多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)選丹參川芎復(fù)方的提取工藝

施天慧，江 華

（1.江蘇省南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 南通 226010； 2.江蘇省啟東市人民醫(yī)院，江蘇 南通 226200）

多指標(biāo)正交試驗(yàn)優(yōu)選丹參川芎復(fù)方的提取工藝

施天慧1，江 華2

（1.江蘇省南通衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 南通 226010； 2.江蘇省啟東市人民醫(yī)院，江蘇 南通 226200）

目的優(yōu)選丹參、川芎復(fù)方中藥的最佳提取工藝。方法以丹參酮ⅡA、阿魏酸和干膏得率為醇提工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)，丹酚酸B和干膏得率為水提工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)法篩選最佳提取工藝。結(jié)果丹參、川芎飲片，加8倍量的80%乙醇，提取3次，每次1.5 h。醇提后的藥渣揮干乙醇，加8倍量的水，提取3次，每次1.5 h，濾過，合并水煎液，濃縮至相對(duì)密度為1.10（60℃熱測(cè)），室溫放置，加95%的乙醇使含醇量達(dá)65%，靜置過夜，抽濾，回收乙醇至無醇味。結(jié)論通過正交試驗(yàn)優(yōu)選的丹參川芎復(fù)方提取工藝穩(wěn)定、可行，有效成分提取率高，可為工業(yè)化生產(chǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

丹參；川芎；丹參酮ⅡA；丹酚酸B；阿魏酸；提取工藝；正交試驗(yàn)

丹參具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩的功效[1]。川芎有活血行氣、祛風(fēng)止痛的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)，丹參具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、增加心肌供血量和供氧量、降低心肌耗氧量、抗肝纖維化的作用，其中以脂溶性丹參酮為代表的醌類化合物具有明顯的抗炎作用，而以丹參酚酸類為主的水溶性成分是治療心血管疾病的主要成分[2－3]。川芎也具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠狀動(dòng)脈血流量、降低心肌耗氧量的作用，其中起主要作用的是生物堿和酚性成分[4－5]。丹參、川芎合用作為治療冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ê?jiǎn)稱冠心?。?、心絞痛、腦梗死的重要活血化瘀藥，配伍使用后能增加冠狀動(dòng)脈流量、提高缺血組織內(nèi)氧分壓、改善微循環(huán)、縮小梗死范圍，是心腦血管成方制劑處方必不可少的藥物[6－10]。本研究中以乙醇提取脂溶性成分，再取藥渣以水提取水溶性成分，通過正交試驗(yàn)，以丹參酮ⅡA、阿魏酸的提取量及干膏得率為醇提工藝指標(biāo)，以丹酚酸B的提取量和干膏得率為水提工藝指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)選，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，確定丹參與川芎的最佳提取工藝，以期為制劑開發(fā)、大生產(chǎn)工藝提供有益的實(shí)驗(yàn)室依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Aglient 1200型高效液相色譜儀系統(tǒng)，DAD檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫公司）；Sartorius BT125D型天平(精度為0.01 mg，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；HH－2型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州國(guó)華電器有限公司）；DW－2型調(diào)溫電熱器（南通市通州申通電熱器廠）；ZK－82B型真空干燥箱（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司）；SENCOR－301型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申順生物科技有限公司）；SHB－Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；H66025T型超聲波清洗器（無錫超聲電子設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥

丹參（產(chǎn)地江蘇，徐州彭祖中藥飲片有限公司，批號(hào)為130725），川芎（產(chǎn)地四川，徐州彭祖中藥飲片有限公司，批號(hào)為131016），經(jīng)中國(guó)藥科大學(xué)中藥學(xué)院王強(qiáng)教授鑒定為唇形科植物丹參 Salvia miltiorrihiza Bge.的干燥根和根莖，傘形科植物川芎 Ligusticun chuanxiong Hort.干燥根莖；丹酚酸 B對(duì)照品（批號(hào)為 111562－201313），丹參酮ⅡA對(duì)照品（批號(hào)為 110766－200416），阿魏酸對(duì)照品（批號(hào)為110773－201313），均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 篩選指標(biāo)確定

由于有效成分為脂溶性和水溶性，所以考慮先以乙醇提取脂溶部分，再取藥渣以水提取水溶性部分。以丹參酮ⅡA、阿魏酸的提取量及干膏得率為醇提工藝指標(biāo)；丹酚酸B的提取量和干膏得率為水提工藝指標(biāo)。

2.2 醇提工藝優(yōu)選

2.2.1 因素水平設(shè)計(jì)

根據(jù)文獻(xiàn)及預(yù)試驗(yàn)，以丹參酮ⅡA、阿魏酸的提取量及浸膏得率[11－15]為考察指標(biāo)，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、溶劑量（B）、提取時(shí)間（C）、提取次數(shù)（D）對(duì)提取效果的影響。因素水平見表1。

表1 丹參川芎醇提因素水平表

2.2.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)以上因素水平，安排 L9（34）正交設(shè)計(jì)表。稱取丹參川芎飲片9份各適量（丹參與川芎比為6∶5），按正交設(shè)計(jì)表的試驗(yàn)條件進(jìn)行提取，過濾，藥液回收乙醇減壓濃縮至100 mL，備用。

2.2.3 干膏得率測(cè)定

精密量取2.2.2項(xiàng)下的濃縮液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在低溫蒸干后，減壓干燥至恒重，精密稱定，計(jì)算干膏得率。

2.2.4 丹參酮ⅡA含量測(cè)定

色譜條件[16]：色譜柱為 Diamonsil－C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇 － 水（75 ∶25）；檢測(cè)波長(zhǎng)為 270 nm；流速為 1 mL／min；柱溫為 20℃；進(jìn)樣量為25 μL。理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

對(duì)照品溶液制備：稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品2.50 mg，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。

供試品溶液制備：稱取干燥的9份樣品各適量，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，超聲溶解，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，過濾，吸取續(xù)濾液1 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，即得。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取對(duì)照品貯備液0.2，2.0，4.0，6.0，8.0 mL，置 100 mL 容量瓶中，定容至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣 25 μL，以質(zhì)量濃度（C，g／L）為橫坐標(biāo)，以峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為 A＝69 753.6＋677 501 992.1C，r＝0.999 9(n＝5)，質(zhì)量濃度線性范圍為 0.1 ～4.0 μg ／mL。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液，按色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積值的 RSD為0.10%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批提取液干膏，依法制備供試品溶液，按色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果丹參酮ⅡA峰面積的 RSD為0.85%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果丹參酮ⅡA峰面積的 RSD為0.55%(n＝6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批提取液干膏6份，精密稱定，分別加入對(duì)照品適量，按供試品溶液制備方法制備溶液，按色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果丹參酮ⅡA的平均回收率為100.30%，RSD為0.44%（n＝6）。

2.2.5 阿魏酸含量測(cè)定

色譜條件[1]：色譜柱為 Diamonsil－C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇 －1%醋酸水溶液（30∶70）；檢測(cè)波長(zhǎng)為321 nm；流速為1 mL／min；柱溫為25℃；進(jìn)樣量為25 μL。理論板數(shù)按阿魏酸峰計(jì)算應(yīng)不低于4 000。

對(duì)照品溶液制備：稱取阿魏酸對(duì)照品 1.00 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，即得對(duì)照品貯備液。

供試品溶液制備：稱取干燥的9份樣品各適量，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度，超聲溶解，搖勻，微孔濾膜濾過，即得。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取 0.5，1.0，1.5，2.0，5.0 mL，置10 mL容量瓶中，加70%甲醇至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣 25 μL，以質(zhì)量濃度（C，g／L）為橫坐標(biāo)、峰面積(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為 A＝58.378 6＋95 285.630 4 C，r＝0.999 9(n＝5)，質(zhì)量濃度線性范圍為 5 ～50 μg／mL。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一阿魏酸對(duì)照品溶液，按色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積值的 RSD為0.48%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同批提取液干膏，依法制備供試品溶液，按色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果阿魏酸峰面積的RSD為0.10%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，12 h 時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果阿魏酸峰面積的 RSD為0.22%(n＝6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批提取液干膏6份，精密稱定，分別加入對(duì)照品適量，按供試品溶液制備方法制備溶液，按色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果阿魏酸的平均回收率為 102.40%，RSD為1.43%（n＝6）。

2.2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

按L9（3）4正交試驗(yàn)條件進(jìn)行煎煮提取，共得到9份醇提液，測(cè)定丹參酮ⅡA、阿魏酸含量和干膏得率。結(jié)果見表2，方差分析見表3。由表 2可見，得膏率的極差數(shù)據(jù) RD＞ RA＞ RC＞ RB，優(yōu)先順序?yàn)?D＞A＞C＞B，A1B1C1D1較佳；從丹參酮ⅡA得率來看，優(yōu)先順序?yàn)锳＞C＞B＞D，A3B1C1D1較佳；從阿魏酸得率來看，A＞C＞D＞B，A2B1C1D1較佳。由表3可見，因素B對(duì)得膏率和阿魏酸得率影響均不大，為節(jié)省加熱、濃縮的時(shí)間及溶劑，選擇B2。綜合三者，選擇 A2B2C1D1。即以 8倍量 80%的乙醇提取 3 次，每次 1.5 h。

2.3 水提工藝優(yōu)選

2.3.1 因素水平設(shè)計(jì)

以丹酚酸B及干浸膏得率[11－16]為考察指標(biāo)，考察加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）、浸泡時(shí)間（D）對(duì)提取的影響。因素水平見表4。

表2 丹參川芎醇提工藝優(yōu)選正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 丹參川芎醇提工藝優(yōu)選方差分析表

表4 丹參川芎水提因素水平表

2.3.2 試驗(yàn)方法

根據(jù)以上因素水平，安排 L9（34）正交設(shè)計(jì)表。將前一步醇提后的藥渣按正交表的條件進(jìn)行煎煮，合并水提液，過濾，減壓濃縮至100 mL，備用。

2.3.3 干膏得率測(cè)定

精密量取2.3.2項(xiàng)下的濃縮液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，減壓干燥至恒重，精密稱定，計(jì)算干膏得率。

2.3.4 含量測(cè)定

色譜條件[1]：色譜柱為 Diamonsil－C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈 － 0.1% 磷酸（22 ∶78）；流速為 1.2 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)為 286 nm；柱溫為 20℃；進(jìn)樣量為25 μL。理論板數(shù)按丹酚酸B峰計(jì)算應(yīng)不低于6 000。

對(duì)照品溶液配制：稱取丹酚酸B對(duì)照品5.00 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加甲醇 －水（8∶2）混合溶液，超聲溶解，放置至室溫后，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液配制：取9份樣品各適量，置25 mL容量瓶中，加甲醇－水（8∶2）混合溶液至刻度，超聲溶解，搖勻，過濾，取續(xù)濾液1 mL于10 mL容量瓶中，加甲醇－水（8∶2）混合溶液至刻度，搖勻，微孔濾膜濾過，即得。

線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品溶液 0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，0.80 mL 置 1 mL 容量瓶中，加甲醇 －水（8 ∶2）稀釋至刻度，進(jìn)樣 25 μL，按上述色譜條件測(cè)定，以質(zhì)量濃度（g／L）為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程為 A＝16 412.771 2 C－58.209 3， r＝0.999 8(n＝6)，質(zhì)量濃度線性范圍為25 ～ 400 μg ／mL。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一丹酚酸B對(duì)照品溶液，按色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積值的 RSD為0.10%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批提取液干膏，依法制備供試品溶液，按色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果丹酚酸B峰面積的 RSD為0.33%(n＝6)，表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果丹酚酸 B峰面積的RSD為0.70%(n＝6)，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批提取液干膏6份，精密稱定，分別加入對(duì)照品溶液適量，按供試品溶液制備方法制備溶液，按色譜條件進(jìn)樣，測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果丹酚酸B的平均回收率為97.83%，RSD為0.45%（n＝6）。

2.3.5 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

按 L9（3）4正交試驗(yàn)條件進(jìn)行煎煮提取，共得到9份水提液，測(cè)定丹酚酸B和干膏得率。結(jié)果見表5，方差分析見表6。由表5可見，得膏率的極差數(shù)據(jù)RB＞RC＞RD＞RA，優(yōu)先順序?yàn)?B＞C＞D＞A，A3B1C2D3最佳；從丹酚酸B的得率來看，優(yōu)先順序?yàn)?C＞B＞D＞A，A2B2C2D3最佳；由表6可見，因素A對(duì)得膏率和丹酚酸B得率影響不大。為節(jié)省濃縮時(shí)間選擇 A2，綜合兩者選擇A2B2C2D3。即加8倍量水，浸泡60 min，提取3次，每次1.5 h。

表5 丹參川芎水提工藝優(yōu)選正交試驗(yàn)結(jié)果

表6 丹參川芎水提工藝優(yōu)選方差分析表

2.4 醇沉工藝考察

2.4.1 醇沉含量選擇

取110 g藥材，按最佳提取工藝先醇提后水提，精密吸取水浴濃縮至相對(duì)密度為1.10（60℃熱測(cè)）的樣品溶液3份各適量，加入95%乙醇使含醇量分別為55%，65%和75%，靜置過夜，濾過，濾液減壓回收乙醇，真空干燥至恒重，得干膏，計(jì)算得膏率。干膏用甲醇－水（8∶2）混合溶液溶解，置25 mL容量瓶中，加甲醇－水（8∶2）混合溶液至刻度，搖勻，吸取 1 mL，置 10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，作為供試品溶液，測(cè)定丹酚酸B含量。結(jié)果見表7。綜合考慮，選擇65%醇沉濃度最宜。

表7 醇沉工藝含醇量?jī)?yōu)選試驗(yàn)結(jié)果

2.4.2 濃縮液密度選擇

取相對(duì)密度分別為 1.05，1.10 和 1.15（60 ℃熱測(cè)）的樣品溶液各適量，置三角瓶中，加入95%乙醇使含醇量為65%，靜置過夜，濾過，濾液減壓回收乙醇，真空干燥至恒重，得干膏，計(jì)算得膏率。干膏用甲醇－水（8∶2）混合溶液溶解，于25 mL容量瓶中，加甲醇－水（8∶2）混合溶液至刻度，搖勻，吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，稀釋至刻度，作為供試品溶液，測(cè)定丹酚酸B含量。結(jié)果見表8。綜合考慮，選擇加工溶液濃縮到相對(duì)密度為1.1（60 ℃熱測(cè)）。

表8 醇沉工藝濃縮液密度優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果

2.5 最佳工藝確定

取丹參川芎飲片，加8倍量的80%乙醇，提取3次，每次1.5 h。醇提后的藥渣揮干乙醇，加8倍量的水，提3次，每次 1.5 h，濾過，合并水煎液，濃縮至相對(duì)密度 1.10（60℃熱測(cè)），放置室溫，加 95%的乙醇使含醇量達(dá)65%，靜置過夜，抽濾，回收乙醇至無醇味，即得。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn)

為確定優(yōu)選工藝的優(yōu)劣和穩(wěn)定性，平行稱取3份飲片，根據(jù)最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果見表9，表明該工藝合理可行、穩(wěn)定可靠。

表9 最佳工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

丹參是本復(fù)方中的君藥，其中含量較多且具顯著藥效的成分分別為水溶性丹酚酸B和脂溶性丹參酮ⅡA。川芎中含揮發(fā)油、生物堿、酚酸等多種成分，其中酚酸類成分阿魏酸具有清除氧自由基、抗血小板聚集、改善微循環(huán)等作用；生物堿類成分川芎嗪含量很少，且易升華；揮發(fā)油類 本內(nèi)酯在提取過程中又易揮發(fā)。本研究中發(fā)現(xiàn)，將丹參川芎配伍使用，可促進(jìn)丹酚酸B分布更廣泛、消除減緩、體內(nèi)作用時(shí)間延長(zhǎng)，能促使阿魏酸的血藥濃度提高、體內(nèi)清除加快[6]。因此，選擇丹酚酸B、阿魏酸和丹參酮ⅡA作為提取工藝評(píng)價(jià)指標(biāo)性成分。

藥材采用先醇提后水提的方法，醇提干浸膏得率在30%左右。水提后浸膏得率較高，由于水提部分成分復(fù)雜，制得的干膏引濕性強(qiáng)，故將水提液濃縮為浸膏后再采用醇沉法去除大量水溶性雜質(zhì)，干膏得率降低，在14%左右。水提醇沉后對(duì)丹酚酸B含量影響不大，還可減少用藥量，便于制劑后減少用藥劑量提高患者用藥依從性。提取過程中應(yīng)注意，有效成分丹參酮ⅡA、丹酚酸B在濕熱條件下易降解變質(zhì)，故提取后的浸膏宜真空干燥，且溫度不宜過高。藥材水提液濃縮后加入乙醇沉淀雜質(zhì)時(shí)，乙醇應(yīng)邊攪拌邊緩緩加入，否則會(huì)導(dǎo)致局部乙醇濃度過高，形成絮狀沉淀，不利于過濾并會(huì)影響醇沉效果。

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Optimization of Extraction Process forRadix Salviae Miltiorrhizae and Ligusticum Chuanxiong by Multi－Index Orthogonal Test

Shi Tianhui1，Jiang Hua2
（1.Nantong Health Vocational School of Jiangsu Province，Nantong，Jiangsu，China 226010； 2.Qidong People′s Hospital，Nantong，Jiangsu，China 226200）

Objective To optimize the best extraction process forRadix Salviae miltiorrhizae and Ligusticum chuanxiong.Methods The tanshinoneⅡA，ferulic acid and dry extract yield were taken as the evaluation indexes of ethanol extraction process，the salvianolic acid B and dry extract yield were taken as the evaluation indexes of water extraction process，the optimum extraction process was screened by orthogonal test.Results The optimum extraction process of Radix Salviae Miltiorrhizae and Ligusticum Chuanxiong was adding 8 times amount of 80% alcohol，refluxing and extracting for 3 times，1.5 h each time.The residue was adding 8 times amount of water，refluxing and extracting for 3 times，1.5 h each time，then concentrating the water extraction to ρ ＝ 1.10(determined at 60 ℃ )，letting it at room temperature and adding 95% alcohol to 65% ，standing overnight，filtration，recycling ethanol to no alcohol flavor.Conclusion The optimized extraction process of Radix Salviae miltiorrhizae and Ligusticum chuanxiong by orthogonal test is stable and feasible，and the extraction rate of effective ingredients is high，which can provide experimental basis for industrial production.

Salvia miltiorrihiza； Ligusticun chuanxiong；tanshinoneⅡA；salvianolic acid B；phenolic acid；extraction process;orthogonal test

TQ460.6；R284.2

A

1006－4931(2017)20－0029－05

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.008

施天慧（1980－），女，江蘇南通人，碩士研究生，講師，執(zhí)業(yè)藥師，主要從事藥學(xué)專業(yè)教學(xué)工作，（電話）0513－51083102（電子信箱）55348482＠ qq.com。

2017－06－06)