miR-424對非小細胞肺癌細胞株A549遷移及侵襲的影響

王 勝，熊 飛，開金丹

(湖北省腫瘤醫院胸外科，武漢 430079)

研究報告

miR-424對非小細胞肺癌細胞株A549遷移及侵襲
的影響

王 勝，熊 飛，開金丹*

(湖北省腫瘤醫院胸外科，武漢 430079)

目的探討miR-424對非小細胞肺癌細胞株A549遷移及侵襲的影響。方法RT-PCR法檢測肺癌細胞NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H446、A549、NCI-H1299、NCI-H157及人胚肺成纖維細胞MRC-5中miR-424表達，脂質體LipofectamineTM2000將miR-424 inhibitor和miR-424 NC轉入A549細胞中，48 h后，RT-PCR法檢測miR-424表達，CCK-8法檢測細胞活力，劃痕實驗檢測細胞遷移能力，Transwell實驗檢測細胞侵襲能力，western blot檢測基質金屬蛋白酶2(MMP2)、MMP9、轉化生長因子-β1(TGF-β1)及p-Smad3的表達。結果miR-424在肺癌細胞NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H446、A549、NCI-H1299、NCI-H157中的[(1.78±0.13)，(1.69±0.10)，(1.89±0.18)，(2.88±0.27)，(2.52±0.20)，(2.49±0.23)]表達量顯著高于miR-424在人胚肺成纖維細胞MRC-5中的(0.58±0.05)表達量(P< 0.01)。與miR-424 NC組比較，miR-424 inhibitor組miR-424表達量顯著降低(P< 0.01)，細胞活力下降(P< 0.01)，細胞遷移及侵襲能力降低(P<0.01)，MMP2，MMP9，TGF-β1及p-Smad3表達量均顯著下調(P< 0.01)。結論miR-424表達量下調后能通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路進而抑制A549細胞的遷移及侵襲。

miR-424；非小細胞肺癌；A549；遷移；侵襲

肺癌是一種常見的呼吸道惡性腫瘤，在全世界范圍內發病率及死亡率均居首位，且逐年成上升趨勢。肺癌包括非小細胞肺癌及(non-small cell lung cancer,NSCLC)小細胞肺癌(SCLC)，前者占了將近85%的比例。近些年來雖然隨著外科手術、化療、放療等醫學技術手段不斷提高，肺癌患者術后5年生存率仍不足5%，預后極差。造成這一結果的主要原因是肺癌的侵襲轉移，因此探討肺癌細胞的侵襲轉移機制對于肺癌的治療將具有重要意義[1-3]。miRNA是一種長度約為21～23 nt的高度保守的非編碼小RNA分子，通過靶向調控靶基因mRNA表達，參與細胞的增殖、分化、凋亡、遷移及侵襲轉移等生命過程[4, 5]。眾多研究已經表明miRNA在包括肺癌在內的眾多腫瘤組織中異常表達，miR-424是其中一種[5, 6]。miR-424是miR-16家族的一員，研究顯示miR-424在不同的腫瘤組織中表達趨勢不同，在NSCLC、乳腺癌、腎癌等組織中表達量上調，在宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌中表達量下調[7, 8]，但在腫瘤的發生過程中的具體作用機制尚未見報道，因此本研究將探討miR-424在肺癌細胞株中的表達，及其對肺癌細胞遷移及侵襲的影響及相關機制。

1 材料和方法

1.1細胞株

人大細胞肺癌細胞NCI-H460，人肺腺癌細胞NCI-H1975，人小細胞肺癌細胞NCI-H446，人非小細胞肺癌細胞A549，H1299，NCI-157，人胚肺成纖維細胞MRC-5購于中國科學院上海細胞庫。

1.2主要試劑和儀器

miR-424 inhibitor和miR-424 NC均購自廣州銳博技術有限公司。兔抗人MMP2、MMP9、TGF-β1、Smad3和p-Smad3多克隆抗體均購自美國Abcam公司。胎牛血清和DMEM培養基均購自美國Hyclone公司。辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (H+L)、BCA試劑盒和CCK-8試劑盒均購自南京凱基生物技術有限公司。Trizol法試劑盒、LipofectamineTM2000脂質體和一步法RT-PCR試劑盒均購自大連寶生生物技術有限公司。Transwell小室購自美國Corning公司。DYCZ-425D型雙垂直電泳儀和DYCZ-40D型轉印電泳儀均購自北京六一儀器廠。GelDoc XR System凝膠成像系統購自美國伯樂公司。FACSCalibur型流式細胞儀和168-1000XC型酶標儀均購自美國BD公司。AF6000型熒光顯微鏡購自德國萊卡公司。

1.3實驗方法

1.3.1 RT-PCR法檢測miR-424在細胞中的表達

使用Trizol試劑盒提取細胞總RNA，并檢測純度；接著采用一步法RT-PCR將RNA逆轉錄為cDNA并進行擴增；最后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測cDNA擴增產物。miR-424上游引物：5’- CAGCAGC AAUUCAUGUUUUGAA -3’，下游引物：5’-CGCTTC ACGAATTTGCGTGTCAT-3’； GAPDH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物：5’-TGGA CTCCACGACGTACT-3’。 上游引物和下游引物由上海生工合成。

1.3.2 細胞轉染

當A549細胞生長至50%左右時，利用LipofectamineTM2000脂質體將miR-424 inhibitor和miR-424 NC轉染到A549細胞中，6 h后棄去培養液，換成含10%血清的DMEM培養基并繼續培養48 h。使用RT-PCR法檢測細胞中miR-424表達。

1.3.3 CCK-8法檢測A549細胞活力

將5×103個A549細胞接種至96孔板，培養24 h，按“1.3.2”進行轉染，48 h時每孔中均加入CCK-8試劑，繼續孵育4 h，然后利用酶標儀檢測波長570 nm處的OD值，所測OD值即為細胞活力。

1.3.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取按“1.3.2”進行轉染的A549細胞接種到6孔板，繼續培養24 h后，用200 μL的槍頭對6孔板內的細胞進行劃痕，接著用PBS洗去脫落下來的細胞，繼續培養24 h，于倒置顯微鏡下進行拍照并每孔選取4個視野進行劃痕距離的記錄。

1.3.5 Transwell法檢測細胞侵襲能力

實驗前將Matrigel膠均勻的平鋪于Transwell小室微膜上，備用。將1×104個A549細胞接種于6孔板后，按“1.3.2”進行轉染，繼續培養48 h后，用胰蛋白酶將細胞消化下來并制成單懸液，用含有10%胎牛血清的DMEM培養基重懸，并接種至Transwell上室，下室僅加入含10%胎牛血清的DMEM培養基，48 h后，將Transwell小室取出，用多聚甲醛固定細胞，接著結晶紫染色，并在倒置顯微鏡下進行觀察，對Transwell下室5個視野中的細胞計數取平均值，即為細胞的侵襲數目。

1.3.6 Western blot檢測細胞MMP2、MMP9、TGF-β1、Smad3、p-Smad3中表達

將1×105個細胞接種至6孔板，按“1.3.2”操作步驟進行轉染，培養48 h，在冰浴條件下將6孔板中的細胞刮取并離心收集，向其中加入細胞裂解液，30 min后離心收取上清液即為總蛋白，總蛋白濃度測定及定量根據BCA試劑盒說明書進行，接著將蛋白煮沸變性，取大約30 ng左右蛋白樣品上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳2 h；接著濕法轉膜30～50 min。2%BSA室溫下孵育1 h，一抗溶液(兔MMP2，MMP9，TGF-β1，Smad3，p-Smad3多克隆抗體，稀釋度為1∶100) 4℃過夜孵育。第二天在室溫條件下，在二抗溶液(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (H+L))中孵育1～2 h，凝膠成像系統中曝光。

1.4統計學方法

2 結果

2.1miR-424在肺癌細胞及胚肺成纖維細胞中的表達

如圖1所示，miR-424在肺癌細胞NCI-H460、NCI-H1975、NCI-H446、A549、NCI-H1299、NCI-H157中[(1.78±0.13)、(1.69±0.10)、(1.89±0.18)、(2.88±0.27)、(2.52±0.20)、(2.49±0.23)]的表達量顯著高于miR-424在人胚肺成纖維細胞MRC-5(0.58±0.05)中的表達量，差異有顯著性(P< 0.01)。

注：1：MRC-5；2：NCI-H460；3：NCI-H1975；4：NCI-H446；5：A549；6：NCI-H1299；7：NCI-H157；與MRC-5比較，** P< 0.01；miR-214表達量即是miR-214的拷貝數。圖1 miR-424在肺癌細胞及胚肺成纖維細胞中的表達Note.1：MRC-5 cells；2：NCI-H460 cells；3：NCI-H1975 cells；4：NCI-H446 cells；5：A549 cells；6：NCI-H1299 cells；7：NCI-H157 cells；Compared with MRC-5, ** P< 0.01；The expression of miR-214 is miR-214 copy number.Fig.1 Expression of miR-424 in the lung cancer cells and embryonic lung fibroblasts

注：與miR-424 NC比較，** P< 0.01。圖2 miR-424 inhibitor轉染效果的檢測Note.Compared with the miR-424 NC, ** P< 0.01.Fig.2 Detection of transfection efficiency of miR-424 inhibitor

2.2miR-424inhibitor轉染效果的檢測

如圖2所示，與miR-424 NC組(2.89±0.28)比較，miR-424 inhibitor組(0.74±0.07)中miR-424表達量下降 (P< 0.01)。

2.3miR-424inhibitor對A549細胞活力的影響

與miR-424 NC組(0.72±0.07)比較，miR-424 inhibitor組(0.35±0.03)細胞活力均降低 (P< 0.01)。

2.4miR-424inhibitor對A549細胞遷移及侵襲能力的影響

如圖3所示，與miR-424 NC組(25.34±2.35)比較，miR-424 inhibitor組(4.78±0.45)細胞遷移距離降低(P< 0.01)。如圖4所示，與miR-424 NC組(156.49±14.55)比較，miR-424 inhibitor組(39.76±3.28)細胞侵襲數目降低(P< 0.01)。

圖3 miR-424 inhibitor對A549細胞遷移能力的影響( ×200)Fig.3 Effect of miR-424 inhibitor on A549 cell migration ability

圖4 miR-424 inhibitor對A549細胞侵襲能力的影響( ×200)Fig.4 Effect of miR-424 inhibitor on A549 cell invasion ability

2.5miR-424inhibitor對A549細胞中MMPs表達量的影響

如圖5所示，與miR-424 NC組比較，miR-424 inhibitor組中MMP2、MMP9表達量顯著下調，差異有顯著性(P< 0.01)。

圖5 miR-424 inhibitor對A549細胞中MMPs表達量的影響Fig.5 Effect of miR-424 inhibitor on the expression of MMPs in A549 cells

2.6miR-424inhibitor對A549細胞中TGF-β信號通路的影響

如圖6所示，與miR-424 NC組比較，miR-424 inhibitor組中TGF-β1、p-Smad3表達量顯著下調，差異有顯著性(P< 0.01)。

圖6 miR-424 inhibitor對A549細胞中TGF-β信號通路的影響Fig.6 Effect of miR-424 inhibitor on TGF-β signal pathway in A549 cells

3 討論

相關學者于1993年在秀麗隱桿線蟲中首次發現了miRNA的存在，即lin-4；于2000年在秀麗隱桿線蟲中又發現了第二個miRNA，即let-7。后續的十幾年來在脊椎動物、植物及病毒中發現了近千種的miRNA，并發現了miRNA不僅與生長發育，免疫調控有關，還發現miRNA所定位的基因組處于腫瘤相關的脆性區，提示了miRNA與腫瘤的發生可能密切相關[4, 5]。相關學者于2002年證實了miRNA和腫瘤的關系，慢性淋巴細胞白血病患者中miR-15和miR-16表達量下調，并且這兩個miRNA與白血病的發生發展密切相關，引發了探討miRNA在腫瘤發生過程中的作用的相關研究[5, 6]。miR-15/16家族包括了miR-15a/b，miR-16，miR-195，miR-424和miR-497。其中miR-424定位于人類染色體Xq26.3上，但在鼠類中的同源物為miR-322。研究顯示miR-424在不同的生理和病理條件下其作用效果不一樣。如miR-424在NSCLC、乳腺癌、腎癌等組織中表達量上調，在宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌中表達量下調，但具體的作用機制尚未見報道[7, 8]。因此本研究將探討miR-424在肺癌中的作用機制。首先Chen等[9]研究發現miR-424在肺癌患者病灶組織及肺癌細胞系中的表達量均顯著提高。Donnem等[10]研究發現生存時間短的NSCLC患者中miR-424表達量顯著的高于生存時間長的NSCLC患者，且這一過程可能與miR-424促血管生成有關。所以本研究首先利用RT-PCR法檢測肺癌細胞NCI-H460，NCI-H1975，NCI-H446，A549，NCI-H1299，NCI-H157及人胚肺成纖維細胞MRC-5中miR-424的表達量，結果與Chen等[9]，Donnem等[10]研究一致，肺癌細胞中miR-424的表達量顯著高于MRC-5細胞中的表達量，提示miR-424在肺癌的發生發展中起促進作用。同時miR-424在A549中的表達量最高，所以本研究選取此細胞株作為后續研究對象。接著利用脂質體轉染miR-424 inhibitor和miR-424 NC，RT-PCR法證明轉染成功。進一步CCK-8法檢測miR-424 inhibitor對A549細胞活力的影響，結果表明miR-424 inhibitor能顯著的降低A549活力，與miR-424在胃癌細胞中的作用一致[11]。

研究已經顯示肺癌細胞的侵襲轉移是導致肺癌患者預后不良，5年生存率低的主要原因[1-3]。因此本研究進一步的探討miR-424 inhibitor對A549細胞遷移及侵襲能力的影響，結果表明miR-424 inhibitor能顯著的抑制A549的遷移及侵襲能力。weel，Chk1，CYLD，Wnt3a，BCL-2，E2F6蛋白是目前已報道的miR-424的靶基因，但上述蛋白主要與細胞增殖、凋亡、細胞周期有關的，而與細胞的遷移及侵襲關系不大[7, 8]。另外細胞外基質的降解是細胞遷移，侵襲及轉移等過程中的必經過程，MMPs是降解細胞外基質最為主要的蛋白水解酶。同時MMPs也是一組Zn2+-Ca2+依賴性蛋白酶，可以降解幾乎所有的ECM成分。其中MMP2可以通過降解細胞外基質成分和誘導血管新生進而促進腫瘤細胞浸潤[12]。MMP9是MMPs中分子量最大的蛋白水解酶，幾乎也能降解所有的細胞外基質成分，提高腫瘤細胞的運動能力[13]。所以本研究進一步的探討miR-424 inhibitor對A549細胞遷移及侵襲的影響，結果表明miR-424 inhibitor能顯著的下調MMP2及MMP9表達量，提示miR-155 inhibitor能通過下調MMPs進而抑制A549細胞的遷移及轉移。

腫瘤細胞的遷移、侵襲等生物學過程受多種信號通路調控，TGF-β就是其中一種[14, 15]。TGF-β包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1研究最為廣泛。而TGF-β1/Smad信號通路也是TGF-β1介導的最為主要的信號通路，TGF-β1與其下游受體Smad2/3結合后，將信號傳遞到細胞核，進而調控靶基因的轉錄。且有研究表明miR-424能通過抑制TGF-β1/Smad3信號通路進而抑制胃癌細胞的增殖，遷移等生物學行為[11]，提示miR-424可能也可以通過調控TGF-β1/Smad3信號通路進而抑制A549細胞的遷移及侵襲。所以本研究繼續探討miR-424 inhibitor對A549細胞中TGF-β1/Smad3信號通路的影響，結果表明miR-424 inhibitor能顯著的下調TGF-β1、p-Smad3表達，進而抑制A549細胞的遷移及侵襲。

綜上所述，miR-424在肺癌細胞中的表達量高于人胚肺成纖維細胞中的表達量，miR-424 inhibitor能顯著的抑制A549細胞的遷移及侵襲，并下調MMP2及MMP9表達，與抑制TGF-β1/Smad3信號通路有關。

[1] Baker S, Dahele M, Lagerwaard FJ, et al. A critical review of recent developments in radiotherapy for non-small cell lung cancer[J]. Radiat Oncol, 2016,11(1):115.

[2] Paleiron N, Bylicki O, Andre M, et al. Targeted therapy for localized non-small-cell lung cancer: a review[J]. Onco Targets Ther, 2016,9:4099-4104.

[3] Counago F, Rodriguez A, Calvo P, et al. Targeted therapy combined with radiotherapy in non-small-cell lung cancer: a review of the Oncologic Group for the Study of Lung Cancer (Spanish Radiation Oncology Society)[J]. Clin Transl Oncol, 2017,19(1):31-43.

[4] Cai Y, Yu X, Hu S, et al. A brief review on the mechanisms of miRNA regulation[J]. Genom Proteom Bioinform, 2009,7(4):147-154.

[5] Gambari R, Brognara E, Spandidos D A, et al. Targeting oncomiRNAs and mimicking tumor suppressor miRNAs: New trends in the development of miRNA therapeutic strategies in oncology (Review)[J]. Int J Oncol, 2016,49(1):5-32.

[6] 許文劍, 蘇秀蘭, 劉明. miRNA與腫瘤關系的研究進展[J]. 醫學綜述, 2013,19(17):3120-3123.

[7] 劉萍, 趙海蘋, 羅玉敏. MicroRNA-424在腫瘤發生中的作用和機制研究進展[J]. 中國實驗動物學報, 2016,24(5):529-534.

[8] 趙海蘋, 劉萍, 羅玉敏. MicroRNA-424參與多種疾病發生發展的分子機制研究進展[J]. 中國比較醫學雜志, 2016,26(9):76-82.

[9] Chen B, Duan L, Yin G, et al. Simultaneously expressed miR-424 and miR-381 synergistically suppress the proliferation and survival of renal cancer cells——Cdc2 activity is up-regulated by targeting WEE1[J]. Clinics (Sao Paulo), 2013,68(6):825-833.

[10] Donnem T, Fenton CG, Lonvik K, et al. MicroRNA signatures in tumor tissue related to angiogenesis in non-small cell lung cancer[J]. PLoS One, 2012,7(1):e29671.

[11] Wei S, Li Q, Li Z, et al. miR-424-5p promotes proliferation of gastric cancer by targeting Smad3 through TGF-beta signaling pathway[J]. Oncotarget, 2016.

[12] Ekbote A V, Danda S, Zankl A, et al. Patient with mutation in the matrix metalloproteinase 2 (MMP2) gene - a case report and review of the literature[J]. J Clin Res Pediatr Endocrinol, 2014,6(1):40-46.

[13] Gong L, Wu D, Zou J, et al. Prognostic impact of serum and tissue MMP-9 in non-small cell lung cancer: a systematic review and meta-analysis[J]. Oncotarget, 2016,7(14):18458-18468.

[14] Sun N, Taguchi A, Hanash S. Switching roles of TGF-beta in cancer development: implications for therapeutic target and biomarker studies[J]. J Clin Med, 2016,5(12).

[15] Barrett CS, Millena AC, Khan SA. TGF-beta effects on prostate cancer cell migration and invasion require FosB[J]. Prostate, 2017,77(1):72-81.

EffectofmiR-424onmigrationandinvasionofnon-smallcelllungcancercellsA549

WANG Sheng， XIONG Fei， KAI Jin-dan*

(Department of Thoracic Surgery, Hubei Cancer Hospital, Wuhan 430079，China)

ObejectivesTo explore the effect of miR-424 on migration and invasion of non-small cell lung cancer A549 cells.MethodsExpression of miR-424 in NCI-H460, NCI-H1975, NCI-H446, A549, NCI-H1299, NCI-H157 lung cancer cells and embryonic lung fibroblasts MRC-5 cells was examined by RT-PCR.miR-424 inhibitor and miR-424 NC were transfected into A549 cells with liposome LipofectamineTM2000. Cell viability was measured by MTT assay. Cell migration and invasion was measured by wound scratch assay and transwell migration assay,respectively.The expression of matrix metalloproteinase 2 (MMP2), MMP9, transforming growth factor-β (TGF-β1), p-Smad3 was measured by western blot.ResultsThe expression of miR-424 in NCI-H460, NCI-H1975, NCI-H446, A549, NCI-H1299, NCI-H157 cells (1.78±0.13, 1.69±0.10, 1.89±0.18, 2.88±0.27, 2.52±0.20, 2.49±0.23) was significantly higher than that in MRC-5 cell 0.58±0.05(P< 0.01). Compared with the miR-424 NC group, the cell viability was reduced (P<0.01), cell migration and invasion ability was decreased (P< 0.01), and the expression of MMP2, MMP9, TGF-β1, p-Smad3 protein was down-regulated in miR-424 inhibitor group (P< 0.01).ConclusionsmiR-424 inhibitor can inhibit the migration and invasion in lung cancer A549 cells via inhibition of TGF-β1/Smad3 signal pathway.

miR-424; Non-small cell lung cancer; A549; Migration; Invasion

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0074-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.015

2017-02-14

王勝(1980-)，男，碩士生，主治醫師，研究方向：胸部腫瘤的外科及綜合治療。E-mail: 13643651@qq.com

開金丹，E-mail: glucosecn@hotmail.com