度為橫坐標，以相對酶活力為縱坐標作圖(以酶活最高者為100%)。在8只1.5 mL離心管中加入0.5 mL酶液，分別在4、10、20、30、40、50、60、70 ℃下保溫1 h，然后在室溫下測酶活，以未保溫酶液的酶活力為100%。

1.3.2 最適反應pH值及pH值穩定性 稱取一定量的丙二酸溶于去離子水中，用NaOH調節pH值使其分別成為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的50 mmol·L-1丙二酸鈉緩沖液，用這些緩沖液替代原來pH4.5的緩沖液后測定酶活力，以pH值為橫坐標，以相對酶活力為縱坐標作圖(以酶活最高者為100%)。在室溫下，將50 μL純酶樣品分別加入到pH值為3、4、5、6、7、8、9的50 mmol·L-1丙二酸鈉緩沖液溶液中1和12 h，分別測定其殘余酶活力，以1 h和12 h的酶活為縱坐標作圖(以在pH4.5中緩沖體系的酶活為100%)。

1.3.3 米氏動力學常數Km值的測定 采用lineweaver-Burk雙倒數作圖法求解Km值：將2, 6-DMP分別配制成5、10、15、20和25 mmol·L-1濃度的溶液，作為底物。在采用不同濃度底物測定酶活的反應體系中室溫保存5 min，再迅速加入50 μL純酶樣品和10 μL 10 mmol·L-1的H2O2，啟動反應，測定A470，以計算酶促反應初速度。以底物濃度的倒數為橫坐標，以酶反應的初速度的倒數為縱坐標，作lineweaver-Burk雙倒數圖，建立標準直線，求解標準直線方程式，再從標準直線方程式導出Km值。

1.4菌種培養液和MnP純酶對4種染料的脫色試驗

1.4.1 4種染料最大吸收峰處的波長值、吸光度A與濃度C標準曲線的繪制 選擇蒽醌類的茜素紅、偶氮類的剛果紅、雜環類的中性紅和三苯基甲烷類的結晶紫4種不同結構類型的染料，分別配制50 mg·L-1的水溶液，用紫外分光光度計在波數300～800 nm區間內掃描，以得到吸收光譜圖，從中查找4種染料最大吸收峰處的吸光值Ao及其對應的波長值λmax，以去離子水為對照。將4種染料分別配制成濃度為0、20、40、60、80、100 mg·L-1的溶液，在各自的最大吸收峰處波數值下測定其吸光度值Ai，以濃度C(mg·L-1)為橫坐標，吸光值Ai為縱坐標，繪制標準直線，得出吸光度值與濃度相互關系的標準方程。

1.4.2L.gibbosa培養液的染料脫色試驗 利用已經優化的培養基與培養條件培養L.gibbosa(張玉龍等，2012)，稱取4種染料各0.07 g，加入100 mL去離子水，滅菌后吸取5 mL加入到已經培養15天的菌種液體培養基中，使各種染料的終濃度為50 mg·L-1。靜止培養脫色，在加入染料后的1 min、1 h、12 h、36 h，或直到達到最大脫色率為止，測定各自染料最大吸收峰波長處的吸光值Ai，根據1.4.1中的標準直線將染料的Ao和Ai值轉化為相應的染料濃度Co和Ci，以不加染料的菌液為對照，計算其脫色率，脫色率(%)=[(Co-Ci)/Co]×100%。

1.4.3 MnP純酶液的染料脫色試驗 純酶降解體系參照酶活測定體系：pH4.5的50 mmol·L-1丙二酸鈉緩沖液840 μL、10 mmol·L-1的MnSO450 μL、10 mmol·L-1的染料樣品50 μL、MnP純酶液50 μL、10 mmol·L-1的H2O210 μL。進行2個對照試驗：對照1是將50 μL酶液用緩沖液替代；對照2是將H2O2用緩沖液替代。上述各反應在比色皿中進行，第1 min、1 h、2 h、3h、4 h測定各染料在各自最大吸收峰處波數值下的吸光值。用1.4.1中的標準直線計算出染料濃度，用1.4.2中的方法計算脫色率。

2 結果與分析

2.1純化后的MnP電泳樣品中氨基酸序列鑒定

送檢樣品為SDS-PAGE得到的唯一電泳條帶，在電泳之前和電泳過程中蛋白質樣品會受到多次干擾而充分變性，并分解成獨立的肽段，測序是從雜亂的多種肽段序列中尋找保守的MnPs等氨基酸序列，ProtTech公司的蛋白氨基酸序列鑒定結果見表1，單一電泳條帶中存在幾種分子量相近的蛋白質肽段，表明純化的MnP樣品中含有多種蛋白。解析出的每種多肽序列數量可用來指示其在蛋白樣品中的相對含量，如一序列被多次掃描就是多次出現的。串聯質譜掃描出2條MnPs的保守序列肽段，1條序列LTFHDAIGISPK的分子量是1 297.70 Da，重復出現25次，為MnP的遠端組氨酸保守區；1條TVPEPFDTVDSILAR的分子量為1 658.85 Da，出現1次，為MnP的芳香環結合位點及其后序列。這2條MnPs肽段與筆者已經克隆到的Lg-mnp1基因編碼的Lg-MnP1(GenBank登錄號：ACO92620)蛋白(閆洪波等， 2014)完全吻合，是L.gibbosa同一個MnP上的序列，在表1的Sequence Header中也明確顯示出來。由于肽段LTFHDAIGISPK數量最多，表明其所代表的錳過氧化物酶蛋白Lg-MnP1就是唯一電泳帶中的主要蛋白。表1最下方顯示1條漆酶的保守序列肽段ANPSFGTTGFAGGINSAILR，分子量為1 950 Da，出現1次，這是真菌漆酶特征性的LoopⅡ及其后面的序列，與筆者已經克隆到的Lg-lac2基因編碼的漆酶Lg-Lac2(GenBank登錄號：AEQ28164)序列完全吻合，在Sequence Header中以gb|ADK13091.1|顯示出來。由于該肽段重復出現次數少，表明其所代表的漆酶蛋白Lg-Lac2是非主要的蛋白。3條LiP的保守序列肽段分別出現1次、3次和3次，都列在同一個LiP下，與Eggert 等(1996)發表的朱紅密孔菌(Pycnoporuscinnabarinus)的LiP保守序列完全吻合，在Sequence Header中以gb|ADK60913.1|顯示出來。其中第1條肽段序列僅比第2條多一個賴氨酸K，其后24個氨基酸序列完全一致，是含有VPEP芳香環結合位點的序列。這3條LiP肽段所代表的LiP蛋白也是非主要的蛋白。由于筆者尚未克隆出完整的L.gibbosalip基因，無法得知LiP蛋白序列，這3條LiP的肽段序列還有待進一步驗證。

表1 蛋白氨基酸序列鑒定結果①Tab.1 The appraisal result of amino acid sequences of different proteins

①* 如果某種肽段被多次測序，就會得到多個掃描號。If certain peptide segments are sequenced multiple times, multiple scan Numbers will be obtained.

2.2Lg-MnP1的表觀分子量

根據純化后MnP樣品SDS-PAGE譜帶圖繪制的蛋白Marker分子量與遷移率的標準直線見圖1，得出直線方程式。電泳圖中純化樣品的遷移率為64.56%，計算出Lg-MnP1的表觀分子量為45.39 kDa，這與大多數文獻報道的MnPs純化后的表觀分子量相當(Schneegaβetal., 1997; Bermeketal., 2004; Caietal., 2010)。電泳帶中主要蛋白Lg-MnP1其一級結構得到的精確分子量為35.94 kDa，與表觀分子量45.39 kDa略有不符，推測原因可能是由于酶蛋白一級序列表達形成三級結構時糖基化而增加了分子量的結果，雖然成熟蛋白在電泳之前和之時三級結構遭到破壞，血紅素輔基可能斷掉，但是連接的糖基化分子可能未斷裂掉。

圖1 標準蛋白分子量標準直線Fig.1 The standard curve of molecular weight of protein marker

2.3Lg-MnP1最適反應溫度和溫度穩定性

圖2A所示為MnP最適反應溫度曲線圖，初期隨溫度的升高酶促反應逐漸升高，在35 ℃時達到最高，之后緩慢下降。適當的高溫能加速酶促反應，但是溫度過高會導致酶活性喪失，從而失去催化能力。圖2B所示為MnP對于溫度的耐受性，表明在低于40 ℃的條件下MnP都具有一定的催化能力，但是溫度超過50 ℃后活力迅速下降直至失活。

2.4Lg-MnP1最適反應pH值和pH穩定性

圖3A和3B表明Lg-MnP1最適反應pH值和不同pH下的穩定性，其最適反應pH值為3.5，超過4.5活性就會迅速下降，其在pH2—3時最穩定。酶的最適反應pH值與底物的基團和參與催化基團的pK值有關，pH會影響底物分子和酶蛋白分子的解離狀態，通常只有一種解離狀態最有利于酶與底物的結合，即在此pH下酶活力最高，過高過低都會影響酶蛋白的構象，甚至導致酶的變性失活。當緩沖液的pH值改變不很大時，酶蛋白雖然不變性，但其活力會受到影響。已有報道MnPs最適反應pH值一般為2～6(Chengetal., 2007)，而Lg-MnP1較適宜偏酸性的環境。

圖2 Lg-MnP1最適反應溫度和溫度穩定性Fig.2 The optimal reaction temperature and thermal stability of Lg-MnP1

圖3 MnP最適反應pH值和在不同pH值下的穩定性Fig.3 The optimal reaction pH value and stability under different pH value of MnP

2.5Lg-MnP1米氏動力學常數Km值

圖4為以底物濃度的倒數為橫坐標，以酶反應的初速度的倒數為縱坐標，獲得的lineweaver-Burk雙倒數圖，獲得的標準直線方程式標注其上，通過該方程式求得的X軸截距倒數的絕對值即為Lg-MnP1以2, 6-DMP為底物的米氏常數，在室溫21 ℃條件下Km=6.124 mmol·L-1，大多數純酶的Km值在0.01～100 mmol·L-1，該Km值表明Lg-MnP1與底物2, 6-DMP的親和力較大。

圖4 Lg-MnP1的lineweaver-Burk雙倒數圖Fig.4 The lineweaver-Burk double bottom figure of Lg-MnP1

2.6染料的脫色降解結果

2.6.1 4種染料吸光度A與濃度C標準曲線 從4種染料最大吸收峰光譜圖查到最大吸收峰處的吸光值Ao及其對應的波長值λmax如下：茜素紅0.700、422 nm；剛果紅1.900、496 nm；中性紅3.615、517 nm；結晶紫3.811、568 nm。4種染料在其最大吸收峰處波數值下吸光度A與濃度C標準直線見圖5A-D。

2.6.2L.gibbosa培養液的染料脫色效果 4種染料濃度隨時間變化曲線見圖6A-C。L.gibbosa含有菌絲體的培養液對茜素紅的脫色率在1 h時就達到了100%；而對中性紅和剛果紅在1 h的脫色率分別為22.17%和19.09%，在36 h的脫色率分別為33.63%和25.09%；對結晶紫的脫色率很低，在36 h脫色率僅為0.018%。

圖5 4種染料最大吸收峰光譜圖和吸光度A與濃度C標準直線Fig.5 The maximum absorption peak spectrogram and Absorbance(A) and Concentration (C) standerd curve of four dyes

圖6 在L.gibbosa培養液內4種染料濃度隨時間的變化曲線Fig.6 The concentration change curve of four dyes with time in the culture fluid of L.gibbosa

2.6.3 Lg-MnP1純酶液的染料脫色效果 Lg-MnP1純酶液對4種染料的脫色降解效果見圖7A-D，可以看出染料濃度一般在2 h內迅速下降，并在之后的時間里趨于穩定。對照1為不加酶液的反應體系，對照2為加酶液不加H2O2的反應體系。由于H2O2對染料同樣具有氧化降解作用，并且它是啟動MnP催化降解反應的因子，試驗組數據減去對照2，就是酶在添加H2O2的情況下減去了酶不添加H2O2時的降解效果，即H2O2的作用；試驗組數據減去對照1，就是減去了H2O2對染料的降解效果，排除掉H2O2對染料降解的干擾作用后，從而反映Lg-MnP1的真實降解能力。數據分析的結果表明，對于中性紅、剛果紅和茜素紅，試驗組數據減去對照1總是比試驗組數據減去對照2的降解效果要好(結晶紫的除外，但二者接近)，說明酶在不添加H2O2時對中性紅、剛果紅和茜素紅也有較強的降解效果，而單獨H2O2對染料降解能力較低。統計Lg-MnP1對4種染料的最大脫色率，在2 h分別為中性紅100.00%、剛果紅95.55%、茜素紅75.85%和結晶紫36.57%；在3 h剛果紅為96.29%，在4 h茜素紅為77.51%、結晶紫為51.82%。前3種染料的最大脫色率都是試驗組數據減去對照1得到的，只有結晶紫是試驗組數據減去對照2的結果。

圖7 Lg-MnP1純酶液對4種染料的脫色降解效果Fig.7 The decoloring effect with time to four dyes of the purified Lg-MnP1 solution

2.6.4L.gibbosa培養液和Lg-MnP1純酶染料脫色效果比較L.gibbosa在木質素條件下能分泌漆酶和MnPs，其液體培養物除了液面液內含有菌絲體外，液內還含有這2種酶。純化后的Lg-MnP1其比活力和蛋白濃度都比培養液高很多，比較培養液和Lg-MnP1純酶對4種染料的脫色效果可知，中性紅、剛果紅和結晶紫，純酶的脫色效果明顯高于同時含有菌絲體、漆酶和MnPs的培養液，而且純酶的脫色時間縮短很多，通常在2 h就達到較高的脫色率。Lg-MnP1純酶對中性紅和剛果紅脫色效果顯著，這與慕慶峰等(2005)報道的白腐菌在Mn2+濃度較高Cu2+濃度較低的條件下對剛果紅脫色效果顯著相一致，推測L.gibbosaMnP對剛果紅的降解可能強于漆酶所起的作用，并且依賴于較高濃度Mn2+的存在。而對于茜素紅，培養液的脫色效果高于純酶，在1 h時就達到了100%，推測菌絲體或漆酶對茜素紅有較強的吸附脫色作用和酶促降解作用。

3 討論

本試驗氨基酸測序結果表明，SDS-PAGE電泳的唯一條帶雖然不是純一的蛋白肽段，但其中多數屬于同一個MnP蛋白，表明L.gibbosa的MnP已得到基本純化。Lg-MnP1純酶在4～40 ℃之間均有良好的催化穩定性，筆者的跟蹤檢測也表明該純酶在4 ℃時保存1個月后依然具有催化活性。純酶的脫色效率高，需要H2O2的協助。在氨基酸測序結果中發現了3條LiP氨基酸保守序列，與朱紅密孔菌L.gibbosa能夠分泌LiP，P.cinnabarinus的LiP氨基酸保守序列類似，說明L.gibbosa在液體培養條件下不但有MnPs和漆酶產生，也有少量的LiP產生，但是酶活檢測都沒有檢測到LiP活性。LiP活性沒有檢測到，推測原因一是表達量可能很低；二是測定方法可能還需改進。酶活性的測定通常以這種酶能夠作用的某種特異性底物來衡量，測定LiP的底物藜蘆醇為3，4-二甲氧基苯甲醇，是具有芳香結構的有機化合物之一，用這種底物可能即使酶液里有微量的LiP，也不容易測定出來。筆者已克隆到一個疑似LiP的基因片段(閆洪波等， 2014)，但由于尚未得到全長，還無法確定與在氨基酸測序結果中發現的LiP氨基酸保守序列的關系。在蟲擬蠟菌(Ceriporiopsissubvermispora)等白腐菌中，也發現了在培養液中沒有檢測到LiP活性，卻克隆到LiP基因的現象(Rajakumaretal., 1996)。

4 結論

SDS-PAGE得到的唯一一條電泳帶中的MnP是Lg-MnP1。Lg-MnP1是一種中溫性、偏酸性的酶，與2, 6-DMP的親和力較大。L.gibbosa含菌絲的培養液對茜素紅具有徹底的降解效果，但Lg-MnP1純酶液對中性紅、剛果紅和結晶紫的降解效率要遠高于同時含有菌絲、漆酶和MnPs的培養液。

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(責任編輯 王艷娜)

本刊顧問張齊生先生逝世

世界著名木材加工和人造板工藝學專家、中國和世界竹材加工利用領域的開拓者、中國工程院院士、《林業科學》第十屆編委會顧問張齊生教授，因病醫治無效，于2017年9月25日上午9：43分在南京逝世，享年78歲。

張齊生先生曾任林業部第三、四屆科技委員、中國工程院農業學部副主任、中國工程院科學道德委員會委員、國家林業局專家咨詢委員會會員、中國竹產業協會副會長等職務。他長期從事木材加工與人造板工藝以及生物質能源多聯產技術的研究工作，在國內外學術界享有盛譽。他治學嚴謹、敏于思考、勤于實踐、善于創新，始終站在學術前沿，圍繞國家重大需求開展研究，在工程技術和推廣應用方面卓有建樹。他首次將竹子大規模引入工業化利用領域，推動了我國竹材加工產業的形成和發展，使我國竹材加工業居世界領先地位，為竹材加工利用事業做出了創造性的貢獻。他與時俱進、開拓創新，在“農林生物質氣化多聯產”核心技術、關鍵設備等方面取得了重大突破，為我國低碳經濟發展做出了積極貢獻。

張齊生院士的不幸逝世是中國林業科教事業的巨大損失，也是《林業科學》的巨大損失。他關心期刊工作，審稿認真負責，為期刊發展付出了心血和汗水，帶領團隊在《林業科學》發表多篇文章，深受廣大作者和編輯人員的尊重和愛戴。張齊生院士潛心科研、不斷創新的治學精神，身體力行、誨人不倦的為師風范，愛黨愛國、甘當春蠶的崇高品德，積極向上、樂觀豁達的人生態度，將激勵我們努力工作，為提高《林業科學》辦刊水平、促進林業科技繁榮而努力奮斗。

張齊生院士永遠活在我們心中！

本刊編輯部

EnzymologyCharacteristicsandDyeDecolorizationofManganesePeroxidasefromLenzitesgibbosa

Zhang Yulong1Chi Yujie1Feng Lianrong1, 2

(1.SchoolofForestry，NortheastForestryUniversityHarbin150040; 2.ThePoplarInstituteofLiaoningProvinceGaizhou115213)

【Objective】 In order to get a clear picture of the sequence signature, characteristics, and decolorizing ability to four types of dyes of the purified manganese peroxidase (MnP) produced by white-rot basidiomyceteLenzitesgibbosastrain CB-1.【Method】 A single MnP protein band detected in the SDS-PAGE electrophoresis of the purified sample was cut and sequenced by Nano LC-ESI-MS/MS peptide sequencing technology. The characteristics of the purified MnP were studied, the apparent molecular weight of the purified MnP was calculated by the standard curve of protein molecular weight and mobility according to SDA-PAGE pattern, the optimal reaction temperature and thermal stability, the optimal reaction pH and pH stability were determined by enzymatic activity measuringmethod , Michaelis-constantKmwas solved by lineweaver-Burk double bottom figure. The decolorization ability of culture fluid and purified MnP ofL.gibbosato four types s of dyes, namely, alizarin red, neutral red, congo red, and crystal violet were studied, respectively.【Result】 Two conserved amino acid sequences of MnP scanned by Tandem MS perfectly match with Lg-MnP1 (GenBank Accession No. ACO92620) sequence, indicating that Lg-MnP1 represented by two conserved peptides is the main protein in the only electrophoresis band. The apparent molecular weight of Lg-MnP1 is 45.39 kDa. Its optimal reaction temperature is about 35 ℃, it has some catalytic ability and stability during 40 ℃ but rapidly becomes inactivated beyond 50 ℃. Its optimal reaction pH value is 3.5, its catakytic activity rapidly decreases when pH value is above 4.5, and it is the most stable in pH 2-3 when it is kept for more than 10 hours. Its Michaelis-constantKmis 6.124 mmol·L-1at 21 ℃ with 2,6-DMP as substrate. The decolorization percent of culture fluid is 100% to alizarin, 22.17% to neutral red, and 19.09% to congo red at 1 h, respectively, but low to crystal violet and only 0.018% at 36 h, whereas that of the purified Lg-MnP1 solution at 2 h is 100% to neutral red, 95.55% to congo red, 75.85% to alizarin, and 36.57% to crystal violet.【Conclusion】 The MnP in the only band of SDS-PAGE is Lg-MnP1. Lg-MnP1 is a mesophile and partial acidic enzyme and with higher affinity to 2,6-DMP. The culture fluid with mycylia ofL.gibbosahas a thoroughly decolorizing ability to anthraquinone dye, while the purified Lg-MnP1 has a higher decolorizing efficiency to neutral red, congo red, and crystal violet than the culture fluid with mycylia, laccases and MnPs.

Lenzitesgibbosa； manganese peroxidases(MnPs)； purification； characteristics in enzymology； dye decoloring

S718.81

A

1001-7488(2017)09-0073-08

10.11707/j.1001-7488.20170909

2016-06-07；

2016-11-10。

東北林業大學博士研究生自主創新基金項目(2572016AA04)；黑龍江省自然科學基金項目(C2016006)。

*池玉杰為通訊作者。