siRNA沉默MACC1基因表達對宮頸癌細胞增殖及侵襲的影響

杜 珍，陳志美，周道秋，黃潔萍

(海南省第二人民醫院婦產科，海南 五指山 572299)

研究報告

siRNA沉默MACC1基因表達對宮頸癌細胞增殖及侵襲的影響

杜 珍，陳志美，周道秋，黃潔萍

(海南省第二人民醫院婦產科，海南 五指山 572299)

目的探討siRNA沉默結腸癌轉移相關基因1(MACC1)表達對Hela宮頸癌細胞增殖及侵襲的影響。方法通過脂質體將siRNA MACC1及siRNA NC轉入Hela細胞中，RT-PCR及western blot檢測轉染效果，MTT法檢測細胞活力，流式細胞術檢測細胞周期，Transwell法檢測細胞侵襲能力，western blot檢測細胞周期蛋白D1(cyclin D1)、cyclin E，基質金屬蛋白酶2(MMP2)、MMP9蛋白表達及細胞外調節蛋白激酶(ERK)磷酸化水平。結果與siRNA NC組比較，siRNA MACC1組中MACC1蛋白及mRNA表達量降低(P< 0.01)，細胞活力及侵襲能力下降(P< 0.01)，細胞周期阻滯在G1期，cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9及p-ERK表達量下調(P< 0.01)。結論siRNA MACC1能顯著的抑制宮頸癌Hela細胞增殖與侵襲，可能與下調ERK磷酸化水平有關。

結腸癌轉移相關基因1(MACC1)；宮頸癌；增殖；侵襲

宮頸癌是一種常見的女性惡性腫瘤，僅次于乳腺癌，近些年來由于宮頸癌細胞篩查技術的推廣使得宮頸癌的發病率及死亡率均有所下降，但是隨著高危型人乳頭狀病毒(HPV)持續感染的增加，導致了目前宮頸癌的發病年齡呈現了年輕化[1, 2]。同時宮頸癌的發病機制到目前為止還未詳細闡述，因此從分子水平上進一步的探討宮頸癌的發病機制對于宮頸癌的診斷，基因治療及預后將具有重大意義。Stein等學者在2009年結腸癌研究中發現了結腸癌轉移相關基因1(metastasis-associated in colon cancer 1，MACC1)，且后續研究表明MACC1在眾多的腫瘤組織中高表達，并與腫瘤的侵襲轉移密切相關[3-6]。也有眾多學者研究發現MACC1在正常宮頸組織，中-重度宮頸上皮內瘤變組織，宮頸癌組織中逐漸高表達，且發現MACC1在宮頸癌細胞的侵襲轉移中發揮重要作用[7, 8]。但MACC1在宮頸癌細胞的增殖及侵襲中的作用還未見報道，因此本研究將較為詳細的闡述此作用機制。

1 材料和方法

1.1細胞株

宮頸癌細胞Hela購自中國科學院細胞庫，目錄號TCHu187。

1.2主要試劑和儀器

兔抗人MACC1、cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9、ERK1/2、p-ERK1/2多克隆抗體購自美國Abcam公司；兔抗人GAPDH單克隆抗體，BCA蛋白測定試劑盒購自碧云天生物技術有限公司；胎牛血清，DMEM培養基購自Hyclone公司；transwell 小室購自美國Corning 公司；siRNA MACC1及siRNA NC購自上海吉瑪生物制藥公司；一步法RT-PCR擴增試劑盒，trizol RNA提取試劑盒購自大連寶生生物技術有限公司。DYCZ-25D型雙垂直電泳儀，DYCZ-25D型轉印電泳儀購自北京六一儀器廠；GelDoc 2000凝膠成像系統購自美國伯樂公司；Biosciences FACSAria流式細胞儀購自美國BD公司；MK3酶標儀購自美國Thermo公司。

1.3實驗方法

1.3.1 siRNA的轉染

當Hela細胞生長達到50%左右的時候，利用脂質體將siRNA MACC1及siRNA NC轉染到Hela細胞中，6 h后換液，繼續培養48 h，利用RT-PCR法及western blot法檢測轉染效果。

1.3.2 MTT法檢測細胞活力

將Hela細胞接種到96孔板，培養24 h后，按“1.3.1”進行轉染，繼續培養48 h后，加入MTT 20 μL，培養4 h，將96孔板翻過來棄去上清液，再往96孔板中每個孔加入150 μL的二甲基亞砜，96孔板在微量振蕩器中震蕩約10 min，最后在酶標儀中檢測OD值，波長選擇為560 nm，OD值即是細胞活力。

1.3.3 流式細胞術檢測細胞周期

將Hela細胞接種到6孔板，培養24 h后，按“1.3.1”進行轉染，繼續培養48 h后，每組分別收集1×105/mL個細胞，加入Rnase(終濃度為10 mg/mL)5 μL，小心吹打吹打混勻后，室溫下孵育1 h，再加入PI染液，繼續吹打混勻，并在室溫下避光孵育30 min，于1 h內在流式細胞儀進行細胞周期檢測分析。

1.3.4 Transwell法檢測細胞侵襲能力

將matrigel膠平鋪于Transwell小室微膜上以被使用。利用0.25%胰蛋白酶將按“1.3.1”進行轉染并培養了48 h的Hela細胞消化下來，離心收集細胞后，將細胞接種到Transwell的上室，下室不接種細胞，僅加入DMEM培養基，48 h后，將Transwell小室取出來，用4%的多聚甲醛固定5 min，PBS洗滌后，結晶紫再染色5 min，在倒置顯微鏡下觀察，并取5個視野中的細胞數目進行計數，取平均值，即為細胞的侵襲數目。

1.3.5 RT-PCR檢測MACC1 mRNA的表達

采用trizol RNA提取試劑盒提取細胞總的RNA，并用檢測總RNA的純度，當檢測結果OD260/OD280在1.8～2.1之間，說明RNA純度的良好，可以接著采用一步法RT-PCR試劑盒逆轉錄RNA，而逆轉錄產物cDNA進行擴增，最后將擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳。引物如下。MACC1上游引物：5’-AACCCCAAACCTAAAAAGACTC-3’，下游引物：5’-ACCCAGGACATCAGCTAAAACT-3’，GAPDH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物：5’-TGGACTCCACGACGTACT-3’。

1.3.6 Western blot檢測cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9及p-ERK的表達

在冰浴條件下把細胞刮下來，離心加入細胞裂解液進行裂解，大約30 min，并在4℃條件下離心，收集到的上清液即是總蛋白。接著采用BCA試劑盒對蛋白濃度進行測定。蛋白定容后，在微波爐上煮沸變性。制作濃縮膠和分離膠，并蒸餾水封閉。然后蛋白樣品上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，濕法轉膜。5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗溶液(兔抗人cyclin D1、cyclin E、MMP2、MMP9、ERK1/2，p-ERK1/2及GAPDH多克隆抗體，稀釋度為1∶100)孵育，4℃過夜；第二天在二抗溶液中室溫條件下孵育1～2 h。最后在凝膠成像系統中曝光。

1.4統計學方法

2 結果

2.1siRNAMACC1對Hela細胞中MACC1表達的影響

如圖1所示，與siRNA NC組中MACC1蛋白(1.07±0.10)及mRNA(0.69±0.07)表達比較，siRNA MACC1組MACC1蛋白(0.29±0.03)及mRNA(0.12±0.01)表達下調，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.2siRNAMACC1對Hela細胞活力的影響

Hela細胞轉染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后經MTT實驗發現，二者細胞活力分別為(0.73±0.07)、(0.38±0.03)，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.3siRNAMACC1對Hela細胞周期的影響

如表1所示，Hela細胞轉染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后經流式細胞周期實驗發現，siRNA MACC1能使細胞周期阻滯在G1期。

2.4siRNAMACC1對Hela細胞侵襲能力的影響

如圖2所示，Hela細胞轉染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后經transwell侵襲實驗發現，二者細胞侵襲數目分別為(159.65±15.94)、(38.59±3.86)，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.5siRNAMACC1對Hela細胞中cyclinD1及cyclinE表達的影響

如圖3所示，Hela細胞轉染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后經western blot實驗發現，與siRNA NC組中cyclin D1(0.54±0.05)及cyclin E(0.60±0.06)表達比較，siRNA MACC1組cyclin D1(0.15±0.01)及cyclin E(0.20±0.02)表達下調，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.6siRNAMACC1對Hela細胞中MMP2及MMP9表達的影響

如圖4所示，Hela細胞轉染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后經western blot實驗發現，與siRNA NC組中MMP2(1.19±0.12)及MMP9(1.03±0.10)表達比較，siRNA MACC1組MMP2(0.30±0.03)及MMP9(0.24±0.02)表達下調，差異有顯著性(P< 0.01)。

2.7siRNAMACC1對Hela細胞中EKR磷酸化水平的影響

如圖5所示，Hela細胞轉染siRNA NC及siRNA MACC1，48 h后經western blot實驗發現，與siRNA NC組(1.38±0.12)比較，siRNA MACC1組(0.46±0.04)p-ERK1/2表達下調 (P< 0.01)。

A:蛋白表達；B：mRNA表達。圖1 siRNA MACC1對Hela細胞中MACC1表達的影響(n=6)Note.A:Protein expression;B：mRNA expression.Fig.1 Effect of siRNA MACC1 on the expression of MACC1 in Hela cells

Tab.1Effect of siRNA MACC1 on Hela cell cycle

組別GroupsG1期G1phageS期SphageG2期G2phagesiRNANC4837±4901643±1643520±352siRNAMACC16254±629??1148±120??2598±260??

注：與siRNA NC比較，**P< 0.01。

Note.Compared with the siRNA NC group,**P< 0.01.

圖2 siRNA MACC1對Hela細胞侵襲能力的影響( ×200)Fig.2 Effect of siRNA MACC1 on the invasion ability of Hela cells

圖3 siRNA MACC1對Hela細胞中CyclinD1及CyclinE表達的影響Fig.3 Effect of siRNA MACC1 on the expression of cyclin D1 and cyclin E in Hela cells

圖4 siRNA MACC1對Hela細胞中MMP2及MMP9表達的影響Fig.4 Effect of siRNA MACC1 on the expression of MMP2 and MMP9 in Hela cells

圖5 siRNA MACC1對Hela細胞中p-ERK1/2表達的影響Fig.5 Effect of siRNA MACC1 on the expression of p-ERK1/2 in Hela cells

3 討論

2009年Stein等學者通過基因比對技術在結腸癌的研究中發現了一種與結腸癌轉移密切相關的基因，并命名為MACC1。MACC1位于人第7號染色體上，所編碼的蛋白質由852個氨基酸組成。此蛋白質結構域包括ZU5，SH3及死亡結構域等，能夠介導蛋白質之間相互作用，信號傳導，也能夠參與細胞凋亡，遷移，炎癥反應及免疫調節[5, 6]。MACC1是HGF/c-Met信號通路中關鍵調節因子，能夠結合于c-Met啟動子，激活此信號通路，進而調控下游靶基因的轉錄表達，也能夠促使c-Met自身發生磷酸化，進而介導多種生物學反應[5]。眾多研究已經表明MACC1在宮頸癌、乳腺癌、卵巢癌等多種婦科腫瘤中高表達，并與腫瘤細胞的侵襲轉移密切相關[5, 7, 8]。另外研究還表明siRNA MACC1能夠顯著的抑制宮頸癌細胞的侵襲轉移，與下調MMP2及MMP9表達有關[9]。但是目前MACC1在宮頸癌細胞的增殖及侵襲中的作用報道較少，并且相應作用機制不清楚，因此本課題組將對此展開研究。本研究首先利用脂質體將siRNA MACC1及siRNA NC轉染到宮頸癌細胞Hela中，并利用western blot及RT-PCR證實轉染成功。接著采用MTT法檢測siRNA MACC1對Hela細胞活力的影響，結果表明siRNA MACC1能顯著的降低Hela細胞活力，與Zhou等[9]研究一致。

腫瘤細胞增殖旺盛源于細胞周期的紊亂，細胞周期相關蛋白異常表達，使細胞周期調控系統失去控制，導致細胞中蛋白質合成遠大于分解，細胞有絲分裂加快，細胞不斷增值。其中G1期，G2期是細胞周期主要調控點，是眾多抗腫瘤藥物作用靶點[10, 11]。cyclin D1是與G1期密切相關的細胞周期蛋白，在G1期合成并達到頂峰，能與CDK4/6結合形成復合物，促使下游核轉錄因子進入細胞核與細胞增殖相關基因結合，并促使其轉錄，最終使得G1期向S期迅速轉換。cyclin E亦是與G1期相關的細胞周期蛋白，能在cyclin D1降解后，與CDK2結合，促進DNA繼續復制。另外腫瘤細胞的侵襲轉移是導致外科手術失敗的重要因素之一。其中細胞外基質的降解能夠促使腫瘤細胞的快速遷移，介導這一個過程的是蛋白水解酶，其中最為主要的是MMPs。MMP2在降解細胞外基質成分的同時還能夠誘導新生血管的發生，進而促進腫瘤細胞的遷移、擴散及轉移。MMP9是分子量最大的MMPs，幾乎能夠降解所有的細胞外基質成分，包括Ⅳ膠原。而且有研究表明siRNA MACC1能夠通過下調cyclin D1，cyclin E表達，并使細胞周期阻滯在G1期，進而遏制膠質瘤細胞U251的增殖[12]。另外也有研究表明siRNA MACC1能夠抑制大腸癌細胞的遷移侵襲與下調MMP2，MMP9的表達有關[13]。因此探討siRNA MACC1對Hela細胞周期、細胞侵襲、細胞周期相關蛋白及MMPs表達的影響將具有重要意義。所以本研究進一步檢測了siRNA MACC1對Hela細胞周期，細胞侵襲能力，細胞周期蛋白及MMPs表達的影響，結果表明siRNA MACC1能使細胞周期阻滯在G1期，降低細胞侵襲能力，下調cyclin D1，cyclin E，MMP2及MMP9表達，最終抑制Hela細胞的增殖與侵襲。

細胞的凋亡，增殖，分化，細胞周期，細胞遷移及侵襲等等生物學過程受多種信號通路的調控，MAPK信號通路就是其中的一種[14]。MAPK家族包括ERK，JNK及p38 MAPK三個主要亞族。其中EKR是此信號通路的關節調控點，包括5個亞族(ERK1-5)，其中EKR1和ERK2研究得最為徹底，能通過自身磷酸化并將信號傳遞給下游基因進而調控細胞的生命過程。且有研究表明MACC1能夠通過MAPK信號通路級聯反應參與乳腺癌的發生發展[15]。提示MACC1可能也可以通過此信號通路影響宮頸癌的發生發展。所以本研究接著利用western blot檢測siRNA MACC1對Hela細胞中ERK1/2磷酸化水平的影響，結果表明siRNA MACC1能顯著的下調p-ERK1/2表達，進而遏制Hela細胞的增殖與侵襲。

綜上所述，siRNA MACC1能顯著降低Hela細胞活力，使細胞周期阻滯在G期，并降低細胞侵襲能力，是通過下調cyclin D1、cyclin E、MMP2及MMP9表達實現的，可能與抑制ERK信號通路激活有關。

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EffectofsilencingMACC1geneonproliferationandinvasionofcervicalcancercells

DU Zhen， CHEN Zhi-mei， ZHOU Dao-qiu， HUANG Jie-ping

(Department of Obstetrics and Gynecology; the Second People’s Hospital of Hainan province，Wuzhishan 72299，China)

ObjectiveTo explore the effect of silencing metastasis-associated in colon cancer 1 (MACC1) gene on proliferation and invasion of cervical cancer Hela cells.MethodssiRNA MACC1 and siRNA NC were transfected into cervical cancer Hela cells with liposomes. The expression of MACC1 protein and mRNA was detected by western blot and RT-PCR. Cell viability and invasion ability were measured by MTT and transwell assay, respectively. The expression of cyclin D1, cyclin E matrix metalloproteinase 2 (MMP2), MMP9 and the level of extracellular regulated protein kinases (ERK) phosphorylation was detected by western blot.ResultsCompared with siRNA NC, the expression of MACC1 protein and mRNA was down-regulated, cell viability and invasion ability were reduced (P< 0.01), cell cycle was arrested at G1 phase (P< 0.01), the expression of cyclin D1, cyclin E, MMP2, MMP9 and p-ERK1/2 was down-regulated (P< 0.01).ConclusionssiRNA MACC1 can inhibit proliferation and invasion of cervical cancer Hela cells, which migiht be related to down-regulation of p-ERK.

Metastasis-associated in colon cancer 1(MACC1); Cervical cancer; Proliferation; Invasion

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0080-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.016

2017-04-14

杜珍(1966-)，女，本科，副主任醫師，研究方向：婦科宮腔鏡。E-mail: 1137232558@qq.com