人微血管內皮細胞不同濃度的siRNA轉染效果的實驗觀察

●蔡飛 高冬

人微血管內皮細胞不同濃度的siRNA轉染效果的實驗觀察

●蔡飛 高冬

目的：觀察不同濃度siRNA對人微血管內皮細胞HMEC-1細胞轉染效果的影響，優化HMEC-1細胞的轉染方法和siRNA用量。方法：HMEC-1細胞采用相同的細胞量接種處理后，熒光標記的siRNA（FAM-siRNA）隨機分為高中低濃度及對照四個組，然后運用Lipofectamine?2000 Reagent轉染試劑進行轉染，培養48h后熒光顯微鏡觀察轉染的效果。結果：中高濃度siRNA轉染效果較低濃度組好，且中高濃度轉染效果相同。結論：中濃度siRNA更適合HMEC-1細胞的轉染。

siRNA；HMEC-1細胞；轉染

siRNA是一種小RNA分子(約21-25核苷酸)，由RNAase Ⅲ家族中對雙鏈RNA具有特異性的酶加工而成，它能夠激發與之互補的目標mRNA的沉默。轉染又是指將外源分子導入真核細胞的技術，隨著實驗技術的發展RNA干擾技術已被廣泛的應用于基因功能、基因治療、信號轉導等方面的研究中[1]。由于不同濃度siRNA對于不同細胞的轉染效果表現不一致，而很多實驗都是以siRNA參考用量為標準，故為了優化實驗方法及siRNA的用量，本實驗通過觀察不同濃度FAM-siRNA對HMEC-1細胞轉染效果的影響，為HMEC-1細胞的相關轉染提供一個實驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人微血管內皮細胞（human microvascular endothelial cells，HMEC-1）由本實驗室培養并保存，胎牛血清（美國Gibco公司），MCDB-131細胞培養基（美國Sigma公司），opti-MEM培養基（美國Gibco公司）倒置熒光顯微鏡（德國Leica公司），Lipofectamine? 2000 Reagent轉染試劑（上海吉瑪），FAM標記陰性對照siRNA（上海吉瑪）。

1.2 細胞培養與分組

1.2.1 細胞培養

HMEC-1細胞采用MCDB-131培養液（含10ng/mL EGF、1μg/mL氫化可的松，10%FBS）于5%CO2，37℃常規培養。

1.2.2 細胞接種

取對數生長期的細胞，胰酶消化收集，制成單細胞懸液，以3×104個/孔接種于24孔板上，分為4組每組3個副孔，37.5℃，5%CO2培養箱中培養過夜。

1.3 細胞的分組及siRNA轉染(以100nm/孔為例)

1.3.1 細胞分組

將種有細胞的24孔板分為4組∶高濃度組（100nm）、中濃度組（50nm）、低濃度組（20nm）、對照組（0nm）。

1.3.2 細胞的轉染

次日各孔更換新完全培養基，0.5ml/孔。取FAM標記陰性對照siRNA（FAM-siRNA）100nm+opti培養基50ul，吹打均勻，室溫放置5min；取轉染試劑（lipo2000）1ul+opti培養基50ul吹打混勻，室溫放置5min；將上述二者混勻后制成轉染復合液，室溫放置20min后，將轉染復合液100ul加入細胞中，輕搖混勻，37.5℃，5%CO2培養箱中培養6h后，更換為MCDB-131 培養液，48h后熒光倒置顯微鏡觀察拍照。

2 結果

HMEC-1細胞通過不同濃度FAM-siRNA轉染48H后，根據肉眼觀察圖片的熒光強度及細胞轉染數表示其轉染的效果。如圖1所示高中低濃度與對照組相比都具有明顯的差異，中高濃度與低濃度對比同樣具有顯著差異，而中高濃度相比未見明顯差異。提示中高濃度siRNA轉染內皮細胞HMEC-1效果更好。

3 討論

圖1 不同濃度siRNA對HMEC-1轉染48h效果

RNA干擾技術（RNA interference technlolgy）能夠利用雙鏈RNA特異性地降解具有同源序列的mRNA，阻斷相應基因的表達。隨著RNA干擾技術的不斷發展，為腫瘤治療問題的解決提供可能[2]。而本實驗為了優化轉染的方法及siRNA 的用量，通過運用不同濃度siRNA對HMEC-1細胞進行轉染，發現低濃度siRNA轉染后與高中濃度相比較轉染細胞的數量相差明顯，而中高濃度的siRNA對于HMEC-1細胞的轉染效果更好，其中中濃度的siRNA在轉染細胞數量及試劑用量上都較為適合，與眾多實驗的用量一致，這可能是由于高濃度與中濃度轉染效果一致，而siRNA的使用量上相差較大，故從節約試劑考慮，大部分實驗都是采用中濃度siRNA進行轉染。本實驗對比了高中低濃度siRNA對內皮細胞HMEC-1進行轉染的效果，優化了實驗的方法及siRNA的用量，為內皮細胞相關siRNA轉染提供一定的參考價值，但是是否適用于所有細胞還需要進一步研究。

（作者單位：福建中醫藥大學中西醫結合學院）

[1]張良鵬，吳小娟，湯紹輝．RNA干擾與肝細胞癌治療［J］．廣東醫學,2012,33(6):870-872.

[2]歐陽金生，陳成水，李玉蘋，等.SiRNA CD31沉默PECAM-1對鼠源血管內皮瘤細胞VEGF表達的影響[J].中國腫瘤生物治療雜志，2014，21（2）：160-164.