原生質體誘變選育高產多糖荷葉離褶傘菌株

周霞　張堯　張成霞

摘要：研究了菌齡、滲透壓穩定劑、酶系統、酶解時間等條件對荷葉離褶傘原生質體制備的影響，通過紫外線誘變技術篩選得到1株高產多糖的菌株。結果表明，原生質體制備最適菌齡為4 d，滲透壓穩定劑為06 mol/L甘露醇，使用1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合在30 ℃酶解25 h，原生質體產量可達138×107個/mL，再生率為127%。經誘變、篩選和遺傳穩定性分析，獲得1株多糖含量較出發菌株提高3449%的突變菌株。

關鍵詞：荷葉離褶傘；原生質體；紫外誘變；多糖

中圖分類號： S6461036文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0126-03

收稿日期：2017-02-27

基金項目：江蘇省泰州市農業科技支撐計劃（編號：TN201514）。

作者簡介：周霞（1983—），女，江蘇泰州人，碩士，講師，主要從事園林園藝專業的遺傳育種、栽培和食用菌栽培等教學與科研。Tel：（0523）86158388；E-mail：694416747@qqcom。

荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes），隸屬于傘菌目（Agaricales）白蘑科（Tricholomataceae）離褶傘屬（Lyophyllum），是一種十分珍貴的野生食藥兼用菌，它口感鮮美，富含豐富的礦物質、維生素和氨基酸等營養物質。鹿茸菇為其商品名，是由于它的菌傘酷似我國名貴的中藥材鹿茸切片而得名，除了外觀與鹿茸相似外，據國內相關文獻報道，它還具有多重藥用功效。多糖是荷葉離褶傘的主要有效成分，目前正成為國內外眾多學科領域研究的熱點之一[6-8]。本研究通過紫外線誘變原生質體技術[9-12]選育出高產多糖的荷葉離褶傘菌株。

1材料與方法

11材料

111菌種荷葉離褶傘供試菌種（中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號CGMCC No1518，菌株號ZY48-1，專利號：ZL2005100964050。）

112培養基菌絲固體培養基（PDA）、菌絲液體培養基（PGA）、原生質體再生培養基（馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、蛋白胨2 g、酵母粉2 g、K2HPO4 15 g、MgSO4·7H2O 15 g、瓊脂2%、水1 000 mL、06 mol/L甘露醇穩滲劑）。

12試驗方法

121菌絲體培養及生長曲線

刮取培養好的斜面菌種放入盛有10 mL無菌水的小三角瓶中，內置碎玻璃，充分振蕩，吸取2 mL菌絲懸液于盛有50 mL液體培養基的250 mL三角瓶中，25 ℃、120 r/min培養數天。3次重復，每隔1 d將菌絲體于60 ℃烘干至恒質量，繪制生長曲線。

122原生質體制備

將培養好的菌絲置于離心管中，4 000 r/min 離心20 min，棄去上清液，用穩滲劑洗滌3 次，按200 mg/mL比例加入酶液，30 ℃酶解數小時，得純化原生質體，整個過程在無菌條件下進行，用血球計數板計數計算原生質體產量。

123原生質體制備條件

在同等條件下分別研究酶系統、酶解時間、滲透壓穩定劑種類、菌齡等條件對原生質體制備的影響。酶系統：2%溶壁酶、2%纖維素酶、2%蝸牛酶、1%溶壁酶+1%纖維素酶、1%溶壁酶+1%蝸牛酶、1%纖維素酶+1%蝸牛酶。酶解時間為1、2、3、4、5 h。滲透壓穩定劑：06 mol/L 的硫酸鎂、甘露醇、蔗糖、葡萄糖。菌齡：分別取菌齡2、4、6、8、10、12 d的菌絲體制備原生質體并計數。

124原生質體再生

用滲透壓穩定劑將純化的原生質體稀釋并涂布原生質體再生培養基平板，25 ℃培養，8～10 d后觀察原生質體的再生情況。同時用無菌水漲破原生質體后作為對照，消除非原生質體所形成的菌落帶來的誤差。

125原生質體紫外線誘變

無菌條件下，將制備好的原生質體稀釋至104個/mL，取5 mL于9 cm無菌培養皿內，用磁力攪拌器使原生質體懸液保持均勻。在預熱穩定的15 W紫外燈下距離30 cm處分別照射0、10、20、30、40、50、60、80、100 s，每組2個重復。吸取原生質體懸液200 μL，涂布再生培養基，25 ℃避光培養，計菌落數，繪制荷葉離褶傘原生質體紫外線誘變劑量效應曲線，計算原生質體紫外線誘變的半致死劑量，并確定誘變劑量。

126高產多糖突變菌株的篩選

以半致死劑量誘變荷葉離褶傘原生質體，挑取優先再生、生長最旺盛的菌落進行拮抗試驗（3點接種法），初步篩選出40株誘變菌株。在此基礎上，分別將出發菌株和誘變菌株接入100 mL液體培養基中，25 ℃、120 r/min振蕩培養6 d，測定培養液多糖含量（苯酚-硫酸法[12]），進一步篩選多糖產量高的菌株。

127遺傳穩定性分析

將高產多糖誘變菌株連續轉接10代，均進行搖瓶培養，取第1、3、5、6、7、8、9、10代分別測定菌絲多糖含量。

2結果與分析

21菌絲生長曲線

（0472 g/L），8 d以后曲線呈下降趨勢。根據生長曲線，初步確定菌齡在對數期4 d時進行原生質體制備。

22不同酶系統對原生質體產量的影響

使用3種單一酶和3種酶組合，30 ℃條件下對培養4 d的菌絲酶解2 h。從圖2可以看出，選用不同種類或組合的脫壁酶對原生質體產量的影響較大，在供試的6種酶解液中，使用酶組合進行脫壁的效果要顯著優于使用單一酶。其中1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合原生質體產量最高，達1463×106個/mL；2%纖維素酶（84×105個/mL）原生質體產量最低。

23酶解時間對原生質體產量的影響

使用1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合，30 ℃條件下對培養4 d 的菌絲分別酶解1、2、3、4、5 h。從圖3可以看出，酶解時間在10～25 h范圍內，原生質體產量迅速提高，在3 h時達到最大（131×107個/mL），隨后產量逐漸下降。故最適酶解時間為25 h。

24滲透壓穩定劑對原生質體產量的影響

分別使用06 mol/L硫酸鎂、甘露醇、蔗糖、氯化鉀作為滲透壓穩定劑，1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合酶解，30 ℃條件下對培養4 d的菌絲酶解25 h制備原生質體并計數。從圖4可以看出，同等條件下，06 mol/L的甘露醇作為滲透壓穩定劑原生質體產量最高，為13×107個/mL，其次是蔗糖和氯化鉀，硫酸鎂作為滲透壓穩定劑產量最低，故荷葉離褶傘原生質體制備的最適滲透壓穩定劑為 06 mol/L 甘露醇。

25菌齡對原生質體產量的影響

分別取菌齡2、3、4、5、6、7 d的菌絲體同等條件下制備原生質體并計數。從圖5可以看出，培養4 d時原生質體產量最高，達138×107個/mL，培養時間超過4 d后，原生質體產量逐漸下降，故最佳菌齡為培養4 d，與圖1生長曲線基本吻合。

26原生質體再生

以06 mol/L甘露醇作為滲透壓穩定劑，25 ℃培養，在第9天出現再生菌落，再生率為127%。

27原生質體紫外線誘變

荷葉離褶傘紫外線誘變劑量效應曲線見圖6，由此計算半致死率照射劑量約為20 s。

28高產多糖突變菌株的篩選

根據拮抗反應和菌落生長狀況，在紫外線照射時間為 20 s 的平板上篩選出20株菌落形態無明顯變化，生長速度較快的突變菌株。以原始出發菌株為對照，測定其多糖含量，結果見表1。篩選出6株誘變菌株，分別為菌株02、10、11、15、21、28。

29遺傳穩定性分析

將6株誘變菌株連續轉接10代，測定菌絲多糖含量，結果見表2。10號誘變菌株雖然多糖含量最高，但遺傳穩定性不好，11號菌株遺傳穩定性好，且多糖含量也高，較出發菌株提高了3449%。

3結論與討論

荷葉離褶傘原生質體制備最佳條件為：菌齡4 d，用 06 mol/L 甘露醇作為滲透壓穩定劑，1%溶壁酶+1%蝸牛酶組合30 ℃酶解25 h，原生質體產量達138×107個/mL，再生率達127%。原生質體紫外線誘變半致死劑量為20 s，根據拮抗反應和菌落生長狀況，篩選出40株誘變菌株，從中選出6株多糖含量較高的菌株，通過遺傳穩定性分析，獲得1株多糖含量為6 01872 mg/L的誘變菌株，較原始出發菌株多糖含量提高3449%。

影響原生質體釋放的因素有很多[13-15]，本試驗通過對荷葉離褶傘原生質體的制備條件的研究，明確了搖瓶發酵條件下，菌齡、滲透壓穩定劑、酶系統、酶解時間等條件對原生質體產量的影響，其中酶系統的選擇對原生質體產量影響較大，采用復合酶的效果要顯著優于使用單一酶進行酶解。紫外線誘

注：表中00號為出發菌株。

變原生質體育種技術是一種簡單、有效的育種技術，但經紫外線照射后，原生質體的再生一般比較困難，給育種工作帶來一定麻煩。本試驗經過多次重復大量的誘變工作，篩選到1株高產多糖的菌株。

參考文獻：

上海農業科學院食用菌研究所中國食用菌志[M]北京：中國林業出版社，1991

席亞麗，茆愛麗，王曉琴，等 荷葉離褶傘子實體、菌絲體及發酵液蛋白質營養價值評價[J] 菌物學報，2010，29（4）：603-607

[3]閆肅 荷葉離褶傘子實體化學成分與生物活性研究[D] 長春：吉林農業大學，2014

[4]魏雨恬，馮娜，張勁松，等 荷葉離褶傘子實體有機溶劑萃取物的化學成分和抗腫瘤活性[J] 食用菌學報，2016，23（2）：70-74

[5]Ukawa Y，Ito H，Hisamatsu M Antitumor effects of（1→3）-beta-D-glucan and（1→6）-beta-D-glucan purified from newly cultivated mushroom，Hatakeshimeji（Lyophyllum decastes Sing）[J] Journal of Bioscience and Bioengineering，2000，90（1）：98-104

[6]張春梅，宋海，魏生龍荷葉離褶傘菌絲體多糖的提取及還原力的研究[J] 中國食用菌，2012，31（6）：44-48

[7]王曉琴，曹禮，鄭秀芳，等 荷葉離褶傘多糖的提取工藝及其抑菌作用的研究[J] 中國食品工業，2009（12）：51-53

[8]國外醫藥編輯部 培養荷葉離褶傘得到的蛋白多糖作腫瘤細胞免疫增強藥物[J] 國外醫藥：植物藥分冊，1992，7（3）：141

[9]朱芬，陳軍，師亮，等 靈芝三萜高產菌株原生質體紫外誘變選育[J] 南京農業大學學報，2008，31（1）：37-41

[10]許梅 高產多糖大球蓋菇菌株原生質體誘變選育及其抗氧化能力研究[D] 泰安：山東農業大學，2007

[11]張卉，李長彪，陳明波，等 原生質體紫外誘變選育姬松茸新菌株[J] 微生物學雜志，2004，24（6）：56-57

[12]王曉琴，張芬琴，魏生龍，等 荷葉離褶傘菌絲體深層發酵及胞內外多糖含量的變化[J] 中國釀造，2011，30（5）：56-58

[13]董汪洋，王鄭隆，楊云喬，等 杏鮑菇的菌株篩選與原生質體制備條件優化[J] 浙江農業學報，2015，27（5）：782-786

[14]譚文輝，李燕萍，許楊 微生物原生質體制備及再生的影響因素[J] 現代食品科技，2006，22（3）：263-265

[15]詹萍，蘇龍，周乃東 紅酵母原生質體制備和再生條件研究[J] 安徽農業科學，2010，38（3）：1154-1155