橡膠草3—羥基—3—甲基戊二酰輔酶A基因表達的初步分析

趙李婧　曹新文　李永梅

摘要：分析橡膠草HMGR基因的表達情況，構建原核表達載體，轉化BL21菌株并誘導表達。構建細胞融合表達載體，轉化GV3101菌株并侵染洋蔥表皮細胞，在共聚焦顯微鏡下觀察基因表達情況。構建植物過表達載體并侵染煙草，利用紫外分光光度法檢測三萜含量的變化。通過IPTG誘導和SDS-PAGE檢測，獲得分子量為62659 1 ku的蛋白，與預期蛋白相符合，且37 ℃誘導6 h時表達最明顯；通過激光共聚焦顯微鏡觀察，該基因主要在細胞膜上表達；紫外可見分光光度法表明轉基因煙草中三萜的含量高于空白煙草。橡膠草HMGR基因分別在大腸桿菌、洋蔥鱗片內表皮和煙草中成功表達。

關鍵詞：橡膠草；HMGR基因；原核表達；亞細胞定位；總三萜提取物

中圖分類號： Q786文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0042-04

收稿日期：2016-03-31

基金項目：國家自然科學基金（編號：31360060）。

作者簡介：趙李婧（1989—），女，山西晉城人，碩士研究生，主要從事植物基因工程的研究。E-mail：851409674@qqcom。

通信作者：閆潔，博士，副教授，主要從事生物化學和分子生物學教學和科研工作。E-mail：1653842328@qqcom。

天然橡膠的生物合成是通過產膠植物體內的異戊二烯代謝途徑完成的，而3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMGR）基因及其啟動子是該代謝途徑中的關鍵限速酶基因，它控制著碳流的流向和代謝反應速率，也是萜類化合物代謝調控的重要位點。目前，已經從橡膠樹、水稻、甘草、皂苷、陽春砂、三七、雷公藤、擬南芥、番茄、杜仲等植物中克隆得到了該酶的基因及其啟動子，它們以基因家族的形式存在并控制著代謝途徑中產物的合成[2-11]。研究發現，HMGR基因在萜類化合物合成中起著關鍵的調節作用，例如轉擬南芥[WTBX][STBX]HMGR1[WTBZ][STBZ]基因的番茄中植物淄醇含量增加到24倍[12]。煙草已具備了成熟的遺傳轉化體系，是研究基因功能的理想模式植物。從橡膠草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）中克隆得到的HMGR基因是橡膠產膠代謝途徑中的關鍵限速酶基因，為了進一步研究橡膠草的HMGR基因功能，本研究構建了HMGR基因的原核表達載體和植物過表達載體，轉化DE3大腸菌株、在洋蔥鱗片葉表皮瞬時表達，并通過農桿菌葉盤轉化法轉化煙草，以便進一步研究該基因在異戊二烯代謝途徑中的功能，并為研究產膠代謝調控機理奠定基礎。采用基因工程的方法，對橡膠草HMGR基因的原核表達、亞細胞定位和真核表達進行了分析，為進一步揭示基因的功能和為后續研究奠定了基礎。

1材料與方法

11試驗材料

111材料

橡膠草植株，于2011年6月采自新疆石河子蘑菇湖旁邊，后移栽至實驗室栽培室進行室內培養；“NC89”野生型煙草，由筆者所在實驗室提供；齊墩果酸標準品，購自北京全式金生物技術有限公司；新鮮生長良好的洋蔥，購自石河子蔬菜市場。

112菌株、質粒及試劑

大腸桿菌Top10、農桿菌GV3101、植物表達載體pCAMBIA2300-35S-OCS、細胞融合表達載體pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，均由筆者所在實驗室保存。植物總RNA提取試劑盒，購自北京艾德萊生物科技有限公司；SuperRT cDNA Kit，購自北京康為世紀生物科技有限公司；Blue Plus Ⅲ Protein Marker，購自北京全式金生物技術有限公司；引物均由華大基因合成，其他試劑均為國產或進口分析純。

113儀器

冷凍干燥機LGJ-10C、紫外-可見分光光度計、激光共聚焦顯微鏡IN Cell Analyzer 3000，均購自上海分析儀器廠。

12試驗方法

121原核表達載體的構建

為了研究該基因的蛋白表達情況，構建了原核表達載體。將PET-30a質粒和pGEMT-T-HMGR 質粒分別用BamHⅠ和SalⅡ進行雙酶切，酶切體系為20 μL，7 μL質粒、2 μL 10×T buffer、BamHⅠ和SalⅡ各 1 μL，然后加無菌水至20 μL，將反應體系置于37 ℃水浴中酶切4 h，4 h后跑核酸電泳檢測。切膠回收PET-30a（+）載體片段和TkHMGR基因片段，將回收的片段用T4 DNA連接酶連接，連接體系為10 μL，PET-30a（+）和TkHMGR各 4 μL、1 μL 10×Loading buffer、1 μL T4 DNA連接酶，反應體系置于4 ℃水浴過夜連接，將連接產物轉化Top10感受態細胞，在添加了卡那霉素（Kan）的LB固體培養基上挑取重組質粒，通過PCR反應和雙酶切篩選陽性克隆，并對陽性克隆進行測序驗證。進行PCR反應時，取pGEMT-T-HMGR質粒為模板作為陽性對照，以加雙蒸水為模板作為陰性對照。成功構建的載體命名為PET-30a-TkHMGR，將測序正確的質粒電擊轉化BL21（DE3）。

122重組質粒在大腸桿菌中的誘導表達及十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析

將轉化成功的BL21（DE3）-PET-30a-TkHMGR接種到50 mL含Kan的LB液體培養基中，37 ℃、220 r/min過夜培養后吸取05 mL到50 mL含Kan的LB液體培養基中，37 ℃、220 r/min繼續培養使其D600 nm值達到04時（大約2 h），加異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）使其終濃度為05 mmol/mL，以不加IPTG和轉BL21（DE3）-PET-30a質粒的菌液為對照，于37 ℃、220 r/min 繼續培養，每隔2 h取2 mL菌液于離心管中，4 ℃、6 000 r/min 離心10 min收集沉淀，然后在沉淀中加入 025 mL 冰浴的磷酸鹽緩沖液充分混勻沉淀，再向其中加入0025 mL 5×SDS-PAGE電泳緩沖液，充分混勻后放置 5 min，在 100 ℃ 水浴中煮沸5 min，使蛋白變性后冷卻至室溫，12 000 r/min 離心10 min，取上清液即為誘導表達的重組蛋白。endprint

123植物過表達載體的構建和綠色熒光蛋白（GFP）融合表達載體的構建

為了研究該基因的功能和亞細胞定位，構建了植物過表達載體和GFP融合表達載體。以橡膠草cDNA為模板，qHMGR上（XbaⅠ）和qHMGE下（SalⅡ）、HMGR-GFP上（BamHⅠ）和HMGR-GFP下（XbalⅡ）分別為引物克隆了TkHMGR基因和去終止子的TkHMGR基因，回收目的片段與克隆載體pGEM-T Easy Voctor連接，構建pGEM-T-TkHNGR和pGEM-T-TkHNGR（去終止子）。分別用XbaⅠ和SalⅡ雙酶切重組質粒pGEM-T-TkHMGR和pCAMBIA2300-35S-OCS，用BamHⅠ和XbalⅡ雙酶切pGEM-T-TkHNGR（去終止子）和pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS，獲得目的基因片段和載體大片段。將大小片段進行連接，然后轉化大腸桿菌Top10感受態細胞，Kan篩選融合表達載體pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-OCS和pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-GFP-OCS。用電擊轉化法將重組質粒轉化根癌農桿菌GV3101，挑取陽性克隆，進行PCR擴增和雙酶切鑒定。進行PCR反應時，取pGEMT-T-HMGR質粒為模板作為陽性對照，以加雙蒸水為模板作為陰性對照。PCR擴增所用的引物及引物序列如表1所示。

124洋蔥表皮細胞的侵染、培養和GFP觀察

選取新鮮的生長良好的洋蔥，將鱗莖在75%乙醇中浸泡10 min，用無菌水沖洗3～4次，再用無菌解剖刀取1 cm×1 cm×1 cm的球莖內表皮，貼近葉肉的一面朝下平鋪于1/2 MS固體培養基中，28 ℃暗培養4 h，將預培養的洋蔥方塊用含有pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-GFP-OCS質粒的農桿菌菌液侵染25 min，用濾紙吸干表面的菌液，轉入1/2 MS固體培養基中25 ℃光照培養2 d。將培養好的洋蔥鱗片用干凈的MS液體洗滌，以除去附著的農桿菌，把1 cm×1 cm×1 cm的鱗片做成裝片，用激光共聚焦顯微鏡于488 nm波長下觀察熒光蛋白在細胞內的表達情況。

125煙草的遺傳轉化

通過葉盤轉化法將含有質粒pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-OCS的農桿菌GV3101轉化“NC89”的野生型煙草。提取轉化pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-OCS質粒煙草的DNA，以上游引物BamHⅠ和下游引物SalⅡ進行PCR鑒定，提取煙草的RNA，以HMGR定上和HMGR定下為上游、下游引物進行RT-PCR鑒定。所用引物序列如表1所示。

126轉基因煙草中三萜類化合物含量的測定

1261三萜的提取方法

分別取100 mg 60 ℃干燥的野生型和轉基因的煙草材料，精確稱量后置于10 mL離心管中，加入3 mL 95%乙醇于50 ℃提取（提取3次），將提取液合并轉移至50 mL離心管中，8 000 r/min離心10 min，上清液轉移至新的50 mL離心管中，50 ℃真空干燥；用3 mL蒸餾水溶解干粉，再用同體積的三氯甲烷抽提，轉移三氯甲烷相，在三氯甲烷相中加飽和的NaHCO3溶液，抽提轉移上層NaHCO3相于新的離心管中，緩慢加入濃鹽酸使pH值低于30；加同體積的三氯甲烷抽提，取三氯甲烷相轉移至新管，真空冷凍干燥，用3 mL甲醇溶解，測定其D560 nm。

1262制作標準曲線

取12 mg齊墩果酸標準品，用無水乙醇定容至10 mL，定容后分別吸取01、02、03、04、05、06 mL于試管中，加無水乙醇補足1 mL，空白對照加1 mL無水乙醇，所有試管于沸水中水浴直至溶劑揮發完；然后在試管中加04 mL 5%香草醛冰乙酸、16 mL高氯酸，迅速混勻；將試管于70 ℃水浴中放置15 min，取出冷卻至室溫，加8 mL乙酸乙酯迅速混勻，測定其D560 nm，并繪制標準曲線。

2結果與分析

21原核表達載體的構建和鑒定

pGEMT-T-TkHMGR和PET-30a質粒用BamHⅠ和SalⅡ進行雙酶切，成功構建了載體PET-30a-TkHMGR，電擊轉化BL21（DE3）細胞，挑取陽性克隆菌液進行PCR擴增和雙酶切鑒定。由圖1可知，TkHMGR基因成功地連接到了PET-30a表達載體上，說明成功構建了原核表達載體。

22SDS-PAGE分析

經IPTG誘導表達后提取大腸桿菌菌體總蛋白，將提取的蛋白進行SDS聚丙烯酰氨凝膠電泳，結果表明，隨著誘導時間的延長，分子量約為62659 1 ku的蛋白表達量隨之增加，在6 h時表達量達到最高值。由圖2可知，TkHMGR基因在大腸桿菌中成功誘導表達。

23細胞融合表達載體的構建和鑒定

將重組質粒pGEMT-T-TkHMGR（去終止子）和pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS質粒用BamHⅠ和XbalⅡ進行雙酶切，成功構建了植物融合表達載體pCAMBIA2300-35S-TkHMGR-GFP-OCS，電擊轉化農桿菌GV3101細胞，挑[CM（25]取陽性克隆菌液進行PCR擴增和雙酶切鑒定，由圖

可知，TkHMGR基因成功地連接到pCAMBIA2300-35S-GFP-OCS表達載體上，圖3-b說明成功構建了細胞融合表達載體。

24TkHMGR蛋白亞細胞定位分析

為了研究TkHMGR蛋白的亞細胞定位情況，取轉基因的洋蔥鱗片內表皮制作壓片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。由圖4可知，TkHMGR融合蛋白主要在膜上表達，而35S-GFP對照在整個細胞內均有綠色熒光。由此推測，TkHMGR蛋白可能主要在細胞膜和細胞核膜上表達，這與王啟超等通過Psort程序（http：//psortnibbacjp）分析預測的結果相符合。endprint

25標準曲線的建立

以齊墩果酸反應體系的吸光度為橫坐標、齊墩果酸標準品的含量為縱坐標作標準曲線（圖5），得回歸方程y=20688x+0181，r2=0999 1。

26轉基因煙草中總三萜含量的測定

由圖6可知，煙草中轉Hb-HMGR基因的三萜類化合物含量略高于轉35S-基因，而兩者的三萜類化合物含量都明顯高于空白煙草。

3討論與結論

3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A基因是一類龐大的基因家族，在植物體異戊二烯代謝途徑中扮演著重要的角色，是代謝途徑中的關鍵酶和限速酶。研究該基因編碼蛋白質的亞細胞定位能為蛋白質功能的研究提供重要的信息，關于該基因的亞細胞定位目前還未見報道，只有王啟超等預測了該基因主要定位于細胞膜和細胞器膜。試驗結果表明，該基因主要在膜上表達，與預測結果相符。對HMGR基因進行原核表達分析，結果表明該基因可以成功地在大腸桿菌中表達，并得到了相應的蛋白。

目前為止，關于HMGR基因調控萜類物質代謝的研究已有很多，關于橡膠草HMGR基因在萜類物質代謝中作用的研究還未見報道。本研究使大量HMGR蛋白在煙草中積累，對煙草中三萜含量進行檢測，發現煙草葉中的三萜含量顯著提高。大量研究表明，在煙草中過量表達陽春砂的HMGR基因可以有效地促進甾醇的生物合成[14]。Chappell等在研究中發現，HMGR的活性提高可以誘導倍半萜環化酶的活性，進而提高了倍半萜的產量[15]。武瑩利用殼聚糖誘導雷公藤葉懸浮細胞，通過檢測發現3種萜類代謝物含量提高，HMGR基因表達水平也相應提高，表明HMGR基因對萜類物質的合成具有正調控作用[16]。目前研究表明，HMGR基因的表達可能控制著甲羥戊酸代謝、碳流的流向和萜類物質的合成[17]，為進一步研究橡膠草HMGR基因調控產膠代謝機理奠定了理論基礎。

本研究采用基因工程的方法，分別從原核表達、亞細胞定位和轉基因煙草3個方面對橡膠草HMGR基因進行了分析。原核表達分析結果表明，該基因編碼的蛋白相對分子質量為62659 1 ku；通過構建該基因的瞬時表達載體，運用葉盤轉化法侵染洋蔥表皮細胞對該基因編碼的蛋白亞細胞定位進行分析，表明該基因編碼的蛋白定位在細胞膜和核膜上，與生物信息學分析結果相一致；轉基因煙草的試驗結果表明，通過基因工程的方法可以控制煙草中萜類化合物的合成，從而提高煙草中總三萜的含量，為研究植物異戊二烯代謝途徑次生代謝產物的合成打下了基礎。

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