一種快速提取質粒DNA的方法

●許朋 余蘭 馮昆

一種快速提取質粒DNA的方法

●許朋1余蘭1馮昆2

分子生物學技術發展迅猛，提取質粒DNA方法向著高通量、快速高效、廣泛適用的方向發展。本實驗采用二氧化硅修飾的磁珠設計了一種快速分離質粒DNA的試劑盒，并設計了多種引物，探索同一質粒DNA對兩對引物，同一基因組DNA對兩對引物進行PCR驗證。結果表明：含磁性磁珠的試劑盒能夠在10min內完成提取，產量較高；且樣品對PCR無抑制作用，并適用于多種樣品，應用此方法提取的DNA還可用于多重PCR。

提取；質粒

質粒是獨立于染色體外并以超螺旋狀態于細菌和酵母等多種生物中的環狀的DNA分子。也是基因工程主要載體，在醫學領域、分子生物學領域、免疫檢驗領域具有廣泛的應用。堿裂解法、酚裂解法、煮沸法是傳統的提取質粒DNA的方法，但傳統的方法中使用了有多種有毒試劑、提取效率不穩定、步驟繁瑣而且耗時長[6]。

隨后發展了陰離子交換層析、疏水層析法和凝膠層析等方法，但是耗時且昂貴，不易實現自動化。因此尋求一種穩定、高效、高通量、安全環保、自動化DNA提取方法越來越重要。

隨著納米技術的發展，磁性納米微球近幾年來成為分子生物學領域矚目的新星，其表面可以被多種活性基團包被修飾，表面積大，在磁場下的超順磁作用等使得其應用廣泛[9]。本實驗針對質粒DNA的提取，探索采用二氧化硅包被的磁性磁珠，在傳統的試劑盒原理上，通過提取體系的優化，探索并設計多種引物用于PCR驗證并適用，建立了高效、快速、安全、普適的質粒DNA提取方法，為質粒的提取分離純化提供進一步的依據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌種：大腸桿菌的質粒pEGFP-N1來自實驗室自存

1.2 實驗試劑：鹽酸胍、Rnase酶、胰蛋白胨、檸檬酸鈉、乙酸鉀、β一巰基乙醇、羧芐青霉素、吐溫-20、無水乙醇、異丙醇、Tris堿、硼酸、酵母浸出液、溴化乙錠，LIris—HCl、RNase A、SDS、NaOH、KAc、乙醇、乙二胺四乙酸(EDTA)

1.3 實驗儀器：微型分光光度計Nanodrop ND—2000、凝膠成像系統、混合反應器、磁性分離架、恒溫電熱股風干燥箱、酸度計、水平電泳儀、PCR擴增儀、漩渦混合器、電熱恒溫振蕩水槽、臺式高速離心機

1.4 實驗方法

1.4.1 質粒DNA提取

1）選取單菌落在3mL LB培養液（pH 7.0-7.2，0.5%酵母浸出液、1%胰蛋白胨、1%氯化鈉）中并振蕩過夜，用1.5ml在離心管集細菌培養液，于室溫以12000rpm離心30s后，棄上清[1,4]。

2)細菌裂解：將細胞沉淀懸于100μL菌體懸浮液(10mmol/L EDTA，50mmol/LIris—HCl(pH 7.5)，50mg/m1RNase A)中，劇烈振蕩使之充分混勻。接著加入150μL裂解液(裂解液：1%SDS、0.2mol/L NaOH)連續數次上下來回顛倒至澄清狀溶液，于樣品裂解液中加入300μL吸附液I(100mMTris 50mMEDTA，0.1M K+，4.2M鹽酸胍，0.25MNa+，1/10V異丙醇，pH5.10）連續上下來回顛倒試管至混合均勻于室溫12000rpm離心3min[5]；

3）吸附：吸取上清液置于潔凈離心管內，取適量磁性納米微球加入，上下來回5—10次顛倒試管充分混合使核酸吸附；

4）洗滌：磁性分離架上放上離心管，施加外磁場，在接近磁場一側將吸附DNA的磁性微球富集從而分離出原溶液，加入70%的乙醇500μl，反復2次洗滌將染色體DNA和蛋白質等雜質除去；

5）洗脫：靜置于2～3分鐘將乙醇揮發，加入洗脫液100μL（0．5mmolEDTA、10mmolTris、pH=8.0）連續上下反復吹打沉淀將微球懸浮充分后置于室溫3min洗脫DNA，得到純化后的質粒DNA。

1.4.2 基因組DNA提取

100μL肺組織于試管，加入10μL混合酶工作液（10～40mg/mL的蛋白酶K，10～40mg/mL的溶菌酶），56℃水浴5min；加入750μL裂解液（Gu-Hcl的濃度為 3～8mol/L，Tris-Hcl的濃度為 10～30mmol/L，EDTA的濃度為1～10mmol/L、異丙醇的體積比為1/2～1/6，SDS為0.1～0.5%，Triton-100為0.5～2%，β-巰基乙醇為0.5～2%，Nacl的濃度為800mmol/L，pH6.8的檸檬酸鈉濃度為200mmol/L）以及磁性納米微球，連續5-10次上下來回顛倒試管以充分混合，置室溫3min后將上清用磁分離架分離棄去；用800μL洗滌液（800mmol/LLicl，100mmol/LNacl，50mmol/LMOPS，乙醇的體積比為60%，其中乙醇的pH=7.0）洗2次，分離磁珠棄上清；用1000μL漂洗液（70%乙醇）漂洗2次再次分離磁珠棄上清；室溫放置3min，揮干乙醇，加入100μL洗脫液（0.5mmol/LEDTA，10mmol/LTris-Hcl，其中Tris-Hcl的pH=8.0）上下吹打沉淀，充分將微球懸浮，靜置室溫3min，得到純化后的基因組DNA。

1.4.3 瓊脂糖凝膠電泳

瓊脂糖0.4g于錐形瓶，加50ml l× TBE，加熱使瓊脂糖溶解，取出后置冷，加入3μL EB，混勻，排氣泡倒入模具中并插入樣品梳，冷卻凝固撤梳子，將凝膠放入電泳槽中。將得到的樣品提取液取5μL與lμL Loading buffer混勻后，分別加入點樣孔中。另外取3μl marker，加入點樣孔中。打開電源，調節電壓為110V，電泳30min。30min后，取出凝膠，拍照[2,3,7,8]。

1.4.4 PCR

1.4.4.1 PCR引物：Forward Primer CTGGACACTTGGACATGGTCA

Reverse Primer CATAGCCAGAATTGAAGCCCA

Forward Primer AGTCACCACGGTTCATGGAAA

Reverse Primer CATGCTGGCTCCAGTATAATTGA

1.4.4.2 PCR體系：體系如下表1（：以25μl為例）

表1 25μlPCR體系

1.4.4.3 PCR反應條件：三步法PCR，98℃ 10 sec.，60℃ ＊ 30 sec.，72℃ 1 min，30個循環，擴增產物用1%的瓊脂凝膠電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 質粒DNA的電泳檢測結果

利用該磁性磁珠試劑盒提取質粒DNA結果如圖1所示，結果顯示，該方法提取的質粒DNA條帶明顯，純度高，條帶顯示清晰，即無蛋白質和RNA污染，該方法純化所得質粒DNA可用于酶切、PCR等實驗。

2.2 同一質粒DNA對兩對引物

為了檢驗樣品純度以及對PCR的作用。將同一樣品應用于兩對引物進行PCR驗證。由圖2、3，結果表明，提取的質粒DNA對于引物一、引物二都能夠擴增。引物一擴增后的條帶大小在100-250bp。引物二擴增后的條帶大小在400-500bp之間。同一樣品用不同引物均能擴增出來，表明該提取方法得到的產物，無PCR抑制作用，適用廣泛。

2.3 同一基因組DNA對兩對引物

利用磁性磁珠法提取的基因組DNA用于PCR擴增，由圖4得到，不同引物均能成功地擴增，擴增條帶大小400-500bb，且清晰可見。此結果表明，該磁珠提取法提取的基因組DNA對于PCR無抑制作用。

3 討論

蛋白質、細胞、多肽以及核酸等生物分子的分離、純化、精制在醫學領域和生物學領域的應用尤為重要，分離純化技術的發展直接影響著生物學的發展水平。本實驗所設計的磁性磁珠法質粒DNA提取試劑盒與目前市售的多種質粒DNA提取試劑盒相比較，能夠解決目前存在的耗時長、試劑毒性大、產率不穩定等問題，再將其比較硅膠膜離心柱及同類型磁性分離試劑盒，有如下的特點：首先，操作簡便，提取高效，實驗在一個離心管內操作完成，減少了相互污染，減少了產物丟失，所得質粒DNA產物純度高，無RNA以及蛋白質污染，產物可應用于各種分子生物學實驗。其次，耗時短，能夠在室溫10min內完成提取，不使用有毒試劑，操作流程簡略、易于實現自動化、安全化。第三，價格低廉，實驗儀器簡單，試劑均為國產，且磁性磁珠為實驗室合成，緩沖液自己設計。第四，本試劑盒對多種樣品均適用，且多種樣品對于兩種引物無PCR抑制，適用廣泛。

（作者單位：1遵義醫學院,2遵義醫學院珠海校區,珠海市中藥基礎及應用研究重點實驗室）

[1]郭旭東,毛舒燕,侯冬霞,旭日干.一種快速提取質粒DNA用于鑒別重組克隆的方法[J].生物工程學報,2007,(01)：176-178.

[2]張怡,劉坤,曹鵬,魏森,韋丹丹,杜建,李鵬坤,李成偉.一種快速高效提取酵母質粒的方法[J].食品與生物技術學報,2013,32(11)：1194-1198.

[3]何冬蘭,余金龍,邵坤彥,邵潔云.一種快速提取質粒DNA鑒別重組克隆的方法[J].中南民族大學學報(自然科學版),2011,30(01)：37-38.

[4]王建安,劉延娜,司華新,楚雍烈,范桂香.一種快速、簡便的質粒DNA提取方法[J].西安醫科大學學報(中文版),1995,(04)：363.

[5]張素娥,張瀟月,劉輝,張顯忠.CTAB法提取質粒DNA的探討[J].泰山醫學院學報,2017,38(03)：287-289.

[6]熊福銀,林艷麗,吳曉潔,周艷榮,鄧繼先,陳紅星.一種快速、有效、經濟的提取酵母質粒的方法[J].生物技術通訊,2009,20(03)：386-387.

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[9]單志.多功能納米磁性粒子的合成及其在細胞富集和質粒DNA純化中的應用研究[D].成都：四川農業大學,2010.

A Rapid Method for Preparation of Plasmid DNA

XuPeng1YuLan1＊FengKun2＊
1.Zunyi Medical College, Zunyi, 563000 2.Zhuhai Campus of Zunyi Medical College Zhuhai Key Laboratory of Fundamental and Applied Research of Traditional Chinese Medicines, Zhuhai, 519000

the fast development of molecular biology techniques, the method of extraction of plasmid DNA toward high flux are widely used in the direction of development and efficiently This experiment adopts the silicon dioxide modified magnetic beads to design a kind of quick separation of plasmid DNA kit, and designed a variety of primers, explore the same plasmid DNA of two pairs of primers, the same genome DNA of two pairs of primers for PCR test results show that the kits containing magnetic beads can finish extracted in 10 min, yield is higher; The sample has no inhibitory effect on PCR and is applicable to multiple samples. The DNA extracted from this method can also be used in multiple PCR.

extraction; plasmid

余蘭 馮昆

許朋，男，研究生；余蘭，女，博士，碩士生導師，研究方向為天然產物分離純化及其活性研究；馮昆，男，博士，碩士生導師，研究方向為微生物與生化藥學。