低級別胚胎囊胚培養及臨床結局分析

鄭州大學附屬洛陽中心醫院（471003）戚靜宜 牛吉峰

在體外受精－胚胎移植（IVF/ICSIET）技術中，冷凍前進行囊胚培養可以使胚胎細胞數增多，以便可以選取最為優質的胚胎進行冷凍[1]。其中部分低級別的胚胎（Ⅲ級、Ⅳ級）在受精后第三天仍有繼續發育為優質囊胚的潛質，且移植后具有臨床妊娠價值，使胚胎利用率增加[2]。因此，低等級胚胎囊胚繼續培養及移植，提高臨床妊娠率，已成為社會廣泛關注的問題。筆者就低等級的胚胎進行繼續培養，部分胚胎也可發展為優質囊胚，進行移植后可提高臨床妊娠率及胚胎利用率?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年6月～2016年6月收集到的行體外受精－胚胎移植技術治療的123個治療周期，將受精后3天（D3）進行移植、冷凍的436枚低級別胚胎繼續培養2～3天，所有患者在年齡、內膜準備等方面無明顯差異性（P>0.05），避免移植后因個人因素而影響臨床妊娠率及胚胎利用率。

1.2 方法

1.2.1 精液處理 精液取出并液化后采用離心法收集精液，當精子濃度為1.5×106/ml時，進行授精。卵胞漿內單精子注射(ICSI)患者，卵母細胞采用透明質酸酶（Spectrum，美國，CAS編號：37326-33-3，生產批號20140312）將顆粒細胞去除，然后放置在4孔皿中，卵子取出后4～6小時，選取MⅡ期的卵子，進行顯微鏡下受精、注射，通過評分的方式，評價原核期胚胎、第2、3天（D2、D3）胚胎的發育情況。將發育優質的胚胎在受精后的第3天進行冷凍、移植，將低等級的胚胎胚囊進行繼續培養，觀察囊胚的情況。胚胎培養的液體均放置于二氧化碳培養箱QP-80（濟南安暢醫療設備有限公司，生產批號20140521）中。

1.2.2 胚胎移植 解凍的卵裂胚或囊胚轉移到胚胎移植管（COOK，美國，K-JSPPE-681710，生產批號20140113）中，在B超監視下移植入子宮。

1.2.3 胚胎評分 卵裂期胚胎分級：依據Peter卵裂期胚胎評分系統評估受精后第3天胚胎質量，卵裂球大小基本均勻，碎片在5%以下者為Ⅰ級；卵裂球碎片在20%以下者為Ⅱ級；卵裂球碎片中無核碎片占21%～50%者為Ⅲ級；卵裂球碎片中無核碎片占50%以上者為Ⅳ級。低級別胚胎為4、5及>9個卵裂球Ⅱ級、Ⅲ級、Ⅳ級，6～10個卵裂球Ⅲ級、Ⅳ級[3]。

胚囊分級：依據Garnder囊胚分級法評價囊胚，首先需根據囊胚的擴張及孵出程度分級囊胚：早期囊胚，囊胚腔體積不到總體積的1/2為1級；囊胚腔體積超過總體積的1/2為2級；囊胚腔占據整個囊胚為3級；囊胚腔體積明顯大于早期囊胚為4級；囊胚正在孵化為5級；囊胚腔孵化并從透明帶中脫出為6級[4]。還需對3～6級的囊胚進行內細胞團評分和滋養外胚層細胞評分：內細胞團評分（ICM評分）：A級為結合緊密，細胞多；B級為結合松散，細胞較少；C級為細胞極少；滋養外胚層細胞評分（TE評分）：A級為細胞多，胚囊周圍有細胞分布；B級為細胞較少，上皮細胞松散；C級為細胞數目極少。優質胚囊為受精后第5天評分在3AA、3AB、3BA、3BB以上或者受精后第6～7天評分在4AA、4AB、4BA、4BB以上[5]。

1.2.4 囊胚冷凍保存及解凍 囊胚冷凍保存及解凍方法需按照冷凍液、解凍液（Origio，丹麥，生產批號20140521）的操作說明進行操作。胚胎移植當天就進行解凍時，需進行4小時的培養，依據胚胎評分移植。

1.3 觀察指標 臨床妊娠的判定：胚胎移植后14天進行血絨毛膜促性腺激素（hCG）檢查，移植后的35天進行超聲檢查，檢查結果中如可見妊娠囊及心血管波動，則可判定為臨床妊娠。

1.4 統計學分析 應用統計學軟件SSPS18.0，以X2檢驗計數資料（%）。P＜0.05提示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 低等級胚胎囊胚繼續培養形成囊胚結果 在行體外受精－胚胎移植技術的123個治療周期中，將受精后3天（D3）進行移植、冷凍的436枚低級別胚胎繼續培養2～3天，有143枚形成囊胚，形成囊胚率為32.8%。

2.2 囊胚與妊娠結局的關系 新鮮胚胎移植中，有囊胚形成組8 2 個周期，無囊胚形成組4 1 個周期，有囊胚形成組種植率、臨床妊娠率高于無囊胚形成組（P<0.05），兩組間流產率相比，無明顯差異（P>0.05），具體見附表1。

2.3 凍融囊胚及凍融卵裂胚的移植結果 凍融囊胚組種植率及臨床妊娠率高于凍融卵裂胚組（P<0.05），兩組間流產率無顯著差異（P>0.05），具體見附表2。

3 討論

體外受精－胚胎移植是一種人工生育技術，這種技術的發展為許多的不孕不育患者帶來了福音。但這種該技術在進行實施的過程中，也出現了許多的問題，諸如多胎妊娠、異位妊娠、自然流產、胎兒畸形等，因此對這種技術要加以改進，通過改進囊胚的培養及移植技術，提高胚胎種植率及妊娠率。目前，我國多數地方都是將優質胚胎冷凍保存，低級別的胚胎丟棄，造成了胚胎的浪費。隨著體外技術的發展，研究人員發現，當部分低級別的胚胎經過繼續培養后可發育成囊胚，從而提高了胚胎的利用率和臨床妊娠率。

附表1 有囊胚形成組和無囊胚形成組的妊娠結局比較(n，%)

附表2 凍融囊胚及凍融卵裂胚的移植結果比較(n，%)

在進行囊胚培養時可依據發育潛能選取胚胎，且更加符合生理，由于在正常條件下，早期胚胎是在輸卵管中發育的，直到囊胚期才會進入子宮腔，進行著床，囊胚移植減輕了胚胎被排除宮腔的幾率，提高了著床率，降低異位妊娠的幾率。

從上述實驗結果中，可以看出，低級別的胚胎通過囊胚培養，可以篩選出最具潛能的胚胎，提高了胚胎的利用率和臨床妊娠率。