亞麻愈傷組織誘導和遺傳轉化體系建立

李雪　安勝軍　邵鐵梅

摘要：為了建立高效亞麻愈傷組織誘導體系，對亞麻的無菌苗培養(yǎng)、外植體愈傷組織誘導、愈傷組織繼代擴增3個方面進行了研究。同時對農桿菌介導亞麻愈傷組織遺傳轉化條件進行了初步探索。結果表明，亞麻無菌苗接種培養(yǎng)基為MSB+1 mg/L 6-BA時有利于亞麻愈傷組織出愈，適合亞麻愈傷組織誘導的培養(yǎng)基為MSB+01 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，或在此基礎上添加10 mg/L 2，4-D，2種培養(yǎng)基在愈傷組織誘導階段差別不大。愈傷組織繼代擴增培養(yǎng)基為MSB+01 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，在此培養(yǎng)基上，愈傷組織量在25 d時達到頂峰。由抗生素抗性試驗得出亞麻愈傷組織卡那霉素抗性臨界值為100 mg/L。亞麻愈傷組織轉化的方式為浸泡材料15 min后抽真空5 min較好，遺傳轉化率為31%。經PCR分析驗證，證明阿樸脂蛋白米蘭突變體外源基因已經整合至亞麻抗性愈傷組織基因組中。

關鍵詞：亞麻；愈傷組織；遺傳轉化

中圖分類號： S5632043文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0046-04

收稿日期：2017-01-20

基金項目：河北省教育廳高等學校科學技術研究項目（編號：ZD2014087）；河北省教育廳項目（編號：Z2015214）。

作者簡介：李雪（1979—），女，河北趙縣人，碩士，講師，從事植物生物反應器的研究。E-mail：lixue712@126com。

通信作者：安勝軍，博士，教授，從事動物細胞方面及蛋白類藥物的研究與開發(fā)。E-mail：sjsjan@126com。

亞麻是一種古老的栽培植物，包含13個屬300個種，主要于纖維用、油用、藥用等方面。亞麻是高度自花授粉作物，常規(guī)育種方法耗時且受到遺傳資源有限和近親雜交的障礙[3]，因此基因工程新技術應用于亞麻植物上勢在必行，而基因工程新技術的發(fā)展離不開植物愈傷組織快速誘導體系的建立。

自1975年至今，愈傷組織誘導在很多植物上均有研究，最早的有水稻[4]、楊樹[5]、甘蔗、大蒜、小麥[8]、紅豆杉[9]、大麥[10]、火龍果[11]、桑樹[12]等，且取得了成功。有關亞麻的愈傷組織誘導報道較少，國外亞麻組織培養(yǎng)方面的研究多集中在亞麻花藥愈傷培養(yǎng)上[13-16]，操作難度大，影響因素多，且重復性差。趙瑋等發(fā)表的有關亞麻下胚軸愈傷的研究[17]，在本實驗室未能很好的重復再現(xiàn)。同一基因型不同操作手法結果的差異，限制了亞麻愈傷組織誘導及基因轉化的發(fā)展。研究亞麻愈傷組織誘導及轉化，目的是以愈傷組織作為植物生物反應器原材料，轉入分泌型的外源基因，提取抗性愈傷組織的蛋白，用于后續(xù)的基因工程研究。

本研究對亞麻品種隴亞10號下胚軸進行愈傷組織的誘導，探索愈傷組織誘導、擴繁增殖的條件，并建立了亞麻愈傷組織的生長曲線，初步確定了基因轉化的條件，以期建立快速生長且可重復的亞麻轉基因愈傷組織誘導轉化體系，從而為亞麻基因轉化工程發(fā)展提供參考。

1材料與方法

亞麻種子隴亞10號由新疆農業(yè)科學院提供。

11種子消毒方法

挑選無破損的亞麻種子，75%乙醇消毒1 min，5%次氯酸鈉溶液消毒5 min，無菌水洗滌4次，沖洗干凈后浸泡無菌水中，置搖床上過夜萌發(fā)備用。培養(yǎng)基：所有的培養(yǎng)基均以MS[18]為基本培養(yǎng)基。

12無菌苗種植方法

將萌發(fā)好的種子接種于無菌苗生長培養(yǎng)基上，無菌苗生長培養(yǎng)基分別為MSB、MSB+1 mg/L 6-BA。

13下胚軸誘導愈傷方法

待無菌苗長至5～7 cm時，切其下胚軸，切為05～10 cm 的小段，分別放置下胚軸誘導愈傷的培養(yǎng)基上。每次接種50小段，水平試驗重復4次，使總接種量達到200小段左右。通過查閱資料，設置下胚軸誘導愈傷培養(yǎng)基：基本培養(yǎng)基附加不同濃度、種類植物生長調節(jié)劑（表1）。在（25±1）℃下暗培養(yǎng)7～14 d觀察外植體的形態(tài)變化，25 d后統(tǒng)計外植體出愈率。

14愈傷組織生長曲線的制定方法

愈傷從誘導開始，中間繼代2次后得到生長旺盛的愈傷組織。以此為基礎，相同鮮質量09 g的愈傷組織接種于固體培養(yǎng)基，共接種12瓶。暗培養(yǎng)，每隔2 d取1瓶，測定愈傷組織鮮質量，直至24 d。水平試驗重復1次，用2次鮮質量平均增長值制定亞麻愈傷組織生長曲線。

15繼代擴增愈傷組織最適培養(yǎng)基的選定方法

篩選愈傷生長外觀及形態(tài)均相似的2種培養(yǎng)基，采用上述方法制作愈傷組織生長曲線，最終確定繼代擴增愈傷組織的最佳培養(yǎng)基。

16亞麻愈傷組織對抗生素的敏感性試驗

含卡那霉素的培養(yǎng)基制備，分別為卡那霉素10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 mg/L處理各3瓶，共30瓶，則為3個重復試驗。每瓶均接種鮮質量1 g生長旺盛的愈傷組織，25 d后測量每瓶的鮮質量增長量，選取鮮質量未增長且減少的同一組處理，為愈傷組織的卡那霉素抗性臨界值。

17外源基因基于愈傷組織的農桿菌轉化方法

阿樸脂蛋白米蘭突變體基因命名為TA，含NPTII報告基因的質粒雙元表達載體由本實驗中心構建提供。侵染方法、時間等見表2。

注：農桿菌D值均為04～06。[HT][FK）]

侵染后，共培養(yǎng)3 d、抑菌培養(yǎng)7 d，抑菌用頭孢噻肟鈉工作濃度為300 mg/L。然后進入培養(yǎng)基抗性篩選階段。

18抗性愈傷組織的繼代培養(yǎng)及PCR鑒定

選取抗性愈傷繼代3次，確定無農桿菌污染后，進行外源基因PCR分析。提取抗性愈傷的基因組DNA，以未轉化的普通愈傷組織基因組DNA為陰性對照，阿樸脂蛋白米蘭突變體基因的質粒為陽性對照。設計阿樸脂蛋白米蘭突變體基因的擴增引物，引物命名為：endprint

其中1、2擴增阿樸脂蛋白的目的片段長度為750 bp，2、3擴增阿樸脂蛋白目的片段連接信號肽的長度為840 bp，4、5擴增阿樸脂蛋白目的片段連接信號肽、啟動子后的總長為 2 070 bp。

擴增程序為：95 ℃ 10 min、95 ℃ 1 min、60 ℃ 1 min、72 ℃ 50 s、72 ℃ 10 min，30個循環(huán)。反應完成后，采用 14%～16%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。

2結果與分析

21亞麻外植體培養(yǎng)

無菌苗生長的2種培養(yǎng)基，添加6-BA的培養(yǎng)基上無菌苗下胚軸不僅外觀形態(tài)較未添加的粗短，而且下胚軸誘導出愈時間較未添加的早，因此在誘導愈傷組織的外植體培養(yǎng)上，應選擇添加6-BA細胞分裂素的培養(yǎng)基。

22誘導愈傷

接種在不同培養(yǎng)基上的外植體出愈率、出根率、愈傷表披白霜率等見表3，采用DPS數(shù)據(jù)分析。結果表明，出愈率方面，培養(yǎng)基A5、A10與其他13種培養(yǎng)基有顯著差異，而這13種培養(yǎng)基間沒有明顯差異，出愈率均較高。在出芽率方面，幾種培養(yǎng)基間差異較大，其中A8、A9、A10培養(yǎng)基沒有芽發(fā)生，A2、A7、A14培養(yǎng)基芽發(fā)生率較低，芽發(fā)生率最高的為A4培養(yǎng)基。出根率，幾種培養(yǎng)基間也有顯著差異。A7、A8、A9、A10培養(yǎng)基沒有根發(fā)生，A2、A5、A14培養(yǎng)基根發(fā)生率較低，生根率最高的為A1培養(yǎng)基。愈傷表披白霜率方面，A0、A1、A2、A3、A4、A5、A6、A11、A12、A13、A14培養(yǎng)基上的愈傷組織沒有出現(xiàn)白霜，A7培養(yǎng)基上的愈傷組織白霜率最高。15種培養(yǎng)基上的愈傷組織顏色呈現(xiàn)2種，分別為黃色、黃白色，愈傷組織顏色好的培養(yǎng)基為A0、A1、A2、A3、A4、A5、A6、A11、A12、A13、A14，不好的培養(yǎng)基為A7、A8、A9、A10。不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的愈傷組織狀態(tài)，是衡量培養(yǎng)基合適與否的一個重要指標，從表3可以看出，A2、A14培養(yǎng)基培養(yǎng)的愈傷組織狀態(tài)最好，A7、A8、A9、A10培養(yǎng)基培養(yǎng)愈傷組織的狀態(tài)最差。綜合考慮各方面因素，亞麻誘導愈傷組織適合的培養(yǎng)基為A2、A14。

23愈傷組織生長曲線的制定

由不同培養(yǎng)天數(shù)亞麻愈傷組織的鮮質量增殖量，建立了亞麻愈傷組織的生長曲線（圖1），2種培養(yǎng)基愈傷組織的生長曲線均呈S形。從亞麻的愈傷組織生長曲線可以看出，2種培養(yǎng)基上的愈傷組織在0～7 d時呈現(xiàn)緩慢生長。從7 d開始，A2培養(yǎng)基上的愈傷進入快速增長期，至25 d達到頂峰，25 d后愈傷組織生長量開始下降。A14培養(yǎng)基上的愈傷組織，從7 d開始也進入快速增長期，至28 d時達到頂峰，但 17～28 d期間，愈傷組織呈現(xiàn)平穩(wěn)緩慢增長，28 d后愈傷組織生長量開始下降。從圖1可以看出，A2、A14 2種培養(yǎng)基上的愈傷組織生長達到頂峰時的愈傷組織增長量和時間有明顯的差異，A2培養(yǎng)基明顯優(yōu)于A14培養(yǎng)基，因此選定A2培養(yǎng)基為亞麻愈傷組織繼代擴增的最適培養(yǎng)基。

24卡那霉素臨界濃度值確定

從圖2可以看出，卡那霉素的濃度變化對亞麻愈傷組織的增殖量有明顯的抑制作用。隨著卡那霉素的濃度增加，亞麻愈傷組織生長的增殖量會相應減少。當卡那霉素濃度達到

100 mg/L 時，亞麻愈傷組織出現(xiàn)了負增長的現(xiàn)象，即25 d后亞麻愈傷組織鮮質量比初接種時鮮質量減少了021 g，因此，當侵染亞麻愈傷組織時，卡那霉素100 mg/L為抗性篩選濃度。

[FK（W11][TPLX2tif][FK）]

25愈傷組織的轉化分析

從表4可以看出，7種侵染方式中，只有A、B、D 3種方式能夠得到抗性愈傷，且侵染后愈傷組織的顏色會有差別。農桿菌與愈傷組織浸泡過夜后得到的愈傷均為灰白色，其他2種方式得到的愈傷組織為黃褐色和紅褐色。其中，抗性愈傷能夠在褐色愈傷組織上生長出白色愈傷組織（圖3）。A、B、D 3種方式的轉化率各不相同，以B方式最高，為31%。而A、D 2種方式的轉化率分別為267%、164%。因此，在用農桿菌轉化亞麻愈傷組織時，適宜采用B方式轉化，即對受體材料采取農桿菌菌液浸泡15 min，然后5 min抽真空處理轉化方式較好。

26PCR分析

PCR擴增結果（圖4）表明，隨機選取的抗性愈傷組織均擴增到和陽性對照質粒同樣大小的片段。阿樸脂蛋白的目的片段長度為750 bp，阿樸脂蛋白目的片段連接信號肽的長度為 840 bp，阿樸脂蛋白目的片段連接信號肽、啟動子后的總長為2 070 bp，樣品和質粒陽性對照片段大小均一致，且由于提取基因組DNA的樣品為經過3次繼代后的抗性愈傷組織材料，表明外源基因已經隨機整合到亞麻愈傷組織基因組DNA中，且穩(wěn)定遺傳。

3討論與結論

本研究在無菌苗培養(yǎng)階段，加入了植物生長調節(jié)劑，結果縮短了亞麻下胚軸的出愈時間，為獲得基因轉化的原材料節(jié)約了時間，以便能快速得到轉基因抗性材料，目前，還未見亞麻組培愈傷組織誘導在無菌苗培養(yǎng)階段進行處理的報道。

Horsch等在植物轉化上采用了葉片浸泡法[18]，本研究選擇的是愈傷組織浸泡、超聲或抽真空處理的轉化方法，這在愈傷組織轉化上屬于新創(chuàng)。本研究發(fā)現(xiàn)抽真空處理提高了愈傷組織的轉化率，但總體來說愈傷組織轉化率偏低，因此，提高愈傷組織轉化率方法還有待繼續(xù)研究。

選擇標記基因最早于1989年，McHughen將選擇標記基因應用在亞麻植物細胞的基因轉化中，并且獲得了成功[19]。本研究起初設計了潮霉素抗性基因，鑒于植物愈傷組織量大且使用抗生素造價問題，所以再次設計了卡那霉素抗性基因。同時，選擇標記基因的臨界濃度值對于轉基因產物的篩選至關重要，植物愈傷組織抗生素抗性臨界濃度值的確定不直觀，為了得到準確的愈傷組織抗生素抗性臨界濃度值，本研究采取了定期稱量愈傷組織增殖量的方法，多次重復以得到精準的卡那霉素抗性臨界濃度值，期望在以后研究出簡單實用適合植物愈傷組織篩選的抗生素濃度確定方法。endprint

在進行PCR分析時，一般僅需擴增轉入外源基因的目的片段即可，但在本試驗設計時，為了減少擴增結果假陽性的概率，同時進行了阿樸脂蛋白目的片段、阿樸脂蛋白目的片段和連接的信號肽、阿樸脂蛋白目的片段連接信號肽和啟動子，層層遞進式擴增，最終證明整個表達盒已經整合進抗性愈傷組織的基因組DNA中，保證了本試驗的嚴謹性。

本研究以隴亞10號下胚軸為外植體，摸索到適合隴亞10號愈傷誘導和繼代擴增的最佳培養(yǎng)基，建立了隴亞10號高效愈傷組織誘導體系。以愈傷組織為受體材料，研究了農桿菌介導愈傷組織的遺傳轉化條件，確定了轉化愈傷組織最佳的農桿菌侵染時間和方式，而且篩選到合適的抗生素臨界濃度。同時采用抗生素篩選和PCR電泳檢測雙重驗證了外源基因于愈傷組織基因組DNA中的整合。

參考文獻

Heywood V H Flowering plants of the world[M] New York：Smithmark Publishers，1978

Kole C Genome mapping and molecular breeding in plants[M] New York：Springer，2007

[3]Eec F W Flax：breeding and utilisation[M] New York：Springer，1988[HJ168mm]

[4]黃鴻樞，凌定厚，羨蘊蘭，等 稻花藥培養(yǎng)研究[J] 遺傳學報，1975，2（1）：81-88

[5]佐藤亨，趙云玉 楊樹花藥培養(yǎng)時誘導愈傷組織和器官變化[J] 吉林林業(yè)科技，1976（1）：46

[6]廣東省農科院水稻生態(tài)研究室提高甘蔗組織培養(yǎng)的愈傷組織誘導率和促進根系分化研究簡報[J] 廣東農業(yè)科學，1978（3）：51

[7]周云羅，錢迎倩，蔡起貴，等 從大蒜貯藏葉誘導愈傷組織及植株再生[J] 植物學報，1980，22（4）：402-403

[8]程煒中 小麥成熟種子胚愈傷組織的快速誘導研究[J] 山西農業(yè)科學，1990（3）：12-15

[9]陳永勤，朱蔚華，吳蘊祺，等 不同種類紅豆杉愈傷組織的誘導及紫杉醇含量的差異[J] 中草藥，2000，31（3）：216-219

[10][ZK（#]閆永榮，張正英，李靜雯，等 甘啤4號大麥幼胚愈傷組織誘導及植株再生的研究[J] 分子植物育種，2010，8（1）：89-93

[11]彭思維，王永清，范建新，等 火龍果莖段愈傷組織誘導及再生體系的建立[J] 核農學報，2015，29（5）：885-891

[12]王超，姚晨輝，朱林琳，等 桑樹愈傷組織誘導及懸浮細胞系的建立[J] 蠶業(yè)科學，2016，42（1）：23-29

[13]Chen Y R，Kenaschuk E O，Procunier J D Plant regeneration from anther culture in Canadian cultivars of flax （Linum usitatissimum L）[J] Euphytica，1998，102（2）：183-189

[14]Obert B，Dedi[KG-5]c[DD（-12][HT6]ˇ[DD）]ová B，Hricová A，et al Flax anther culture：effect of genotype，cold treatment and media[J] Plant Cell Tissue and Organ Culture，2004，79（2）：233-238

[15]Soroka A I Effect of culture medium composition on callus formation and regeneration in oil flax anther culture[J] Tsitol Genet，2004，38（2）：20-25

[16]Burbulis N，Blinstrubiene A，Masiene R，et al Influence of genotype，growth regulators and sucrose concentration on linseed（Linum usitatissimum L）anther culture[J] Journal of Food Agriculture and Environment，2012，10（3）：764-767

[17]趙瑋，黨占海，張建平，等 胡麻胚狀體誘導及植株再生的研究[J] 北方園藝，2010（21）：174-176

[18]Horsch R B，F(xiàn)ry J E，Hoffmann N L，et al A simple and general method for transferring genes into plants[J] Science，1985，227（4691）：1229-1231

[19]McHughen A Agrobacterium mediated transfer of chlorsulfuron resistance to commercial flax cultivars[J] Plant Cell Reports，1989，8（8）：445-449endprint