替代方法在化妝品檢測中的應用分析

程樹軍，秦 瑤，柯逸暉,，陳志杰，黃健聰

(1.廣東檢驗檢疫技術中心，廣州 510642； 2.廣州市華代生物科技有限公司，廣州 510535)

研究進展

替代方法在化妝品檢測中的應用分析

程樹軍1，秦 瑤2，柯逸暉1,2，陳志杰2，黃健聰2

(1.廣東檢驗檢疫技術中心，廣州 510642； 2.廣州市華代生物科技有限公司，廣州 510535)

體外方法是不可缺少的生物學檢測與研究工具，已普遍用于化妝品法規性測試、生物學機制研究和功效性原料的篩查。體外方法包括法規認可和列入標準測試指南的替代方法，用于風險評估和毒性預測的非生物測試方法，以及大量多元和個性化的方法。這些方法可用于產品監管、原料篩查、配方優化、組合測試和定制化評估，覆蓋化妝品質量和安全評價的整個過程。隨著全行業共識的形成和應用經驗的積累，建立在檢測標準基礎上的方法創新和優化將不斷涌現，這些技術將支撐行業的健康發展，有助于提高競爭力和開發適應消費者需求的產品。

替代方法；化妝品；體外；應用

生物醫學研究和應用中動物實驗的減少(reduction)、優化(refinement)和代替(replacement)的3R原則提出60多年來已逐漸得到普及并成為共識，技術人員也愿意關注實驗動物的福利倫理并主動實踐減少和優化的2R原則。但以不使用動物為核心的1R原則由于投入和研發時間長難度大一直以來進展緩慢。進入21世紀后，現代生物技術的飛速發展推動毒理學測試走向現代化，代替動物實驗的1R原則進入快速軌道。歐盟關于化妝品動物實驗禁令的實施和化學品REACH法規的影響，以及之后越來越多的國家將替代動物實驗列為化妝品法規，推動了替代技術的監管認可[1]。近年來，以美國為首推行的“21世紀毒性測試觀念與遠景”，使得大量體外新技術從基礎研究轉化為體外方法應用于皮膚生物學和化妝品領域[2]。

1 非動物檢測方法分類

凡是利用無知覺材料(如計算機模型、體外細胞、重建組織、離體器官、低等生物等)替代活體哺乳動物的安全性與功效性的測試都可稱為體外方法(invitromethods)，經過嚴格驗證并被法規接受，用于取代毒理學動物實驗的體外方法可稱為絕對“替代方法”。根據實驗系統和適用范圍的不同，體外方法可分為三類。

1.1非測試方法

非測試方法(non-testing methods)又稱為“硅片方法” (in silico methods)，廣義是指任何基于計算機開發的預測方法。基于計算機的強大功能，很多毒性測試與功效評估的計算機方法被開發出來，用于預測化合物對人體健康和環境的影響，例如定量構效關系(structure-activity relationship)，分類法(grouping approaches)，交叉參照(read-across)、毒理學閾值(threshold of toxicological concern，TTC)和專家系統(expert systems)等。這些方法在經濟合作與發展組織(OECD)，歐盟、美國和日本等國家和地區發展較快，例如已經有不少QSAR模型和工具應用到化妝品毒理學安全性評估中，例如，OECD QSAR Toolbox、Toxtree、CAESAR、TEST及HESS等，毒性終點涉及經皮吸收、皮膚刺激、眼刺激、皮膚致敏、急性毒性、重復劑量染毒、生殖發育、遺傳和致癌等。歐盟消費者委員會(SCCS)認為針對化妝品雜質以及含量極小的化妝品原料安全性評估，可以使用TTC方法。在工業化學品領域，交叉參照已經被多個國家的管理機構所接受[3]，也被我國新化學物質申報登記指南所認可。我國國家食品藥品監督管理總局(CFDA)發布的《化妝品新原料申報與審評指南》中也提到：可以根據該原料理化特性、定量構效關系、毒理學資料、臨床研究、人群流行病學調查以及類似化合物的毒性等資料情況，增加或減免試驗項目?？偟膩碚f，中國化妝品非測試方法的認識剛起步，開發和應用與國外都還存在一定的差距，還需要更多的經驗積累和借鑒。

1.2替代方法

狹義的替代方法或稱之為“絕對替代”方法，是指經過科學驗證程序證明其相關性和可靠性，用于替代傳統動物實驗并被監管機構所認可的體外方法。因此，替代方法的結果應當與預期回答的毒性終點之間建立預測關系，即體外實驗獲得的數據與體內有害效應之間建立預測模型。如體外細胞毒性預測嚙齒類動物的急性經口毒性，在細胞活性的半數抑制濃度(IC50)與動物半數致死劑量(LD50)間建立線性關系；基于3D表皮模型的皮膚刺激方法把細胞活性與體內刺激評分建立判定關系；皮膚致敏的細胞實驗把免疫細胞表面標志物(CD86和CD54)的表達與致敏評分建立相關關系等[1,2]。替代方法驗證工作始于上世紀90年代，官方的驗證機構如歐洲替代方法參考實驗室(EURL -ECVAM)、美國替代方法多部門協調驗證中心(ICCVAM)和日本替代方法驗證中心(JaCVAM)，完成驗證的毒性測試替代方法已超過50項。

1.3體外方法

廣義的體外方法既包括符合法規要求的替代方法，還包括大量應用于化妝品原料和產品安全性或功效性測試的非動物和非臨床測試方法。體外方法由體外實驗系統、實驗過程、指標及檢測方法、結果和統計方法(預測模型)等4個基本要素組成，還包括實驗原理、適用范圍等界定方法應用領域的因素。如美白劑的組合測試方案包括了酪氨酸酶抑制、B16或人黑色素細胞生成抑制、角質細胞攝取試驗、斑馬魚測試等多個體外方法，抗光老化功效的體外測試組合包括酯酶抑制方法，成纖維細胞光老化測試和三維重建皮膚模型的方法等[2]。這類方法緊跟皮膚生物學的發展，且與檢測技術與裝備的進步密切相關，因而新技術不斷涌現、個性化方案很多，為產品的宣稱提供數據支持。

2 替代方法在化妝品檢測中的應用情況

首個法規認可的替代方法是OECD 2004年發布的指南432，即3T3中性紅攝取光毒性試驗(in vitro 3T3 neutral red uptake phototoxicity test, 3T3 NRU PT)，目前列入指南的替代方法已經超過20項。我國接受替代方法成為國家標準和檢驗檢疫行業標準(SN)始于2006年，累計發布標準約30項，國家CFDA在2016年10月吸收列入《化妝品安全技術規范》的首個替代方法是3T3 NRUPT。截止目前，OECD先后發布的替代方法已覆蓋皮膚吸收、光毒性、眼刺激、皮膚刺激、皮膚致敏、遺傳毒性、內分泌干擾等毒性終點。目前國內常用的化妝品評測的體外方法見表1[2]。

表1 目前可用的體外方法

注：OECD:經濟合作和發展組織；GB:國家標準；SN:檢驗檢疫行業標準。

Note.OECD: Organization for Economic Cooperation and Development；GB: National Standard；SN:Indutry standard.

近年來，替代方法的發展呈現以下幾個趨勢。一是研發重點轉向更復雜的毒理學領域，如皮膚致敏、肝臟毒性、生殖發育毒性和內分泌干擾等，如2016年發布的DPRA、h-CLAT。二是整合評估策略(integrated assessment testing approach, IATA)的開發，嘗試把單一的方法合理科學地組合使用,如眼刺激、皮膚刺激和皮膚致敏的IATA處于指南形成的不同階段。整合策略不僅考慮了現行有效的方法，還加入了QSAR、理化信息、人群暴露等[4]。三是替代方法開發與毒理學新理論緊密結合，研發效率和導向性顯著提高，如有害結局通路(adverse outcome pathway, AOP)原則的運用，出現了大量新發現和新方法[5]；四是與風險評估結合，基于大數據的分析，建立從體外數據直接預測人體風險的模型。

3 替代方法在化妝品體外測試中的具體應用分析

3.1原料和成品安全性測試

法規認可的替代方法主要以代替動物實驗為目的，替代方法的預測模型、驗證指標和判定依據多以動物實驗數據為金標準，因此替代方法用于預測人類健康風險的準確性等于或優于動物實驗。這些標準化的測試指南可用于化學品的分類/標識、產品安全性測試和上市監管。而且體外方法使傳統以形態學觀察為主的半定量動物實驗走向以量化參數為主的生物學測試，不僅提高了測試通量，而且測試結果更為客觀和具有可比性[6]。如秦瑤等分別用CAMVA方法和BCOP方法檢測了60種化妝品的眼刺激性，結果顯示CAMVA方法的特異性(陰性結果的預測率)為97.6%，敏感性(陽性結果的預測率)為100%，準確性達到98.3%。BCOP方法的敏感性為100%，特異性為83.3%，準確性達到85%[7]。表明替代方法可用于產品上市的監管，但不同方法的原理和適用范圍存在差異，例如與CAMVA方法相比，BCOP方法對于輕度到嚴重刺激性之間的預測不夠精確[6-8]。

3.2產品制造過程測試

利用替代方法比較精確和可以定量的優點，可將其用于化妝品原料篩查。如對于同一原料的不同供應商或不同批次可能由于雜質、工藝或其它未知因素的影響造成某些毒性作用程度的不一致，利用替代方法的測試結果可為優先選擇原料提供幫助，如可用短期暴露細胞實驗篩選刺激性溫和的表面活性劑[9]，用BCOP方法可篩選不同批次的原料供應商[10]。同樣，替代方法提供的多個檢測參數為產品改進提供了線索，例如BCOP方法中，獲得不同配方的濁度值、OD值和體外評分，對于數據比較高的配方，可通過降低某種物質的含量、去除某個成份或改變配合比例對配方進行優化，確定最溫和的產品。對于刺激-劑量效應關系的原料，還可以通過反復測試確定原料或成份在終產品中的安全濃度[10]。

3.3用于特殊人群和溫和產品的測試

基于不同原理開發的替代方法提供了量化的數據和多種方法的組合，通過對測試數據的挖掘可滿足企業個性化的需求。例如BCOP方法對于體外評分小于3的產品判定為無刺激性[8]，CAMVA方法對于EC50少于3%的產品判定為無刺激性，重建三維表皮模型實驗對于無刺激性的判定標準為組織活性大于50%[2]。通常認為優于臨界值的數據其產品越溫和，溫和產品符合特殊人群產品的需求，如嬰童、女性、老人等，這些產品以低刺激性或溫和為追求目標。具體測試時可選標準方法，也可用改進方案或組合方案。例如可以把溫和產品刺激性的建議簡單設定為BCOP體外評分在1以下，CAMVA的EC50大于70%，皮膚模型的組織活性大于80%等。

3.4整合策略的使用

鑒于單一替代方法的不足，應當采用整合策略組合不同方法獲得毒理學全面評估，組合方法的選擇不僅要考慮方法的科學性和局限性，還要綜合考慮方法的可用性、成本、技術難度等。組合模式也有多種方案，使用時可參考OECD發布的IATA指南[4]。常用的替代方法組合見表2。例如眼刺激的自下而上和自下而上方案均以BCOP為重要方法[11]，研究表明采用CAMVA-BCOP的組合方法預測產品的眼刺激性敏感性為100%，特異性為97.6%，準確性達到98.3%，優于單一方法[7]。另外，對于復雜的毒性終點，也建議采用組合模型，以避免單一方法覆蓋機制不全的局限，例如，可把導致皮膚致敏發生的AOP不同階段開發的替代方法組合起來，提高預測的準確性[12，13]。把檢測胚胎發育不同階段的胚胎干細胞試驗、全胚胎試驗和斑馬魚實驗組合起來，預測化合物的胚胎毒性。組合方案也多用于化妝品功效原料的篩查，如美白劑的整合測試策略組合了酪氨酸酶抑制、B16或人黑色素細胞生成抑制、角質細胞攝取試驗、斑馬魚測試等多個體外方法，抗光老化功效的體外測試組合包括酯酶抑制方法，成纖維細胞光老化測試和三維重建皮膚模型的方法等。

3.5產品個性化宣稱

企業內部使用的替代方法可以在標準方法的水平上提高要求，或滿足消費者述求，或追求更高的安全水平。優化方法主要用于適應產品差異化競爭、更精確獲得實驗數據、溫和宣稱及特殊人群需要[1]。如利用皮膚模型對產品的皮膚刺激性進行評估時，可在標準方法檢測細胞活性的基礎上，增加刺激引進的白介素1α的表達情況[14]，或測定皮膚模型表皮屏障電阻值的變化，也可改變暴露方式，如暴露和后孵育的時間和次數，如BCOP的改良[10,15]。常見的替代方法優化方案見表3。隨著檢測數據的積累和研究的深入，許多改進方案將被行業內提出并使用。

3.6拓展應用領域

替代方法開發的初衷是滿足大量化學品毒性測試的需要，目前成熟的方法主要用于皮膚接觸化學品的毒性預測。但對于粘膜接觸類物質的毒性測試尚無完整的替代方法解決方案，可在現有方法基礎上建立合理化的應用模型，例如牛角膜具有上皮組織共有的多層角質細胞的屏障結構和功能，可將其用于粘膜(口腔、陰道)刺激和皮膚刺激性的測試，為檢測口腔護理品(牙膏、漱口水等)和衛生護理產品(紙尿褲、衛生巾等)的安全性提供數據[10]。也有人將體外方法用于藥品、消毒產品、醫療器械的評價[16]。

表2 替代方法的組合應用情況

表3 目前替代方法的優化應用情況

4 化妝品替代方法應用趨勢

隨著替代技術的日益成熟，在全球化妝品毒性測試標準一體化和法規相互影響的背景下，我國化妝品全安性的測試會逐漸與國際標準趨同和接近，替代方法的應用范圍和水平也會相應提高，并實現自主創新和形成特色。今后將會有越來越多的體外測試數據，回答原料和產品安全性的問題。替代技術的投入研發和使用也會帶動相關學科和行業的發展，如細胞技術和模型、三維組織構建和產業化、替代方法專用設備、計算機模型、生物信息學和檢測技術的進步。替代技術在化妝品行業的率先應用不僅惠及本產業，也有利于其它健康相關產業，同時對保護消費者權益也有促進作用。

[1] 程樹軍,焦紅.實驗動物替代方法原理與應用[M].北京：科學出版社，2010：285-304.

[2] 程樹軍.化妝品評價替代方法標準實施指南[M].北京：中國質檢出版社，2017.

[3] Patlewicz G, Ball N, Booth ED, et al. 2013. Use of category approaches, read-across and (Q)SAR: general considerations[J]. Regul Toxicol Pharmacol,2013,67(1):1-12.

[4] OECD. OECD new guidance document on an integrated approach on testing and assessment(IATA) for skin corrosion and irritation[S]. Series on Testing and Assessment No.203.2013

[5] 瞿小婷,程樹軍,秦瑤,等.有害結局通路指南及毒性測試應用分析[J].中國日用化學工業,2016,46(8):473-478

[6] 黃健聰,秦瑤,程樹軍,等. 牛角膜渾濁滲透試驗方法預測眼刺激性的研究[J].中國衛生檢驗雜志，2014，24(14)：1980-1983.

[7] 秦瑤,程樹軍,黃健聰,等.整合CAMVA和BCOP方法檢測化妝品的眼刺激[J].中國比較醫學雜志，2014，24(6)：78-82.

[8] OECD. OECD guideline for testing of chemicals No.437: Bovine corneal opacity and permeability test method for identifying i) Chemicals inducing serious eye damage and ii) Chemicals not requiring classification for eye irritation or serious eye damage[S].Paris: OECD, 2013:1-27.

[10] 秦瑤,柯逸暉,程樹軍,等.牛角膜渾濁和滲透性實驗應用于個人護理產品評價的案例分析[J].日用化學品科學,2017,(3):13-18.

[11] Scott L, Eskes C, Hoffmann S, et al. A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using bottom-up and top-down approaches[J]. Toxicol in Vitro, 2010, 24(1):1-9.

[12] 柯逸暉,陳彧,程樹軍,等. 直接多肽結合試驗組合人細胞系活化試驗預測皮膚致敏物的探討[J].中國實驗動物學報,2016,24(6):611-617.

[13] Jaworska JS, Natsch A, Ryan C,et al.Bayesian integrated testing strategy (ITS) for skin sensitization potency assessment: a decision support system for quantitative weight of evidence and adaptive testing strategy[J].Arch Toxicol,2015, 89(12):2355-83.

[14] Walters RM, Gandolfi L, Mack CM, et al.In vitro assessment of skin irritation potential of surfactant-based formulations by using a 3-D skin reconstructed tissue model and cytokine response[J]. Altern Lab Anim,2016,44(6):523-532.

[15] 陳彧,喻歡,程樹軍,等.結合組織學評分的牛角膜渾濁和滲透性方法研究[J].日用化學工業，2016，46(2)：107-110.

[16] Coleman KP, McNamara LR, Grailer TP, et al. Evaluation of an in vitro human dermal sensitization test for use with medical device extracts[J], Applied In Vitro Toxicol,2015,1(2):118-130.

Theapplicationanalysisofalternativemethodincosmeticsasssessment

CHENG Shu-Jun1， QIN Yao2， KE YI-Hui1,2， CHEN Zhi-Jie2， HUANG Jian-cong2

(1.Guangdong Inspection and Quarantine Technology Center, Guangzhou 510642，China； 2.Chn-Alt Biotech Co., Ltd, Guangzhou 510535)

In vitro method as indispensable biological research and testing tools, has been widely used in cosmetics compliance test, biological mechanism research and functional materials screening. These methods include alternative methods which have been accepted by reguations and standardized test guide, non-testing method used for risk assessment and prediction, and a lot more diversification and individualization of in vitro methods.With the consensus formation of the whole industry and increase of application experience, innovation and optimization in vitro method will be constantly emerge. These technologies will be beneficial to improve competitiveness and to develop products to meet the needs of consumers.

Alternative methods; Cosmetics; In vitro assessment; Application

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0101-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.020

2017-02-09

廣東省科技計劃項目(2015A030402005)；國家認監委認證認可科技支撐計劃項目(2017RJWKJ10)。

程樹軍(1971-)，博士，研究員,研究方向：化妝品測試替代方法研發和標準化。E-mail: chengsj@126.com