UHPLC法測定柴黃片中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量探討

河南省駐馬店市食品藥品檢驗所（463000）趙曉麗

柴黃片主要由兩味中草藥制備而成，分別為柴胡和黃芩，屬于中成藥制劑，患者服用后能夠發揮解表清熱的效果，在風熱型感冒癥狀中具有良好的用途[1]。現代藥理學研究證實，柴黃片中有效成分抗炎、抗菌效果明顯。現階段，柴黃片質量控制標準能夠對黃芩的成分黃芩苷進行測定，但是無法對柴胡皂苷類成分進行科學控制。這種情況下，會給柴黃片的用藥安全帶來一定影響[2]。為此，對柴黃片中柴胡皂苷類成分進行準確測定，具有積極意義。本研究主要采用UHPLC法對柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量進行測定，為進一步完善柴黃片質量控制提供科學依據。

1 儀器與測量方法

1.1 測量儀器與試藥 采用高效液相色譜儀（型號為Agi1260），配置DAD檢測器，將二異丁基-十八烷基鍵合硅膠色譜柱作為主要填料。電子天平、超聲波清洗儀、旋轉蒸發器及超純水機；選取陜西盤龍制藥公司提供的柴黃片，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d由特定渠道分離制備，通過UHPLC法測定，純度＞98%，其他試劑均為分析純，如甲醇、超純水等。

1.2 溶液配制 取柴胡皂苷a、柴胡皂苷d（干燥至恒重）、黃芩苷對照品，其中黃岑苷對照品劑量為11.5mg，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d分別為12mg。將上述制品放置在容量瓶中（25mL），添加濃度為50%的甲醇溶解劑，并將其稀釋到刻度。將柴胡皂苷a、柴胡皂苷d分別配制為0.50mg/mL、0.48mg/mL的對照品溶液。采用0.45μm微孔濾膜過濾處理，并放置在零下4℃環境中冷藏，以作備用。

1.3 液相色譜條件 ①柴胡皂苷a：采用Hypersil C18色譜柱法（4.6×250m，5μm），以乙腈磷酸水溶液作為流動相（A）-0.01%；磷酸水溶液（B）；梯度洗脫（0～30min，30%A～60%A），科學設定梯度洗脫值，控制流速（1mL/min），檢驗波長控制在254nm，柱溫則為35℃，運行時間35min，進樣量10μL。②柴胡皂苷d：用Hypersil C18色譜柱法（4.6×250m，5μm），以乙腈磷酸水溶液作為流動相（A）-0.01%；磷酸水溶液（B）；梯度洗脫（0～30min，30%A～60%A），科學設定梯度洗脫值，控制流速（1mL/min），檢驗波長控制在210nm，柱溫則為30℃，運行時間35min，進樣量10μL。③黃岑苷色譜條件：采用Hypersil C18色譜柱法（4.6×250m，5μm），以甲醇作為流動相，0.2%磷酸溶液（45∶55，V/V），科學設定梯度洗脫值，控制流速（1mL/min），檢驗波長控制在278nm，柱溫則為35℃，運行時間35min，進樣量10μL。

1.4 樣品處理 柴胡皂苷制備：柴胡皂苷a和柴胡皂苷d供試品的制備方法，分別取3批柴黃片，并采用0.45μm微孔濾膜進行過濾及相應處理，所得柴胡皂苷a供試品和柴胡皂苷d供試品。分別取3批1mg柴黃片于5個100mL容量瓶中，采用流動相進行稀釋，至刻度后充分混合均勻。嚴格根據處方要求，制備陰性對照品，此對照品中不含有柴胡。與此同時，按照柴胡皂苷a和柴胡皂苷d供試品，制備不含柴胡皂苷a、柴胡皂苷d的陰性樣品。

2 結果

2.1 專屬性實驗 精密吸取柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對照品溶液，同時取相應的供試品溶液，結合陰性對照品，并將上述制品注入到液相色譜儀中，并對色譜圖進行準確記錄。

2.2 穩定性實驗 取相同供試品溶液，結合相關操作，對穩定性進行檢驗，制備進樣量，對RSD值進行測量。

2.3 重復性實驗 在上述特定色譜條件下，對溶液進行連續性進樣處理，并對峰面積進行準確測量，并對柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的RSD含量進行測定。

2.4 試驗結果 柴黃片中柴胡皂苷a線性范圍為0.98～5.67μg（r2=0.9991），柴胡皂苷d線性范圍為0.059～0.052μg（r2=0.9997）；柴胡皂苷a的平均加樣回收率為98.0%，柴胡皂苷d的平均加樣回收率為96.5%；柴胡皂苷a的RSD為2.0%，柴胡皂苷d的RSD為1.8%。上述研究結果證實，測定峰面積RSD值精密度良好，且供試品溶液在10h之內穩定性良好，說明本研究所采用的測量方法可開展重復性操作，見附表。

附表 柴黃片中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量

3 討論

中藥制劑在制備過程中，在兼顧中藥制備技術的基礎上，綜合現代制造技術，在臨床多種疾病診治中發揮重要作用。但是，中藥制劑成分比較復雜，在質量控制上存在一定難度，對患者用藥安全產生較大影響[3]。

建立完善、科學、有效的藥物成分測量方法，并制定出相對合理的限度指標，是現階段中成藥制劑的重要方法。但是，根據目前現有的相關技術標準，中成藥方制劑成分測量方法不夠完善，很多可控性指標在很大程度上也無含量測量。高效液相色譜法在現階段中藥制劑質量控制與評價中具有廣泛的用途，其主要原理為利用指紋圖譜技術，對藥物有效成分的含量或者所占比例進行分析，從而及時知曉藥物中主要成分的總體情況，從而為樣品質量控制提供有效幫助，保證中成藥制劑本身的科學性與合理性，并保持其使用質量的穩定性，減少用藥不良反應，提高患者用藥治療效果。

柴黃片中主要含有兩味中草藥，分別為柴胡和黃芩，因此選擇黃芩的主要成分黃芩苷及柴胡的主要成分柴胡皂苷a、d作為主質量控制的關鍵性指標，對其進行定量檢測，能夠明確成分含量。但是，由于兩種成分的吸收波長存在一定差異，同時在中成藥中含量不同。本研究采用UHPLC法，對柴黃片中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量進行測定，結果顯示：柴黃片中柴胡皂苷a線性范圍為0.98～5.67μg（r2=0.9991），柴胡皂苷d線性范圍為0.059～0.052μg（r2=0.9997）；柴胡皂苷a的平均加樣回收率為98.0%，柴胡皂苷d的平均加樣回收率為96.5%，柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的RSD分別為2.0%、1.8%。

以上所得數據說明，測定峰面積RSD值精密度良好，且供試品溶液在10h之內穩定性良好，說明本研究所采用的測量方法可開展重復性操作，UHPLC測量法不僅操作簡單，同時具有可靠性，所得數據真實可信，且具有良好的重現性。與此同時，通過上述測量方法，能夠最大程度保證柴黃片定量控制指標的科學性，并為其選擇提供一定參考。本實驗結果表明，所建立的方法能夠簡便、快速、準確的測定柴黃片中柴胡皂苷a、d的含量，可以作為該制劑的一個質量控制標準。

總之，采用UHPLC法對柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量進行測定，操作簡便，安全可靠，具有良好的重現性，在柴黃片中成藥主要含量測量中發揮比較重要的作用，能夠不斷完善中成藥方劑質量體系的構建。