甘蔗葉內生真菌的多樣性

周寧　趙曉璐　謝慶武

摘要：從甘蔗葉中分離出內生真菌并對其多樣性進行分析。結果發現，從不同季節和不同葉片部位的甘蔗葉中共分離到172株內生真菌，通過菌落形態學特征和ITS序列鑒定這些內生真菌分屬為8屬10種；從夏季的葉片中分離到6屬8種，冬季的葉片中分離到7屬9種；從老葉中分離到全部的8屬10種，幼葉中分離到5屬6種。主要優勢種為曲霉屬（Aspergillus sp）和炭疽菌屬（Colletotrichum sp），兩者占總菌株分離數的85%以上。

關鍵詞：甘蔗葉；內生真菌；多樣性；分離；鑒定

中圖分類號： S182文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2017）16-0093-03

收稿日期：2016-04-07

基金項目：廣西壯族自治區研究生教育創新計劃（編號：P3130098105）。

作者簡介：周寧（1990—），男，河南新蔡人，碩士研究生，主要從事微生物制藥的研究。E-mail：zhaoxiaoluw@126com。

通信作者：謝慶武，碩士，副研究員，碩士生導師，主要從事生物技術的研究。E-mail：xqw@gxueducn。

植物內生真菌（endophytic fungi）是指其生活史中的部分或全部階段定植于健康植物組織內，不造成宿主植物明顯傷害的真菌，包括表生的腐生菌、潛伏性的病原菌和菌根菌。研究表明，植物內生真菌具有多種應用價值，其部分代謝產物具有抗腫瘤、抗菌[3]、抗氧化[4]等多種藥用活性；植物內生真菌與其宿主植物同樣也有較為緊密的關系，能夠調節宿主植物的生長發育[5]、增強宿主植物的抗逆性，影響宿主植物根部的土壤環境及微生物群落和生物防治植物病蟲害等[8]。甘蔗是重要的制糖經濟作物，我國南方等地均有廣泛種植，甘蔗葉作為甘蔗植株進行光合作用的主要部位，其內生真菌的多樣性分布可能對甘蔗植株的糖產量及品質有較高影響，但國內對甘蔗葉內生真菌的種類及分布情況鮮有研究。本研究主要對甘蔗葉內生真菌進行分離及鑒定，以期了解甘蔗葉內生真菌的多樣性，為合理開發利用甘蔗葉內生真菌資源提供依據。

1材料與方法

11試驗材料

試驗所用新鮮甘蔗葉采自廣西大學農學院試驗田。植物DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）。次氯酸鈉、乙醇、葡萄糖等均為國產分析純。

主要培養基為：PDA培養基（馬鈴薯200 g，瓊脂15 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，pH值自然）和PDB培養基（馬鈴薯 200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 L，pH值自然）。

12試驗方法

121內生真菌的分離與純化

采用組織分離法分離甘蔗葉內生真菌[9]。具體操作步驟為：取新鮮健康的甘蔗葉片用蒸餾水清洗干凈，切成長條狀，置于超凈工作臺內。首先使用活性氯含量為22%的次氯酸鈉溶液浸泡消毒5 min，無菌水沖洗3次；然后用體積分數為75%的乙醇浸泡消毒1 min，無菌水沖洗3次；用無菌剪刀將消毒后的葉片剪碎至長為2～4 mm 的小塊，分別置于PDA平板上，每板等距放置7塊，28 ℃ 下培養3～5 d。待葉片周圍長出足量菌絲體后，依據真菌的形態特征并采用平板劃線法進行菌株的純化。純化后的菌種保存至4 ℃冰箱備用。

122內生真菌的鑒定

菌落形態特征：取純化后的菌種接種至PDA培養基上培養，定期觀察、記錄各菌株生長過程中的菌落形態特征，并依據《真菌鑒定手冊》進行初步鑒定。

分子生物學鑒定：取純化后的菌種經PDB發酵后采用DNA提取試劑盒進行總DNA的提取，使用真菌通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增其58S rDNA-ITS序列。擴增產物回收純化后由深圳華大基因測序。

123數據處理與分析

測序后得到的ITS序列在NCBI數據庫中進行相似性檢索，并通過軟件MEGA60進行聚類分析，采用鄰接法（Neighbor-Joining），設置重復次數為1 000次、bootstrap值≥50%構建系統發育樹。

2結果與分析

21甘蔗葉內生真菌的分離與鑒定

211內生真菌的形態學特征

從甘蔗葉中共分離到172株內生真菌，依據真菌的菌落形態特征初步判斷有10種不同的菌株（表1、圖1），具體種屬須要依據分子生物學準確鑒定。

212內生真菌的系統發育樹

根據形態學特征初步判斷的10種不同的甘蔗葉內生真菌進行ITS序列的擴增，均獲得大小為500 bp左右的目的條帶（圖2），獲得的ITS序列測序后進行BLAST比對分析并構建系統發育樹（圖3）。依據序列的相似性原理進行菌種鑒定，其中相似性≥99%時可鑒定至種，相似性≥95%時可鑒定至屬。結果表明，172株甘蔗葉內生真菌分別屬于8屬10種，其中優勢菌群主要為曲霉屬（Aspergillus sp）、炭疽菌屬（Colletotrichum sp），分別占分離數的541%、314%。

22甘蔗葉內生真菌的分布

221不同葉片部位內生真菌的分布

從老葉中共分離到8屬10種內生真菌，分別為玉蜀黍赤霉菌（Gibberella zeae）、塔地囊孢殼菌（Glomerella tucumanensis）、意大利果皮葉點霉（Phyllosticta capitalensis）、喙突臍蠕孢（Exserohilum rostratum）、膠孢炭疽菌（C gloeosporioides）、小球腔菌屬（Leptosphaeria sp）、博寧炭疽菌（C boninense）、炭角菌屬（Xylaria sp）、黑曲霉（A niger）、棘孢曲霉（A aculeatus）；從幼葉中共分離到5屬6種內生真菌，分別為塔地囊孢殼菌、意大利果皮葉點霉、喙突臍蠕孢、膠孢炭疽菌、博寧炭疽菌、棘孢曲霉。表明不同葉片部位的內生真菌的分布有著較為明顯的差異，老葉比幼葉具有更豐富的內生真菌種類分布。

222不同季節內生真菌的分布

從夏季的葉片中共分離到6屬8種內生真菌，分別為玉蜀黍赤霉菌、塔地囊孢殼菌、意大利果皮葉點霉、膠孢炭疽菌、小球腔菌屬、博寧炭疽菌、黑曲霉、棘孢曲霉；從冬季的葉片中共分離到7屬9種內生真菌，分別為塔地囊孢殼菌、意大利果皮葉點霉、喙突臍蠕孢、膠孢炭疽菌、小球腔菌屬、博寧炭疽菌、炭角菌屬、黑曲霉、棘孢曲霉。其中，玉蜀黍赤霉菌僅在夏季的葉片中發現，喙突臍蠕孢和炭角菌屬僅在冬季的葉片中出現，表明不同季節甘蔗葉內生真菌有著不同的種群分布。

3結論與討論

甘蔗葉中共分離到172株內生真菌，通過菌落形態學

特征和ITS序列分析鑒定這些內生真菌分屬8屬10種，其中玉蜀黍赤霉菌、塔地囊孢殼菌、意大利果皮葉點霉、喙突臍蠕孢、膠孢炭疽菌、博寧炭疽菌為常見的植物病原菌，常常引起各種植物的病害。玉蜀黍赤霉菌是玉米穗腐病的主要病原菌之一[10]，塔地囊孢殼菌是引起甘蔗赤腐病的病原菌[11]，意大利果皮葉點霉普遍存在于各種柑橘中常引起柑橘的黑斑病[12]，喙突臍蠕孢經常感染香蕉葉造成香蕉的葉斑病，膠孢炭疽菌和博寧炭疽菌可以感染多種植物造成植物的炭疽病[14-17]。甘蔗葉內生真菌的主要優勢種為曲霉屬和炭疽菌屬，兩者占總分離數的85%以上，不同季節和不同葉片部位內生真菌的多樣性分布也有較高的不同。和文獻[18]比對后發現除炭角菌屬以外其他內生真菌均為首次在甘蔗葉中發現，表明不同地域條件對甘蔗葉內生真菌的多樣性分布具有很高的影響。本試驗結果表明，甘蔗葉內生真菌具有豐富的多樣性，對研究部分植物的致病菌傳播方式及甘蔗葉內生真菌的開發利用具有一定的價值。

參考文獻：

王磊，章衛民，潘清靈，等 白木香內生真菌的分離及分子鑒定[J] 菌物研究，2009，7（1）：37-42

Roopa G，Madhusudhan M C，Sunil K R，et al Identification of taxol-producing endophytic fungi isolated from Salacia oblonga through genomic mining approach[J] Journal of Genetic Engineering and Biotechnology，2015，13（2）：119-127

[3]Singh D，Rathod V，Ninganagouda S，et al Biosynthesis of silver nanoparticle by endophytic fungi Pencillium sp isolated from Curcuma longa（turmeric）and its antibacterial activity against pathogenic gram negative bacteria[J] Journal of Pharmacy Research，2013，7（5）：448-453

[4]Yadav M，Yadav A，Yadav J P In vitro antioxidant activity and total phenolic content of endophytic fungi isolated from Eugenia jambolana Lam[J] Asian Pacific Journal of Tropical Medicine，2014，7（1）：S256-S261

[5]任安芝，高玉葆 植物內生真菌一類應用前景廣闊的資源微生物[J] 微生物學通報，2001，28（6）：90-93

[6]梁宇，高玉葆 內生真菌對植物生長發育及抗逆性的影響[J] 植物學通報，2000，17（1）：52

[7]周勇，鄭璐雨，朱敏杰，等 內生真菌感染對禾草宿主生境土壤特性和微生物群落的影響[J] 植物生態學報，2014，38（1）：54-61

[8]Xiang L B，Gong S J，Yang L J，et al Biocontrol potential of endophytic fungi in medicinal plants from Wuhan Botanical Garden in China[J] Biological Control，2016（94）：47-55

[9]唐坤，李標，郭順星 河南產丹參內生真菌的多樣性分析[J] 中國藥學雜志，2015，50（7）：570-573[HJ165mm]

[10]盧維宏，黃思良，陶愛麗，等 來自南陽玉米穗腐病樣品的玉蜀黍赤霉菌的分離及其特性鑒定[J] 南陽師范學院學報，2010，9（12）：45-49

[11]吳夏明，沈萬寬，羅明珠，等 甘蔗赤腐病及其病原菌研究進展[J] 中國糖料，2015，37（6）：66-70

[12]王興紅，陳國慶，王衛芳，等 柑橘黑斑病（Citrus Black Spot）發生危害現狀和研究進展[J] 果樹學報，2011，28（4）：674-679

[13]林善海，黃思良，岑貞陸，等 環境因素對香蕉葉斑病菌喙突臍蠕孢生長和產孢的影響[J] 菌物學報，2013，32（2）：226-238

[14]張賀，許春青，賈靜，等 芒果膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌的室內毒力測定[J] 江蘇農業科學，2015，43（8）：128-130

[15]王凡，胡奎，江慧，等 9種殺菌劑對核桃炭疽病菌的抑制作用及聯合毒力[J] 江蘇農業科學，2015，43（6）：127-129

[16]黃金鳳，陳丙義，李金鳳，等 草莓上膠孢炭疽菌的分離與鑒定[J] 西南農業學報，2012，25（5）：1714-1719

[17]湯銥泠，周國英，李河，等 多基因序列鑒定油茶炭疽病原Colletotrichum boninense新種[J] 熱帶作物學報，2015，36（5）：972-977

[18]Stuart R M，Romo A S，Pizzirani-Kleiner A A，et al Culturable [JP3]endophytic filamentous fungi from leaves of transgenic imidazolinone-tolerant sugarcane and its non-transgenic isolines[J] Archives of Microbiology，2010，192（4）：307-313