春季西葫蘆日光溫室黃瓜花葉病毒病發生規律與防蟲網的防控效果

毛曉紅　于毅　張秀霞

摘要：為探明西葫蘆日光溫室中黃瓜花葉病毒病發生規律和防蟲網隔離瓜蚜對該病毒病的防控效果，于2014、2015年在山東濟南地區開展田間定點調查和室內PCR檢測試驗。結果表明，在春季日光溫室西葫蘆生長期，西葫蘆帶毒植株4月中旬開始出現，之后帶毒率逐漸上升，5月下旬達30%左右。黃瓜花葉病毒病的發生與瓜蚜密度密切相關，瓜蚜密度達到一定程度后，出現西葫蘆帶毒植株，瓜蚜進入迅速增長期后，西葫蘆帶毒株率亦呈上升趨勢；春季日光溫室中帶毒瓜蚜在4月中旬開始出現，而后帶毒率呈逐漸上升趨勢，5月下旬達3611%～4556%。西葫蘆生長期用100目防蟲網隔離可降低西葫蘆植株帶毒率。該研究能為日光溫室西葫蘆病毒病科學防控提供理論依據。

關鍵詞：黃瓜花葉病毒（CMV）病；發生規律；瓜蚜；種群動態；防蟲網

中圖分類號： S4364211+9文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0096-03

收稿日期：2016-03-26

基金項目：公益性行業（農業）科研專項（編號：201303028）。

作者簡介：毛曉紅（1985—），女，山東煙臺人，研究方向為蔬菜病毒防控。Tel：（0531）83178008；E-mail：315159613@qqcom。

通信作者：張安盛，碩士，研究員，主要從事蔬菜病蟲害防控技術研究。Tel：（0531）83179542；E-mail：zhangansheng2003@163com。

黃瓜花葉病毒（cucumber mosaic virus，簡稱CMV）隸屬雀麥花葉病毒科（Bromoviridae）黃瓜花葉病毒屬（Cucumovirus），該病毒寄主范圍廣，可侵染包括葫蘆科、茄科、十字花科、豆科在內的1 000多種寄主植物[1-2]。寄主植物被侵染后表現為矮化、花葉、褪綠，同時還表現出斑駁、明脈及過敏性壞死等癥狀。自1916年CMV被首次確定為黃瓜花葉病病原以來，因其發生的普遍性和危害的嚴重性，已成為世界范圍內重要的、研究較多的RNA病毒之一，位居世界第4[3-4]。黃瓜花葉病毒病在自然界主要由蚜蟲以非持久性方式傳播，如瓜蚜（Aphis gossypii）、桃蚜（Myzus persicae）等，此類蚜蟲寄主范圍廣，在西葫蘆植株及其他蔬菜上發生嚴重，為黃瓜花葉病毒病的傳播提供了條件[5]。目前，黃瓜花葉病毒病在山東省蔬菜主產區日光溫室西葫蘆上發生面積大、危害嚴重，對日光溫室西葫蘆的安全生產造成了重大影響。

目前國內外學者對黃瓜花葉病毒的研究，主要有病毒的生物學特性、株系分化、綜合防控技術[8-10]等，鄭光宇研究了桃蚜對黃瓜花葉病毒新疆株的傳播特性[11]，但關于瓜蚜對日光溫室中黃瓜花葉病毒的傳播未見報道。本研究對山東省春季西葫蘆日光溫室黃瓜花葉病毒病發生規律、發生規律與傳毒介體瓜蚜種群動態的關系、西葫蘆生長期罩防蟲網隔離瓜蚜對病毒病的防控效果進行了分析，以期為西葫蘆病毒病的科學防治提供理論依據。

1材料與方法

11試驗地概況

試驗地點為山東省濟南市歷城區董家鎮張而村西葫蘆日光溫室，試驗地面積均為0067 hm2，西葫蘆品種為優美F1。黃瓜花葉病毒病調查定植時間分別為2014年3月4日、2015年3月12日、2015年9月4日，株行距為60 cm×100 cm，長勢良好。

12試驗儀器

TP600PCR儀（日本TaKaRa公司）；RXZ-280D-LED光照培養箱（寧波江南儀器廠）；5804R低溫冷凍離心機（德國Eppendorf公司）；凝膠成像儀（美國Alpha Innotech公司）；DYY-6C電泳儀（北京市六一儀器廠）；25～1 000 μL移液器（德國Eppendorf公司）；MDF-U4086S -80 ℃冰箱（日本SANYO公司）；MLS-3020高壓滅菌鍋（日本SANYO公司）；HD-920超凈工作臺（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）；MDF-U4086S -80 ℃冰箱（日本SANYO公司）。

13試驗材料

植物RNA提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，目錄號：DP432]；反轉錄試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司，目錄號：KR107]；Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司，目錄號：KT201]；TRIzol（美國Invitrogen公司）；DL2000Marker（ProbeGene公司）；三氯甲烷、異丙醇、無水乙醇（國藥集團化學試劑有限公司）；100目防蟲網（浙江省臺州市路橋區德農防蟲網廠，加工成100 cm×100 cm×100 cm 防蟲網罩，用于西葫蘆生長期罩網）。

14試驗方法

141西葫蘆植株和瓜蚜體內黃瓜花葉病毒PCR檢測

單頭蚜蟲RNA提取：將單頭蚜蟲置于15 mL離心管中，放入液氮中冷卻，用微型小杵研磨均勻；加入250 μL TRIzol試劑，室溫放置5 min；加入50 μL三氯甲烷混合物[三氯甲烷 ∶異戊醇（體積比）=24 ∶1]，振蕩混勻3 min；4 ℃、12 000 r/min離心 10 min，移上清至另一離心管中（約125 μL），加入等體積異丙醇（-20 ℃預冷），室溫放置10 min（夏天放于-20 ℃冰箱中預冷30 min），4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清，加入70%預冷的乙醇（250 μL）洗滌，4 ℃、12 000 r/min離心 5 min，待乙醇揮發后加入8 μL RNase-Free ddH2O。

植物基因組RNA提取：將西葫蘆葉片在液氮中磨碎；每50～100 mg組織加1 mL裂解液RZ，用勻漿儀進行勻漿處理；將勻漿樣品在室溫中放置5 min，使得核酸蛋白復合物完全分離；4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清，轉入1個新的無RNase的離心管中。 加入200 μL三氯甲烷，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 s，室溫放置3 min；4 ℃、12 000 r/min離心1 min，緩慢加入05倍體積無水乙醇，混勻（此時可能會出現沉淀）；將得到的溶液和沉淀一起轉入吸附柱CR3中，4 ℃、12 000 r/min 離心30 s，棄掉收集管中的廢液，將CR3放入收集管中，向吸附柱CR3中加入700 μL漂洗液RW，室溫靜置2 min，4 ℃、 12 000 r/min離心30 s，棄廢液，重復操作步驟，將吸附柱放入2 mL收集管中，4 ℃、12 000 r/min離心2 min，去除殘余液體，將吸附柱CR3轉入1個新的15 mL離心管中，加 30 μL RNase-Free ddH2O，室溫放置2 min，4℃、12 000 r/min 離心2 min，RNA于-80 ℃凍存。

反轉錄體系共20 μL：模板RNA 10 μL、Random 1 μL、dNTP 1 μL、Mix 1 μL，5×First-Stranf Buffer 4 μL、RNase-free ddH2O 3 μL，將所有試劑輕輕混勻后，按照程序（25 ℃ 10 min，42 ℃ 45 min，85 ℃ 5 min）進行反應。反應結束后cDNA于-20 ℃凍存。

PCR反應：使用CMV特異引物（上游引物5′-GATGGACAAATCTGAATCAACCAG-3′；下游引物5′-AACTGGGAGCACCCCAGATGTG-3′）進行擴增，反應體系為10 μL：cDNA 2 μL，F端、R端引物各05 μL，2×PCR MasterMix 5 μL，ddH2O 2 μL。PCR反應程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 10 min。PCR擴增產物進行15%瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。

142春季日光溫室西葫蘆植株上黃瓜花葉病毒病發生規律與瓜蚜種群動態的關系

日光溫室西葫蘆植株黃瓜花葉病毒病調查時間分別為2014年、2015年3月中旬至5月下旬（3月12日—5月26日），每10 d左右調查1次，每年調查8次。調查方法：在日光溫室東、西兩側分別保留2行西葫蘆作保護行，將日光溫室自東向西平均分為5個小區，在每個小區的中間位置選取西葫蘆2行，在每行西葫蘆的南、中、北各固定2株代表性西葫蘆，共固定60株西葫蘆；每次均調查固定西葫蘆植株上、中部5張葉片上瓜蚜數量；同時采集固定西葫蘆植株的葉片和30～40頭瓜蚜，室內用PCR方法檢測西葫蘆植株、瓜蚜對黃瓜花葉病毒的帶毒率。

15日光溫室西葫蘆生長期罩防蟲網對西葫蘆病毒病的防控效果

試驗時間為2015年9月上旬至11月中旬，西葫蘆定植時（2015年9月4日）用防蟲網將供試西葫蘆植株罩網隔離，共罩防蟲網罩36個，1個防蟲網罩對應西葫蘆苗2株。分別在西葫蘆定植后10、20、30、40 d揭掉防蟲網罩，每個處理重復3次，每次重復3個防蟲網罩；分別在揭防蟲網罩后5 min、10 d、20 d、30 d PCR檢測原先防蟲網內西葫蘆植株的帶毒率。

2結果與分析

21春季西葫蘆日光溫室黃瓜病毒病發生與瓜蚜種群動態的關系

圖1表明，2014、2015年3月中旬至5月下旬調查結果顯示，2年中日光溫室西葫蘆瓜蚜種群動態、黃瓜花葉病毒病發生規律基本相似，即單葉瓜蚜數量、西葫蘆帶毒株率整體均呈逐漸增長的趨勢。2年中西葫蘆帶毒植株均于4月中旬開始出現（病株率333%～500%），而后西葫蘆帶毒株率逐漸提高，到5月下旬達到高峰，2014、2015年帶毒株率分別為3167%、3000%；2014、2015年瓜蚜則分別于4月上旬、3月下旬開始出現，但此時瓜蚜數量較低，平均蚜量分別僅為217、021頭/張；4月中旬以后瓜蚜數量迅速增長，5月下旬達到最高值，平均蚜量分別為2689、2311頭/張。

從西葫蘆病毒病發生與瓜蚜種群動態關系來看，瓜蚜沒有發生或發生數量較低時，西葫蘆植株不帶毒；隨著瓜蚜數量的增長，西葫蘆帶毒植株開始出現；瓜蚜進入迅速增長期后，西葫蘆帶毒株率亦呈上升趨勢，西葫蘆植株帶毒率的提高與瓜蚜種群動態的增長密切相關。

22西葫蘆日光溫室瓜蚜帶毒率檢測

室內檢測結果顯示，春季日光溫室西葫蘆植株上，瓜蚜對黃瓜花葉病毒的帶毒率呈現逐漸上升趨勢：3月下旬至4月上旬，日光溫室瓜蚜帶毒率為0，4月中、下旬，瓜蚜帶毒率小幅度上升（222%～1389%），5月中旬至下旬，瓜蚜帶毒率迅速升高，2014、2015年5月下旬瓜蚜帶毒率分別達 3611%、4556%（表1）。

23西葫蘆生長期罩網隔離瓜蚜對西葫蘆病毒病的控制效果

表2表明，日光溫室西葫蘆罩100目防蟲網，罩防蟲網時間越長，揭防蟲網后相同時間內西葫蘆發病率越低。揭防蟲網后5 min采樣檢測，罩防蟲網40、30、20、10 d處理西葫蘆均未發病；揭防蟲網后10 d采樣檢測，罩防蟲網40、30、20 d處理的西葫蘆均未發病，罩防蟲網10 d處理的西葫蘆發病率為1667%，但4個處理無顯著差異；揭防蟲網后 20 d 采樣檢測，罩防蟲網40 d西葫蘆仍未發病，30 d處理的西葫蘆發病率為1667%，顯著低于罩防蟲網10、20 d處理（西葫蘆發病率10000%）；揭防蟲網后30 d采樣檢測，罩防蟲網40 d西葫蘆發病率為1667%，極顯著低于罩防蟲網10、20、30 d處理（西葫蘆發病率8333%～10000%）。

注：同列數據后不同小寫字母表示在005水平上差異顯著，不同大寫字母表示在001水平上差異顯著。

3結論與討論

本研究表明，春季日光溫室西葫蘆植株瓜蚜數量呈逐漸增長趨勢，西葫蘆植株對黃瓜花葉病毒的帶毒率呈逐漸上升趨勢，西葫蘆黃瓜花葉病毒病的發生與瓜蚜種群動態密切相關，即蚜蟲密度達到一定程度后，會導致西葫蘆帶毒植株的出現并且發病率持續上升。春季日光溫室西葫蘆植株帶毒瓜蚜出現時間為4月中旬，之后帶毒率逐漸上升；西葫蘆帶毒株率出現時間為4月中旬，帶毒株率也呈上升趨勢，進一步說明日光溫室西葫蘆病毒病的發生與帶毒瓜蚜密切相關。

在日光溫室西葫蘆中，被黃瓜花葉病毒入侵的帶毒瓜蚜取食健康西葫蘆使西葫蘆植株帶毒，其他健康瓜蚜取食帶毒西葫蘆植株后又成為帶毒瓜蚜，這些帶毒瓜蚜取食過程中又引起其他健康西葫蘆植株發病，這種惡性循環會導致日光溫室西葫蘆帶毒率越來越高。因此，阻斷外來瓜蚜入侵和殺滅日光溫室內部已有的瓜蚜是防控西葫蘆病毒病的關鍵。本研究表明，日光溫室西葫蘆生長期罩100目防蟲網隔離瓜蚜，可有效降低西葫蘆植株帶毒率，西葫蘆植株受帶毒瓜蚜危害越晚，發病株率越低，進一步說明日光溫室罩防蟲網切斷外來帶毒瓜蚜的入侵，是防治日光溫室西葫蘆病毒病的有效措施之一。

本研究明確了日光溫室西葫蘆病毒病發生規律、發生規律與傳毒介體瓜蚜種群的動態關系及西葫蘆生長期罩防蟲網隔離瓜蚜對病毒病的防控效果，為西葫蘆病毒病的科學有效防治提供了理論依據。但要實現對日光溫室西葫蘆病毒病徹底有效的防治，尚須開展大量工作，須要加強對西葫蘆抗病毒品種選育，以及對西葫蘆病毒病、瓜蚜與寄主之間的互作關系，特別是瓜蚜對病毒病的傳毒機制等的深入研究。

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