鹵素水分測定法結(jié)合高效液相色譜法優(yōu)選婦科灌腸液提取工藝的研究

劉鳳樂 ，邱 遜 ，高文全 ，王蕊蕊 ，趙桂芬 ，楊 磊 ，趙愛梅

（1.云南省大理白族自治州中醫(yī)醫(yī)院，云南 大理 671000； 2.云南省大理市第一人民醫(yī)院，云南 大理 671000）

鹵素水分測定法結(jié)合高效液相色譜法優(yōu)選婦科灌腸液提取工藝的研究

劉鳳樂1，邱 遜1，高文全1，王蕊蕊1，趙桂芬1，楊 磊2，趙愛梅1

（1.云南省大理白族自治州中醫(yī)醫(yī)院，云南 大理 671000； 2.云南省大理市第一人民醫(yī)院，云南 大理 671000）

目的優(yōu)選婦科灌腸液的提取工藝。方法采用鹵素水分測定法和高效液相色譜（HPLC）法，以浸膏得率和鹽酸小檗堿含量為指標(biāo)，通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，對提取工藝中加水量（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）3個(gè)因素進(jìn)行考察，以優(yōu)選最佳提取工藝。結(jié)果最佳提取工藝條件為加10倍量水，煎煮3次，每次1 h。結(jié)論該方法可作為婦科灌腸液的提取工藝。

婦科灌腸液；正交試驗(yàn)；提取工藝；鹽酸小檗堿；浸膏得率

婦科灌腸液是根據(jù)云南省大理白族自治州中醫(yī)醫(yī)院臨床驗(yàn)方研制的院內(nèi)中藥制劑，由黃柏、苦參、魚腥草、丹參、川芎、敗醬草、薏苡仁等中藥組方，具有活血化瘀、清熱利濕、理氣止痛之功效，臨床應(yīng)用10多年，主要用于治療急慢性盆腔炎。方中黃柏為君藥，其味苦，性寒，歸腎、膀胱、大腸經(jīng)，功能清熱燥濕、瀉火解毒、除骨蒸，用于治療濕熱帶下、熱淋澀痛、濕熱瀉痢、黃疸、瘡瘍腫毒，濕疹瘙癢等癥[1]。大量研究表明，黃柏具有廣泛的抗菌、抗炎、抗氧化、抗癌等生物學(xué)和藥理活性，鹽酸小檗堿是其主要有效成分之一[2－6]。本試驗(yàn)中參考文獻(xiàn)[7－8]，以浸膏得率、鹽酸小檗堿含量為提取工藝指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選其提取工藝[9－10]，為研究制劑的成型工藝提供試驗(yàn)依據(jù)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，配G1311B四元梯度泵，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱，G1315D二極管陣列檢測器(美國安捷倫科技有限公司）；AR423DCN型電子天平，DV215CD型電子分析天平，MB45型鹵素水分測定儀（美國奧豪斯儀器有限公司）；C21－ST2118型電磁爐（廣東美林生活電器有限公司）；PS－30型超聲波清洗儀（深圳市潔康洗凈電器有限公司）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為110713－201212）；中藥材購于云南白藥集團(tuán)股份有限公司中藥飲片分公司，經(jīng)云南省大理白族自治州中醫(yī)醫(yī)院趙愛梅副主任藥師鑒定，均符合2015年版《中國藥典（一部）》標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定；乙腈（色譜純，美國天地公司）；甲醇（色譜純，美國飛世爾公司）；磷酸（分析純，天津福晨化學(xué)試劑廠）；水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸小檗堿含量測定

2.1.1 色譜條件[11－12]

色譜柱：Zorbax SB －C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A） －0.2% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫，0～24 min，10% ～50%A；流速：1 mL ／min；柱溫：30℃；檢測波長：265 nm；進(jìn)樣體積：5 μL。

2.1.2 溶液制備

對照品溶液：稱取鹽酸小檗堿對照品9.97 mg，精密稱定，置 10 mL容量瓶中，加鹽酸 －甲醇（1∶100）定容至刻度，搖勻，制成對照品母液。再吸取對照品母液1 mL，置 10 mL容量瓶中，加鹽酸 －甲醇（1∶100）定容至刻度，搖勻，制成含量為0.099 7 g／mL的對照品溶液。

供試品溶液：依處方組成配比稱取藥材，平行稱取9 份，浸泡 30 min，按 L9（34）試驗(yàn)表進(jìn)行煎煮提取，提取液濾過，合并濾液，濃縮，定容，作為樣品溶液。精密吸取樣品溶液10 mL，至具塞磨口玻璃瓶中，再加入15 mL鹽酸 － 甲醇（1 ∶100），振搖，稱定質(zhì)量，超聲 30 min，再稱定質(zhì)量，補(bǔ)足減失的質(zhì)量。吸取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得各提取液的供試品溶液。

陰性對照品溶液：精密吸取缺黃柏的陰性樣品溶液10 mL，按供試品溶液制備方法制備缺黃柏的陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：精密吸取 2.1.2項(xiàng)下 3種溶液各5 μL，照 2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果供試品溶液色譜中鹽酸小檗堿與相鄰色譜峰分離度＞1.5，理論板數(shù)按鹽酸小檗堿計(jì)算不低于50 000，陰性對照無干擾，詳見圖1。

線性關(guān)系考察：精密吸取 2.1.2項(xiàng)下對照品溶液(0.099 7 g ／mL)，按 2.1.1 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣 1，3，5，7，9，11 μL，測定峰面積，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程Y＝4 310.9 X＋20.326， r＝1.000 0(n＝6)，進(jìn)樣量線性范圍為 0.099 7 ～ 1.096 7 μg。

精密度試驗(yàn)：精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液5 μL，連續(xù)進(jìn)樣 6 次。結(jié)果的 RSD 為 0.70%(n ＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取正交試驗(yàn)7號樣品溶液10 mL，制備供試品溶液，按照 2.1.1項(xiàng)下色譜條件，分別于 0，2，4，6，12，24 h 時(shí)進(jìn)樣 5 μL。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的 RSD為0.65%(n＝6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密吸取正交6號樣品溶液，平行制備6份供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測定。結(jié)果鹽酸小檗堿含量均值為 97.72 μg／mL， RSD 為1.69%(n＝6)，表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：精密吸取已知含量的樣品溶液（鹽酸小檗堿含量為 0.135 g／L）2 mL，共 9 份，置 10 mL 棕色瓶中，分別精密加入低、中、高質(zhì)量濃度的鹽酸小檗堿對照品溶液（0.56 g ／mL）0.4，0.5，0.6 mL 各 3 份，制備供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果鹽酸小檗堿的平均加樣回收率分別為98.00%，97.00%和99.00% ，RSD 分別為 0.82%，0.63% 和 1.22%(n ＝9)，表明方法的回收較好。

圖1 婦科灌腸液高效液相色譜圖

2.2 水提工藝條件優(yōu)選

2.2.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)煎煮法的條件選擇加水量（因素A）、提取時(shí)間（因素B）及提取次數(shù)（因素C）3個(gè)條件為考察因素，各因素根據(jù)實(shí)際情況均取3個(gè)水平，以提取物鹽酸小檗堿含量和干浸膏得率為評價(jià)指標(biāo)，用 L9（34）安排試驗(yàn)，因素水平表見表1。

表1 水提工藝條件優(yōu)選因素水平表

2.2.2 浸膏得率測定

分別精密吸取9組正交樣品溶液1 mL，分別置鹵素水分測定儀，按已設(shè)定測量條件（溫度程序：階梯；干燥溫度：0～4 min，升至 200℃，4 min后降至 105℃；關(guān)閉模式：60 min；測量時(shí)間：5 min），測出含水量，計(jì)算浸膏得率。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果(n＝9)

2.2.3 結(jié)果與分析

根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，計(jì)算鹽酸小檗堿含量和浸膏得率，進(jìn)行多指標(biāo)綜合加權(quán)評分，結(jié)果見表2。為進(jìn)一步確定各因素對結(jié)果的影響大小，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。由極值和方差分析表可以得出，影響婦科灌腸液提取的工藝因素的強(qiáng)度依次為C（提取次數(shù)）＞A（加水倍數(shù)）＞B（煎煮時(shí)間），且提取次數(shù)為顯著性影響因素（P＜0.05），因素A和因素B對試驗(yàn)結(jié)果無顯著性影響。因此確定各因素的最佳水平組合為A2B2C3，即煎煮3次，每次加10倍量水，每次1 h。

表3 方差分析表

2.2.4 工藝驗(yàn)證試驗(yàn)

分別稱取5倍量的處方藥材，共3份，按優(yōu)選的提取工藝A2B2C3進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果見表4，其 RSD為1.6%，表明優(yōu)選出的工藝條件穩(wěn)定，合理可行。

表4 提取工藝驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果(n＝3)

3 討論

正交試驗(yàn)的極差分析結(jié)果顯示，提取次數(shù)對試驗(yàn)有顯著性影響，故就提取次數(shù)進(jìn)行追加，結(jié)果顯示與最佳提取工藝（A2B2C3）無顯著性差異，再從生產(chǎn)的綜合效益出發(fā)，考慮到節(jié)能降耗、縮短生產(chǎn)周期等因素，最終確定各因素的最佳水平組合為A2B2C3。

本研究中創(chuàng)新地通過采用鹵素水分測定浸膏得率，測定提取液水分含量，間接得出浸膏得率，且只需耗時(shí)約6 min，比傳統(tǒng)的烘箱烘至恒重法大大節(jié)省了時(shí)間及能源，提高了試驗(yàn)效率，且試驗(yàn)準(zhǔn)確度更高[13]。

本試驗(yàn)中考察了乙腈－0.1%磷酸水溶液、乙腈－0.2%磷酸水溶液和乙腈－0.2%磷酸水溶液－磷酸二氫鉀等流動(dòng)相系統(tǒng)對鹽酸小檗堿成分分離的影響，發(fā)現(xiàn)采用乙腈－0.2%磷酸水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)，梯度洗脫，且不用加緩沖鹽（磷酸二氫鉀、十二烷基磺酸鈉等），也能較好地將鹽酸小檗堿色譜峰與其他色譜峰分離，理論板數(shù)以鹽酸小檗堿計(jì)算不低于50 000。

由于鹽酸小檗堿是該處方中君藥黃柏的主要有效成分，其含量的高低經(jīng)配伍后對臨床療效影響較大，因此選擇鹽酸小檗堿的含量作為評價(jià)指標(biāo)之一，權(quán)重系數(shù)較高，以0.7為宜。浸膏得率作為提取工藝的參考指標(biāo)，能部分反映出該處方藥物的提取質(zhì)量，但浸膏得率與療效不成正比例關(guān)系，故綜合評價(jià)時(shí)權(quán)重系數(shù)相應(yīng)較小，以 0.3為宜[14]。

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Optimization of Extraction Process for Gynecological Enema Liquid by Halogen Moisture Determination and HPLC

Liu Fengle1， Qiu Xun1， Gao Wenquan1， Wang Ruirui1， Zhao Guifen1， Yang Lei2， Zhao Aimei1
（ 1.Dali Hospital of Traditional Chinese Medicine， Dali， Yunnan， China 671000； 2.Dali First People′s Hospital， Dali， Yunnan， China 671000）

Objective To optimize the extraction process for gynecological enema liquid.Methods Halogen moisture determination and HPLC were adopted，with the extracting rate and content of berberine hydrochloride as indexes，water volume （A），extracting time （B）and extracting times （C） as factors，the optimum extraction process was optimized by orthogonal test.Results The optimum process was determined as adding 10 times of water and extracting 1 h for 3 times.Conclusion This method can be used as the extraction process for gynecological enema liquid.

gynecological enema liquid；orthogonal test；extraction process；berberine hydrochloride；extracting rate

TQ460.6；R284.2

A

1006－4931(2017)20－0017－04

10.3969 ／j.issn.1006 － 4931.2017.20.005

劉鳳樂，男，碩士研究生，主管中藥師，研究方向?yàn)獒t(yī)院制劑研發(fā)及質(zhì)量管理，（電話）0872－2196090（電子信箱）lflcpu＠ 163.com。

趙愛梅，女，副主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制，（電話）0872－2196090（電子信箱）651884308＠qq.com。

2017－06－06)