單染與復(fù)染在觀察SIRT1基因敲除小鼠骨關(guān)節(jié)炎切片中的差異比較

于紅燕，楊占東，楊 琪，于 斐

(1.濱州市濱城區(qū)市立醫(yī)院，山東 濱州 256600； 2.空軍總醫(yī)院，北京 100142； 3.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036)

研究報(bào)告

單染與復(fù)染在觀察SIRT1基因敲除小鼠骨
關(guān)節(jié)炎切片中的差異比較

于紅燕1，楊占東1，楊 琪2，于 斐3*

(1.濱州市濱城區(qū)市立醫(yī)院，山東 濱州 256600； 2.空軍總醫(yī)院，北京 100142； 3.北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036)

目的通過(guò)SIRT1基因敲除建立相關(guān)小鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，在此基礎(chǔ)上觀察各種不同單獨(dú)染色或復(fù)合染色技術(shù)在觀察軟骨組織切片形態(tài)學(xué)中的差異。方法將小鼠膝關(guān)節(jié)組織標(biāo)本分為2組：SIRT1-/-小鼠假手術(shù)組(n=6，A組)，SIRT1-/-小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組(n=6，B組)。通過(guò)前交叉韌帶橫斷加內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)建立膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型，行HE染色、番紅O-固綠染色、番紅O-阿利新藍(lán)染色、番紅O染色、固綠染色、阿利新藍(lán)染色，6種單獨(dú)染色或復(fù)合染色方式觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果番紅O-固綠染色、番紅O-阿利新藍(lán)染色在觀察軟骨細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、軟骨分層結(jié)構(gòu)的情況、II型膠原纖維的顯示、潮線及軟骨下骨的改變中，效果更好；而番紅O染色、阿利新藍(lán)染色在觀察軟骨組織缺失方面有一定的優(yōu)勢(shì)。結(jié)論在觀察SIRT1基因敲除小鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織切片中，與單獨(dú)染色相比，復(fù)合染色在獲得軟骨結(jié)構(gòu)的各種信息方面優(yōu)勢(shì)更加明顯。

SIRT1基因；基因敲除；小鼠動(dòng)物模型；骨關(guān)節(jié)炎；單獨(dú)染色；復(fù)合染色

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨的退變丟失為基礎(chǔ)的多因素慢性疾病，在50歲以上人群中的發(fā)病率極高，僅次于心血管疾病居第二位[1]，容易造成患者的生活質(zhì)量降低，嚴(yán)重者可導(dǎo)致殘疾，給國(guó)家和家庭帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)，是一種與衰老密切相關(guān)的III型去乙酰化酶基因，在哺乳動(dòng)物中研究深入，近年來(lái)研究證實(shí)，SIRT1基因可以通過(guò)PI3K/AKT[2]、NF-κB[3]等信號(hào)通路的作用與OA相關(guān)聯(lián)，并在OA發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。我們前期研究證實(shí)，當(dāng)SIRT1基因條件性敲除后，OA發(fā)生更加明顯[4]，因此，在SIRT1基因條件性敲除的基礎(chǔ)上進(jìn)行OA的觀察效果更加明顯。在OA的相關(guān)研究中，病理學(xué)檢查用處較大，而各種染色技術(shù)因其能夠直觀反應(yīng)OA軟骨組織的形態(tài)學(xué)變化而經(jīng)常使用，不同染色技術(shù)在觀察OA關(guān)節(jié)軟骨切片中作用很大。

在以往OA相關(guān)的研究中，單獨(dú)染色或者幾種染料復(fù)合染色觀察OA軟骨組織的切片均有使用，但是觀察效果各不相同，很少有對(duì)單獨(dú)染色及復(fù)合染色的效果進(jìn)行分析對(duì)比，研究單獨(dú)染色與復(fù)合染色的區(qū)別以及各自的染色規(guī)律。為了探求不同的單獨(dú)染色與復(fù)合染色在觀察OA軟骨組織切片中的相關(guān)作用，我們?cè)谲浌墙M織SIRT1基因條件性敲除的小鼠基礎(chǔ)上，分析OA發(fā)生前后膝關(guān)節(jié)軟骨組織中各種單獨(dú)染色和復(fù)合染色對(duì)于膝關(guān)節(jié)軟骨組織的觀察效果，通過(guò)常規(guī)HE染色、番紅O-固綠染色、番紅O-阿利新藍(lán)染色、番紅O染色、固綠染色、阿利新藍(lán)染色6種單獨(dú)染色或復(fù)合染色方式探討OA關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)研究中的染色規(guī)律及應(yīng)用中的優(yōu)缺點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)B6;129-Sirt1tm1Ygu/J[5](SIRT1co/co)小鼠和FVB-Tg(Col2a1-cre/ERT) KA3Smac/J[6](Col2-CreERT2)小鼠，各3只雌性與3只雄性，12～13周齡，購(gòu)買自美國(guó)杰克遜實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)用小鼠飼養(yǎng)于北京大學(xué)/香港科技大學(xué)醫(yī)學(xué)中心深圳醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[SYXK(粵)2015-0106]SPF級(jí)屏障區(qū)域的PVC鼠籠內(nèi)，持續(xù)過(guò)濾通氣，自由飲食，清潔飲水，每日保持12 h光照/黑暗循環(huán)。實(shí)驗(yàn)流程和小鼠處理均遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)范，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2主要試劑與儀器

Fast green solution、safranin O solution購(gòu)自Scytek公司；蘇木素購(gòu)自廣州速聚生物有限公司；伊紅Y購(gòu)自行知生物科技有限公司；阿利新藍(lán)購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；中性樹(shù)膠購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

光學(xué)顯微鏡、組織自動(dòng)脫水機(jī)、組織自動(dòng)包埋機(jī)、石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；高壓滅菌器(日本Hirayama公司)；超凈臺(tái)(蘇凈集團(tuán)安泰公司)；鼠臺(tái)(河南省原陽(yáng)縣振華教學(xué)儀器公司)；顯微器械(上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器廠)；4℃冰箱(中國(guó)海爾公司)；體視顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 軟骨特異性敲除SIRT1基因小鼠的繁育

將SIRT1co/co小鼠與Col2-CreERT2小鼠交配，獲得Col2-CreERT2；SIRT1co/co小鼠，15個(gè)月月齡Col2-CreERT2；SIRT1co/co小鼠，腹腔注射他莫昔芬(10 mg/mL，1 mg/(mL·g)，每日1次，連續(xù)注射5 d),即獲得SIRT1cKO小鼠(SIRT1-/-小鼠)，從而更好的模擬OA在人群中的發(fā)病規(guī)律。基因敲除及鑒定方法參照本實(shí)驗(yàn)組前期研究[4]。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及膝關(guān)節(jié)OA模型的建立

他莫昔芬注射完畢7 d后，SIRT1-/-小鼠行右側(cè)膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶橫斷加內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)建立OA模型，左側(cè)膝關(guān)節(jié)僅切開(kāi)滑膜囊行假手術(shù)作為對(duì)照，手術(shù)后3個(gè)月建立膝關(guān)節(jié)OA模型。實(shí)驗(yàn)樣本分為2組：SIRT1-/-小鼠假手術(shù)組(n=6，A組)：SIRT1基因敲除，膝關(guān)節(jié)進(jìn)行假手術(shù)；SIRT1-/-小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組(n=6，B組)：SIRT1基因敲除，膝關(guān)節(jié)手術(shù)造成OA模型。具體方法參照本實(shí)驗(yàn)組前期研究[4]。

1.3.3 染色

HE染色：取膝關(guān)節(jié)，固定，脫鈣，包埋，切片，蘇木素染核15 min，流水沖洗1 min，靜水放置5 min，0.5%伊紅染液3 min，流水沖洗。

番紅O-固綠染色：取膝關(guān)節(jié)，固定，脫鈣，包埋，切片，番紅O染液滴染20 min，自來(lái)水洗10 s，60℃預(yù)熱固綠滴染30 s，蒸餾水急洗一次，番紅O染液復(fù)合染色10 min，自來(lái)水沖洗10 s。

番紅O-阿利新藍(lán)染色：取膝關(guān)節(jié)，固定，脫鈣，包埋，切片，番紅O染液滴染20 min，流水沖洗，阿利新藍(lán)染色液采用改良Lison法配制[7]，阿利新藍(lán)染液24 h，流水沖洗。

番紅O染色：取膝關(guān)節(jié)，固定，脫鈣，包埋，切片，番紅O染液滴染20 min，流水沖洗。

固綠染色：取膝關(guān)節(jié)，固定，脫鈣，包埋，切片，60℃預(yù)熱固綠滴染30 s，流水沖洗。

阿利新藍(lán)染色：取膝關(guān)節(jié)，固定，脫鈣，包埋，切片，阿利新藍(lán)染色液采用改良Lison法配制，阿利新藍(lán)染液24 h，流水沖洗。

2 結(jié)果

2.1軟骨整體情況

A組小鼠軟骨組織表面光滑平整，軟骨各層結(jié)構(gòu)清晰可以分辨，軟骨細(xì)胞數(shù)量較多，形態(tài)均一，散在分布，部分細(xì)胞可以看到細(xì)胞核，II型膠原分布較均勻，潮線平整光滑，位置適中，軟骨下骨形態(tài)清晰。B組小鼠軟骨組織表面凹凸不平，部分位置出現(xiàn)糜爛、缺損，甚至出現(xiàn)鈣化，軟骨各層結(jié)構(gòu)分辨不清，比較單一，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，大小不等，成簇分布，II型膠原遭到破壞，潮線扭曲不規(guī)則，出現(xiàn)前移，甚至有部分潮線可以看到血管通過(guò)，軟骨下骨形態(tài)分辨不清(圖1、2)。

2.2軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)

A組小鼠軟骨組織切片中，軟骨細(xì)胞的數(shù)量較多，形狀多為圓形或類圓形，大小均一，在軟骨各層中分布均勻，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，著色均勻。B組小鼠軟骨組織切片中，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，在不同軟骨層中數(shù)量有差異，細(xì)胞形狀大小不一，分布紊亂甚至成簇分布，細(xì)胞核著色變淺。在軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)的觀察方面，復(fù)合染色分辨更加清晰，對(duì)于不同細(xì)胞結(jié)構(gòu)著色有所差異，單獨(dú)染色只能通過(guò)同一顏色的深淺分辨細(xì)胞不同結(jié)構(gòu)。HE染色可以看到軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核為藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)為粉紅色；番紅O-固綠染色的細(xì)胞核為藍(lán)綠色，細(xì)胞質(zhì)淡紅色；番紅O-阿利新藍(lán)染色中細(xì)胞核為淡藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)淡紅色；而在單獨(dú)番紅O染色、固綠染色、阿利新藍(lán)染色中，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均為單一的顏色，僅深淺不同(圖1、2)。

2.3軟骨分層

A組小鼠的大部分切片中，能夠分清軟骨表層、移行層、輻射層和鈣化層，其中幾種復(fù)合染色更容易觀察到軟骨的四層結(jié)構(gòu)，在觀察效果上單獨(dú)染色要劣于復(fù)合染色，在不同單獨(dú)染色和復(fù)合染色中，各層面積有所不同。B組小鼠軟骨組織四層結(jié)構(gòu)分辨不清，由于表面的破壞使得部分軟骨層缺失，但是在B組小鼠軟骨組織的切片中，阿利新藍(lán)染色、番紅O染色這兩種單獨(dú)染色方式與其他單獨(dú)染色方式相比，在觀察軟骨組織缺失上表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)，缺少軟骨組織的地方兩種染料著色變淺，而在整體的觀察效果上，復(fù)合染色方式仍然優(yōu)于單獨(dú)染色方式。HE染色、番紅O-固綠染色、番紅O-阿利新藍(lán)染色這幾種復(fù)合染色中，可以看到以輻射層為中心向兩側(cè)分別產(chǎn)生顏色變化，而番紅O染色、固綠染色、阿利新藍(lán)染色這幾種單獨(dú)染色中顏色比較單一(圖1、2)。

2.4II型膠原纖維

II型膠原纖維是軟骨組織特異性的膠原纖維，能夠?qū)浌沁M(jìn)行定位，不同染色方式下II型膠原的著色不同。A組小鼠軟骨組織切片中，II型膠原可能僅由于小鼠年齡較大導(dǎo)致表達(dá)減少，整體破壞較輕，單獨(dú)染色中著色比較均勻，復(fù)合染色中可因顏色的差異進(jìn)行分辨。B組小鼠軟骨組織切片中，II型膠原則因?yàn)镺A的發(fā)生而破壞嚴(yán)重，單獨(dú)染色中著色變淺，復(fù)合染色中顏色單一。HE染色和番紅O染色中，該區(qū)域呈粉紅色；固綠染色、阿利新藍(lán)染色、番紅O-固綠染色和番紅O-阿利新藍(lán)染色中該區(qū)域呈藍(lán)綠色或淡藍(lán)色。但是由于染料數(shù)量的不同，與單獨(dú)染色相比，復(fù)合染色在分辨II型膠原中，由于顏色豐富效果更好(圖1、2)。

2.5潮線

潮線可以區(qū)分軟骨的深層和鈣化層，呈波浪狀。A組小鼠軟骨組織切片中，潮線完整光滑，位置適中，沒(méi)有血管通過(guò)。B組小鼠軟骨組織切片中，潮線扭曲不規(guī)則，出現(xiàn)中斷，發(fā)生前移，部分位置可以看到血管通過(guò)潮線。復(fù)合染色在觀察潮線的過(guò)程中優(yōu)勢(shì)更加明顯，能夠明顯看到潮線的形態(tài)以及周圍的各種結(jié)構(gòu)組織，單獨(dú)染色僅能部分區(qū)分潮線形態(tài)，甚至無(wú)法分辨潮線(圖1、2)。

2.6軟骨下骨

A組小鼠軟骨組織切片中，軟骨下骨較厚，染色均勻，結(jié)構(gòu)比較規(guī)律。B組小鼠軟骨組織切片中，軟骨下骨變薄，染色單一，結(jié)構(gòu)紊亂。在觀察效果上仍然是復(fù)合染色優(yōu)于單獨(dú)染色(圖1、2)。

注：A為HE染色；B為番紅O-固綠染色；C為番紅O-阿利新藍(lán)染色；D為番紅O染色；E為固綠染色；F為阿利新藍(lán)染色。圖1 SIRT1-/-小鼠假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)( ×400)Note.A is HE staining；B is Safranin O-fast green staining；C is Safranin O-alcian blue staining；D is Safranin O staining；E is fast green staining；F is Alcian Blue staining.Fig.1 Morphology of knee joint cartilage in the SIRT1-/-mice control group

注：A為HE染色；B為番紅O-固綠染色；C為番紅O-阿利新藍(lán)染色；D為番紅O染色；E為固綠染色；F為阿利新藍(lán)染色。圖2 SIRT1-/-小鼠骨關(guān)節(jié)炎模型組膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)( ×400)Note.A is HE staining；B is Safranin O-fast green staining；C is Safranin O-alcian blue staining；D is Safranin O staining；E is fast green staining；F is Alcian Blue staining.Fig.2 Morphological changes of knee joint cartilage in the SIRT1-/- mouse OA model group

3 討論

OA是一種與衰老、肥胖、遺傳等因素密切相關(guān)的慢性退行性疾病，病理特點(diǎn)是嚴(yán)重的、局限性軟骨破壞，深達(dá)骨質(zhì)，臨床上也出現(xiàn)相應(yīng)的癥狀。SIRT1基因因與衰老關(guān)系密切而參與到OA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，并且可以通過(guò)PI3K/AKT[2]、NF-κB[3]等信號(hào)通路的作用影響到OA的進(jìn)程，當(dāng)小鼠軟骨組織中SIRT1基因條件性敲除之后，可以加重OA的發(fā)生發(fā)展，從而更加有利于觀察OA軟骨組織的切片情況。因此，我們利用軟骨組織SIRT1基因特異性敲除的小鼠膝關(guān)節(jié)OA模型，觀察不同單獨(dú)染色及復(fù)合染色在觀察OA軟骨組織切片中的效果，為后續(xù)研究提供便利的條件。

蘇木素是一種堿性染料，從洋蘇木中提取，氧化后可生成蘇木精，可將酸性成分染成藍(lán)色。而伊紅是一種酸性染料，可將細(xì)胞漿、結(jié)締組織等染成紅色或粉紅色。蘇木素常與伊紅同時(shí)使用，作為病理學(xué)中常規(guī)的HE染色，用于與其他染色方式進(jìn)行對(duì)照。阿利新藍(lán)是一種大分子共軛染料，該染料帶有陽(yáng)離子，可與酸性基團(tuán)相結(jié)合，從而形成不溶性復(fù)合物[8]。在軟骨組織中，阿利新藍(lán)可以與黏多糖結(jié)合，將軟骨細(xì)胞及軟骨基質(zhì)染成淺藍(lán)色，從而對(duì)軟骨組織特異性著色。番紅O是一種堿性染料，可與蛋白多糖結(jié)合，而軟骨組織是一種嗜酸性的組織，與番紅O結(jié)合后軟骨基質(zhì)及軟骨細(xì)胞特異性的紅染。固綠則為一種酸性染料，可與蛋白結(jié)合，并與嗜酸性的骨結(jié)合形成藍(lán)綠色[9]。不同染色方法因染料的不同而具有一定的特異性，從而使物質(zhì)顯現(xiàn)出不同的效果，鑒于我們以往研究中發(fā)現(xiàn)，在軟骨組織中觀察比較多的幾個(gè)結(jié)構(gòu)分別為軟骨細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、軟骨分層結(jié)構(gòu)的情況、II型膠原纖維的顯示、潮線及軟骨下骨的分辨作為對(duì)比重點(diǎn)，用于研究幾種單獨(dú)染色及復(fù)合染色的效果。

我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)，SIRT1基因敲除后OA發(fā)生時(shí)，軟骨組織破壞嚴(yán)重，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)不一，分布紊亂，細(xì)胞結(jié)構(gòu)難以觀察，軟骨層變薄，四層結(jié)構(gòu)更難分辨，II型膠原破壞，染色面積減少，潮線扭曲不規(guī)則，發(fā)生前移，部分位置有血管通過(guò)，軟骨下骨變薄，結(jié)構(gòu)不規(guī)律。復(fù)合染色在整體觀察效果上優(yōu)于單獨(dú)染色，在軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)、軟骨分層、II型膠原和軟骨下骨的觀察上，復(fù)合染色由于多種染料的存在，使不同結(jié)構(gòu)或者部位著色不同，更容易區(qū)分辨別不同的結(jié)構(gòu)及部位。例如在軟骨細(xì)胞的觀察中，HE染色可以看到軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核為藍(lán)紫色，細(xì)胞質(zhì)為粉紅色；番紅O-固綠染色的細(xì)胞核為藍(lán)綠色，細(xì)胞質(zhì)淡紅色；番紅O-阿利新藍(lán)染色中細(xì)胞核為淡藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)淡紅色；而在單獨(dú)番紅O染色、固綠染色、阿利新藍(lán)染色中，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均為單一的顏色。在軟骨分層的觀察中，復(fù)合染色可以看到以輻射層為中心向兩側(cè)分別產(chǎn)生顏色變化，單獨(dú)染色中顏色則比較單一。在潮線的觀察上，復(fù)合染色效果也優(yōu)于單獨(dú)染色，復(fù)合染色可在潮線處因顏色的交替呈現(xiàn)出明顯的界線，從而更好的反應(yīng)潮線情況，單獨(dú)染色則沒(méi)有這個(gè)優(yōu)勢(shì)。然而，單獨(dú)染色也有其一定的好處，比如在觀察軟骨組織的缺失方面，阿利新藍(lán)染色和番紅O染色中，缺失軟骨處顏色變淺甚至消失，比其他單獨(dú)染色和復(fù)合染色更加明顯。另外，單獨(dú)染色所用試劑較少，與復(fù)合染色相比，價(jià)格低、操作簡(jiǎn)單，而且染色成功的幾率更高。

綜上所述，不同的單獨(dú)染色及復(fù)合染色，在觀察SIRT1基因敲除小鼠膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織切片時(shí)有不同特點(diǎn)，番紅O-固綠染色、番紅O-阿利新藍(lán)染色在觀察軟骨細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、軟骨分層結(jié)構(gòu)的情況、II型膠原纖維的顯示、潮線及軟骨下骨的改變中，效果更好；而番紅O染色、固綠染色在觀察軟骨組織缺失方面有一定的優(yōu)勢(shì)；固綠染色單獨(dú)使用效果不如前幾種染色好。在研究中，應(yīng)該結(jié)合實(shí)驗(yàn)室的研究條件、經(jīng)費(fèi)、實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)短等多種因素綜合選擇染色方法，以得到預(yù)期的效果。

[1] Felson DT, Zhang Y. An update on the epidemiology of knee and hip osteoarthritis with a view to prevention[J]. Arthritis Rheum, 1998, 41: 1343-1355.

[2] Yu F, Zeng H, Lei M, et al. The effects of SIRT1 gene knock-out through the activation of SREBP2 protein mediated PI3K/AKT signal pathway on osteoarthritis in mice[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci,2016,36(5):683-690.

[3] Lei M, Wang JG, Xiao DM, et al. Resveratrol inhibits interleukin 1β-mediated inducible nitric oxide synthase expression in articular chondrocytes by activating SIRT1 and thereby suppressing nuclear factor-κB activity[J].Eur J Pharmacol, 2012, 674(2-3):73-79.

[4] 于斐,雷鳴,曾暉,等.高齡小鼠沉默信息調(diào)節(jié)因子1基因敲除后膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎模型的建立[J].中國(guó)組織工程研究雜志,2015,19(49):7895-7901.

[5] Bonzo, Brocker C, Jiang C, et al. Hepatic sirtuin 1 is dispensable for fibrate-induced peroxisome proliferator-activated receptor-α function in vivo[J]. Am J Physiol Endocrinol Metab, 2014, 306(7): E824-837.

[6] Nakamura, Nguyen MT, Mackem S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton[J]. Dev Dyn, 2006, 235(9): 2603-2612.

[7] 李彥會(huì),劉永春,史敏.三種阿利新藍(lán)染色方法效果觀察[J].河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,26(6):464.

[8] 張巧全,余年,林興建,等.阿利新藍(lán)染色對(duì)腦膜癌的診斷價(jià)值[J].臨床神經(jīng)病學(xué)雜志,2015,28(1):46-48.

[9] 姬瑞娟,孫愛(ài)軍,施麗英,等.番紅O-固綠染色在關(guān)節(jié)組織學(xué)應(yīng)用的改進(jìn)[J].解剖學(xué)雜志，2011,34(5):716-718.

ObservationofthearticularcartilageofosteoarthritisinSIRT1geneknock-outmicethroughsinglestainingandcompoundstaining

YU Hong-yan1， YANG Zhan-dong1， YANG Qi2， YU Fei3*

(1.Binchengqu Shili Hospital,Binzhou 256600,China； 2.Air Force General Hospital,Beijing 100142； 3.Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen 518036)

ObjectiveTo establish osteoarthritis model of the knee joint in mice on the basis of knocking outSIRT1 gene and to observe the differences in the morphology of the cartilage tissue using single staining and compound staining.MethodsThe knee joint specimens were divided into two groups:SIRT1-/-control group (group A,n=6) andSIRT1-/-osteoarthritis model group (group B,n=6). The knee anterior cruciate ligament was traversed, and the ipsilateral medial meniscus was cut to establish an osteoarthritis model of knee joint. HE staining, safranin O-fast green staining, safranin O-alcian blue staining, safranin O staining, fast green staining, alcian blue staining were used to observe the morphological changes in the articular cartilage of the knee.ResultsSafranin O-fast green staining and safranin O-alcian blue staining showed better results in observation of the morphology of chondrocytes, the structure of cartilage layers, the presence of type II collagen, tide line and the changes of subchondral bone. While the safranin O staining and alcian blue staining had certain advantages in the observation of the defects of cartilage tissue.ConclusionsCompared with the single staining, the compound staining used in this study have obvious advantages in obtaining useful information of the cartilage structure in the observation of morphology of cartilage tissues inSIRT1 gene knock-out mice.

SIRT1 gene; Gene knockout; Mouse model; Osteoarthritis; Single staining; Compound staining

R-33

A

1671-7856(2017) 10-0034-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.10.007

2017-02-07

廣東省自然科學(xué)基金-博士啟動(dòng)項(xiàng)目(2016A030310070)；深圳市科創(chuàng)委資助項(xiàng)目(JCYJ20160428173412866)。

于紅燕(1965-)，女，副高，研究生。E-mail: 434674348@qq.com

于斐(1989-)，男，研究生。研究方向：骨關(guān)節(jié)炎、骨科生物材料。E-mail: oscarfyu@163.com