消疕湯對大鼠銀屑病樣皮損處病理改變的影響*

胡文韜 賈敏 石惠

（貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 貴州貴陽550002）

●論著●

消疕湯對大鼠銀屑病樣皮損處病理改變的影響*

胡文韜 賈敏#石惠

（貴陽中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院 貴州貴陽550002）

目的：將大鼠誘導成銀屑病樣皮損模型，并對其進行治療，證實消疕湯對大鼠銀屑病樣皮損處病理改變有影響，為消疕湯的臨床應(yīng)用提供實驗室依據(jù)。方法：（1）將50只SD大鼠（雌雄各半）隨機分成五組，即空白組、造模組、造模后對照組、消疕湯組、阿維A膠囊組，除空白組正常飼養(yǎng)外，余四組用心得安乳液涂抹大鼠雙側(cè)耳廓皮膚，兩周后取下造模組大鼠雙側(cè)耳廓皮膚，顯微鏡下觀察病理改變見明顯銀屑病樣皮損改變后提示造模成功；（2）造模成功后消疕湯組和阿維A膠囊組分別予相應(yīng)藥物灌胃治療，兩周后取下各組大鼠雙耳組織，切片、HE染色觀察各組病理差異；（3）用Baker評分法對各組切片進行評分并進行統(tǒng)計學處理。結(jié)果：（1）除空白組以外，余四組在涂抹心得安乳劑2周后耳廓組織相繼出現(xiàn)局部紅腫、鱗屑增多、刮之易落、皮膚萎縮等癥狀，造模組送檢表現(xiàn)出角化過度、角化不全等典型銀屑病樣病理改變，Baker評分統(tǒng)計學處理結(jié)果示造模組與空白組相比較（P＜0.05）組間有統(tǒng)計學差異，提示造模成功；（2）經(jīng)消疕湯和阿維A膠囊治療后，其耳部組織的角化過度、角化不全等病理情況得到明顯改善，統(tǒng)計學處理結(jié)果示消疕湯組和阿維A膠囊組Baker評分與造模組相比較P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義，提示治療有效；（3）消疕湯組與阿維A膠囊組評分相比P=0.116＞0.05，差異無統(tǒng)計學意義，提示消疕湯和阿維A膠囊均有抑制角化過度、角化不全的作用，且療效無明顯差異。結(jié)論：（1）用心得安乳液涂抹制造銀屑病樣皮損的造模方法可行；（2）消疕湯和阿維A膠囊對銀屑病樣皮損處病理改變治療均有效。

銀屑病；消疕湯；阿維A膠囊

銀屑病又稱“白疕”，是一種常見的慢性復發(fā)性炎癥性皮膚病，典型的組織病理學改變主要為角化過度伴角化不全，角化不全區(qū)可見Munro微膿腫，顆粒層明顯減少或消失，棘層增厚，表皮突整齊向下延伸；真皮乳頭凸毛細血管擴張增生，炎細胞浸潤[1]。銀屑病具有發(fā)病率高、發(fā)病范圍廣、病程反復且難以治愈等特點[2]。目前，西醫(yī)的治療藥物如抗糖皮質(zhì)激素、維A酸類藥物、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑、細胞抑制劑、抗生素類藥物等[3]，其近期療效尚可但遠期療效較差。近些年中醫(yī)中藥以其療效確切、副作用小等優(yōu)點，在銀屑病的防治中越來越受到重視。消疕湯是賈敏教授多年診治銀屑病的臨床經(jīng)驗方，在臨床上運用近30年，療效頗佳[4]。本實驗通過銀屑病動物模型造成角化過度、角化不全、棘層肥厚等銀屑病樣組織病理改變，再通過藥物灌胃治療以達到或接近正常皮膚來證實該藥物的有效性。現(xiàn)報道如下：

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗選用清潔級SD大鼠50只，體重200～240 g，雌雄各半，SD大鼠標準飼料喂養(yǎng)，統(tǒng)一置于溫度25℃、濕度60%～70%動物房中飼養(yǎng)。

1.2 實驗材料及器械 消疕湯主要以生地20 g，黃芩、金銀花、連翹、烏梢蛇、桃仁、紅花、當歸、川芎、蒲公英、紫花地丁、法半夏各15 g，蜂房、水蛭各10 g為主方（中藥飲片劑由我院藥劑室提供及煎制）。5%心得安乳液由鹽酸普萘洛爾片（國藥準字H32020267）5 g、50%的乙醇（上海紫一試劑廠提供）100 ml、月桂氮卓酮（成都市科龍化工試劑廠提供）5 ml、聚乙烯吡咯烷酮（成都市科龍化工試劑廠提供）5 g配置而成。阿維A膠囊（國藥準字H20010126）、切片機（徠卡 -1850）、德國BMJ-Ⅲ型包埋機、顯微鏡等。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗流程 試驗動物分組→構(gòu)建銀屑病樣皮損模型→造模后分組處理→取耳部標本浸于4%多聚甲醛中固定→石蠟包埋→切片→HE染色→顯微鏡下觀察、拍照→統(tǒng)計學處理。

1.3.2 造模方法 參照普萘洛爾誘導耳部模型法[5]進行造模：五組大鼠正常飼養(yǎng)，除空白對照組不予處理，其余四組均予棉簽沾取5%心得安乳液均勻涂于大鼠雙側(cè)耳背皮膚，3次/d，連續(xù)2周，使其產(chǎn)生銀屑病皮損樣病理改變。

1.3.3 實驗分組 試驗動物隨機分組如下：A組：空白對照組10只SD大鼠，雌雄各半，同劑量生理鹽水灌胃2周后處死，切取雙側(cè)耳廓皮膚組織送檢；B組：造模組10只SD大鼠，雌雄各半，藥物涂擦2周，造模成功后處死，切取雙側(cè)耳廓皮膚組織送檢；C組：造模后觀察組10只SD大鼠，雌雄各半，造模成功后，予同劑量生理鹽水灌胃2周，處死切取雙側(cè)耳廓皮膚組織送檢；D組：消疕湯組10只SD大鼠，雌雄各半，造模成功后，予消疕湯灌胃治療2周，處死切取雙側(cè)耳廓皮膚組織送檢；E組：阿維A組10只SD大鼠，雌雄各半，造模成功后，予阿維A灌胃治療2周，處死切取雙側(cè)耳廓皮膚組織送檢。

1.3.4 治療 各組大鼠予精心飼養(yǎng)，造模后消疕湯組予消疕湯灌胃（藥物濃度18 g/kg，每次容量10 ml/kg，3次/d，持續(xù)2周）；阿維A組予阿維A灌胃治療（藥物濃度3 mg/kg，每次容量10 ml/kg，2次/d，持續(xù)2周；C組大鼠予同劑量生理鹽水灌胃2周）。

1.3.5 收集標本 各組大鼠飼養(yǎng)到預(yù)定時間，以頸椎脫位法處死，手術(shù)切除取下大鼠雙側(cè)耳廓皮膚組織標本經(jīng)取材、固定、修塊、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋后，石蠟切片，HE染色、封片。

1.3.6 石蠟切片 （1）固定：將切好的耳部組織立即投入4%多聚甲醛溶液中固定，密封，標上組別；（2）脫水：將固定好的組織置于加蓋的玻璃皿中，分別加入50%酒精→70%酒精→80%酒精→95%酒精→100%酒精→100%酒精脫水，每級持續(xù)0.5 h；（3）透明：脫水后置于1/2二甲苯+1/2無水乙醇（2 h）→純二甲苯（1.5 h）溶液中，經(jīng)二甲苯過渡置換出組織中的乙醇，使組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)；（4）浸蠟：將透明好的組織置于1/2石蠟+1/2二甲苯中，40℃烘箱30 min。再放入石蠟Ⅰ30 min、石蠟Ⅱ40 min。以除去組織中的透明劑（二甲苯），使石蠟滲透到組織內(nèi)部達到飽和程度以便包埋；（5）包埋：先提升恒溫箱的溫度至60℃，換純蠟3次，每次1 h，用硬電光紙疊紙盒，置于45～60℃的燙板上，倒入材料，補足石蠟，倒好后置于冷水盆中，待石蠟全部凝固后取出晾干；（6）切片：用切片機將已固定和修好的石蠟塊切出約5 μm厚的薄片；（7）粘片：將切下的薄片置于薄玻片上，然后置烘片臺上，使切片展開燙平，同時以記號筆在玻片上編號，放45℃恒溫箱中烘干。

1.3.7 HE染色 （1）脫蠟：將烘干的石蠟切片冷卻后浸入純二甲苯（10 min）→純二甲苯（10 min）→依次放入1/2二甲苯+1/2純乙醇、100%、95%、85%、75%乙醇中各5 min→蒸餾水沖洗2 min→切片放入蘇木精中染色約10 min→用自來水沖洗10 min使切片顏色變藍；（2）分化和漂洗：將切片放入1%鹽酸乙醇液中分化約20 s，自來水沖洗，見切片變紅顏色較淺即可再放入1%氨水中5 min，自來水充分沖洗使其恢復藍色；（3）脫水Ⅰ和復染：將切片放入75%乙醇→85%乙醇中各5 min。用0.5%伊紅乙醇液對比染色1min；（4）脫水Ⅱ和透明：將切片放入95%乙醇中洗去多余的紅色→放入無水乙醇中5 min→用吸水紙吸干多余的乙醇→放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各透明 5 min；（5）封藏：中性樹膠封片；（6）光鏡下觀察切片病理變化。

1.3.8 Baker法組織評分 手術(shù)切取大鼠兩側(cè)耳部標本，每只耳廓皮膚組織各制作1張切片，每組各選取20張切片進行顯微觀察和分析。對HE染色切片在光學顯微鏡10（目鏡）×40（物鏡）視野下逐一地觀察耳部皮膚病理變化，用PAS8000病理攝像系統(tǒng)進行拍照，分別隨機選取5個視野，參考Baker[6]的方法制定組織學評分標準。

1.3.8 統(tǒng)計學方法 運用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，各組大鼠耳部組織Baker評分以（x±s）表示，組間均數(shù)多重比較，采用LSD法。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠情況 2周后A組大鼠反應(yīng)靈敏、食欲好、二便調(diào)、毛色正常有光澤。余四組大鼠雙側(cè)耳廓及周圍出現(xiàn)脫毛現(xiàn)象，隨著涂藥次數(shù)增多，局部逐漸出現(xiàn)充血、腫脹，涂藥2周時局部可見明顯鱗屑，部分融合成塊狀，刮之易落，鱗屑剝落處顯現(xiàn)鮮紅色皮膚部分可見點狀出血，且該四組大鼠涂藥2周后均出現(xiàn)不同程度活動減少、精神萎靡、食量減少等癥。4周后，C組大鼠耳部皮損較2周前稍有好轉(zhuǎn)，肉眼可見鱗屑較之前稍減少，充血、腫脹稍減輕，余無明顯好轉(zhuǎn)，無新發(fā)皮損，D組和E組大鼠治療后耳廓皮膚可見新生毛發(fā)，無明顯充血、紅腫，無鱗屑及出血點，食欲好轉(zhuǎn)，活動量可，大小便調(diào)。D組大鼠較E組大鼠精神較好，E組大鼠有1只在三余周時出現(xiàn)尿血，另有一只大鼠死亡，經(jīng)解剖后發(fā)現(xiàn)胃腸無內(nèi)容物，飲水量較D組大，余情況D與E組無明顯差異。

2.2 HE染色觀察結(jié)果

2.2.1 A組 鏡下見皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮未見角化過度、角化不全、顆粒層缺乏、棘層增厚；真皮未見血管擴張充血周圍無炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 A組皮損組織學改變（HE×40）

2.2.2 B組 鏡下可見表皮層明顯增厚，可見不同程度角化過度，棘層肥厚，表皮凸延長并成波浪狀起伏，部分見Munro小膿腫；真皮層內(nèi)血管擴張充血、水腫伴炎性細胞浸潤，B組病理改變結(jié)合銀屑病組織病理學特點提示造模成功。見圖2。

圖2 B組皮損組織學改變（HE×40）

2.2.3 C組 和B組相比，除表皮層角化過度、角化不全稍改善以外，棘層肥厚、真皮層炎細胞浸潤、毛細血管擴張等無明顯改變，提示該造模方式造成的病理改變在不接受5%心得安乳液刺激的情況下可基本維持2周不變。見圖3。

圖3 C組皮損組織學改變（HE×40）

2.2.4 D組 鏡下可見表皮結(jié)構(gòu)完整，無明顯角化過度，棘層無明顯增厚，表皮突延長程度明顯減輕，未見Munro小膿腫，真皮層內(nèi)未見血管擴張充血及水腫，部分見炎性細胞浸潤，和B組病理改變相比較，差異顯著，且接近A組病理特點，提示消疕湯治療大鼠銀屑病樣皮損病理改變有效。見圖4。

圖4 D組皮損組織學改變（HE×40）

2.2.5 E組 和D組相比，皮膚結(jié)構(gòu)完整，表皮層基本無角化過度，真表皮交界較平整規(guī)則，8例無炎細胞浸潤，余無明顯差異，提示阿維A治療大鼠銀屑病樣皮損病理改變亦有效，且阿維A對角化過度改善較消疕湯稍好。見圖5。

圖5 E組皮損組織學改變（HE×40）

2.3 各組Baker評分結(jié)果 見表1。

表1 各自Baker評分統(tǒng)計學結(jié)果

表1 各自Baker評分統(tǒng)計學結(jié)果

組別 給藥劑量 標本數(shù)量 Baker評分結(jié)果A組B組C組D組（消疕湯）E組（阿維A）18 g/kg 3 mg/kg 20 20 20 20 20 F P 0.92±0.40 7.07±0.76 6.75±0.75 2.92±0.61 2.60±0.64 351.524＜0.001

2.3.1 空白組和造模組Baker評分比較 A組和B組Baker評分比較，結(jié)果有顯著差異（P=0.000＜0.05），造模組病理改變明顯，提示造模成功。見表2。

表2 空白組和造模組Baker評分比較

表2 空白組和造模組Baker評分比較

注：與A組比較，*P=0.00＜0.05。

組別 標本數(shù)量 Baker評分結(jié)果A組B組20 20 0.92±0.40 7.07±0.76*

2.3.2 造模組和造模后對照組Baker評分比較 B組與C組Baker評分比較，結(jié)果無明顯差異（P=0.116＞0.05），提示該造模方式造成的皮損改變可維持2周無明顯改變。見表3。

表3 造模組和造模后對照組Baker評分比較

表3 造模組和造模后對照組Baker評分比較

注：與 B 組比較，△P=0.116＞0.05。

組別 標本數(shù)量 Baker評分結(jié)果B組C組20 20 7.07±0.76 6.75±0.75△

2.3.3 造模組和消疕湯組及阿維A組Baker評分比較 B組與D組及E組Baker評分比較，結(jié)果有顯著差異（P=0.000＜0.05），提示消疕湯及阿維A膠囊對銀屑病樣皮損病理改變均有效。消疕湯組與阿維A組Baker評分比較，結(jié)果無明顯差異（P=0.116＞0.05），提示消疕湯和阿維A膠囊治療銀屑病樣皮損時對病理改變的療效無明顯差異。見表4。

表4 造模組和消疕湯組及阿維A組Baker評分比較

表4 造模組和消疕湯組及阿維A組Baker評分比較

注：與 B 組比較，＃P=0.00＜0.05；與 D 組比較，*P=0.116＞0.05。

組別 標本數(shù)量 Baker評分結(jié)果B組D組E組20 20 20 7.07±0.76 2.92±0.61＃2.60±0.64＃*

3 討論

銀屑病是由多種誘發(fā)因素共同作用的慢性炎癥性皮膚病，其病理學改變主要為角質(zhì)層細胞過度增生及角化不全、炎癥細胞浸潤、真皮毛細血管擴張等。銀屑病病因尚不完全清楚并難以根治，具有復雜的發(fā)病機制，且除人類外罕見于任何非人類動物，因此理想的動物模型對銀屑病的研究顯得格外重要。

銀屑病動物模型的模擬為銀屑病治療研究提供了很大的空間，但由于其發(fā)病機制的復雜性，迄今為止尚不能模擬出銀屑病的整體模型，只能創(chuàng)建出接近人類銀屑病典型皮損的模型。近年來國內(nèi)外關(guān)于銀屑病動物模型的建立主要有小鼠尾部鱗片模型、雌鼠陰道上皮模型、異種移植動物模型、T細胞皮內(nèi)注射構(gòu)建銀屑病動物模型、普萘洛爾誘導耳部模型法等[7]。1978年Gaylarde首次用普萘洛爾涂于豚鼠背側(cè)皮膚造成了表皮角化過度、角化不全和棘層增厚等類似銀屑病的組織病理改變，并指出該皮損和刺激性皮炎有本質(zhì)性的差異。刺激性接觸性皮炎指皮膚或黏膜接觸刺激性物品后局部皮膚出現(xiàn)紅斑、腫脹、丘疹、水皰、大皰直至壞死和潰瘍，而普萘洛爾則是通過阻滯β-腎上腺素能受體，降低細胞內(nèi)cAMP水平，從而使角質(zhì)形成、細胞增殖加速而造成角化過度、角化不全、棘層肥厚和角質(zhì)層內(nèi)多形核細胞浸潤等組織學改變。因其操作簡便、重復性好、價格低廉，該造模方法在被國內(nèi)外學者多次重復后證實普萘洛爾乳液外涂大鼠耳部2周后即可造成銀屑病樣動物模型[8]，且至今仍用于銀屑病的藥物篩選。

消疕湯是賈敏教授多年診治銀屑病的臨床經(jīng)驗方，對于進行期證屬血熱風燥型的尋常型銀屑病，療效頗佳。賈敏教授認為銀屑病患者多素體陽盛，既而感受外邪，或飲食辛辣，七情內(nèi)傷，體內(nèi)血熱內(nèi)蘊，久則耗傷陰血，使血熱煎熬成塊，瘀熱互結(jié)形成瘀血，致肌膚失養(yǎng)，瘀阻經(jīng)絡(luò)，疾病遷延難愈久。因此，將“從血論治”貫穿治療銀屑病始終。全方由十四味中草藥組成，以清熱解毒、祛風止癢為主，活血化瘀、消癰散結(jié)為輔，金銀花、連翹、黃芩、生地為君藥，共奏清熱解毒涼血之功；蜂房、烏梢蛇為臣藥，兩藥合用，增強祛風止癢之力；桃仁、當歸、紅花、川芎、水蛭共為佐藥，佐助君藥解毒散結(jié)之力，與君藥配伍，起到?jīng)鲅钛淖饔茫箾鲅粶⒒钛粍友黄压ⅰ⒎ò胂摹⒆匣ǖ囟樽羰顾帲渲衅压ⅰ⒆匣ǖ囟∏鍩峤舛尽⑾b力強，法半夏性溫、入脾胃經(jīng)，能燥濕散結(jié)、降逆止嘔，全方以寒涼藥為多，佐使藥法半夏可緩和藥性，能緩解因藥性寒涼而致的胃脘不適。

[1]趙辨.中國臨床皮膚病學[M].第3版.南京:江蘇科技出版社,2010.1016

[2]張建中.銀屑病的流行病學與危險因素[J].實用醫(yī)院臨床雜志,2013,10(1):4-6

[3]張學軍.皮膚性病學[M].第8版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2013.144

[4]賈敏,賀愛娟,夏瑰林,等.消疕湯治療尋常型銀屑病的療效觀察[J].貴陽中醫(yī)學院學報,2012,34(1):33-35

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The Effect of Xiaobi Decoction on Pathologic Changes of Rat Psoriasis-like Skin Lesions Expression

HU Wen-tao,JIA Min,SHI Hui

(The Frist Affiliated Hospital of Guiyang College of TCM,Guiyang,guizhou550002)

Objective:To treat rats with induced psoriasis-like skin lesions so as to confirm whether Xiaobi decoction has effect on pathologic changes of rat psoriasis-like skin lesions and provide an experimental basis for the clinical application of Xiaobi decoction.Methods:At first,50 SD rats with half males and half females were randomly divided into five groups,namely the control group,the modeling group,the control group after modeling,the Xiaobi decoction group and the acitretin capsule group.Propranolol emulsion was applied on the auricle skin of two ears in all rats except the control group,rats in the control group were fed normally.After two weeks,the auricle skins of two ears of rats in the modeling group were collected,and the pathologic changes under microscope showed obvious psoriasis-like skin lesions,indicating that the modeling was succeeded.Secondly,after success of modeling,rats in the Xiaobi decoction group and the acitretin capsule group were treated with intragastric administration of corresponding drugs respectively.The auricle skin tissues of two ears of rats of each group were collected,sectioned,and stained by HE to observe their pathological changes.Finally the sections of each group were scored using Baker score and analyzed statistically.Results:Except the control group,all other four groups exhibited local swelling,scales increasing,easy falling when scaling,skin atrophy and other symptoms in auricle tissues after two weeks of using propranolol emulsion.Typical psoriasis-like pathological changes like hyperkeratosis and parakeratosis are reported in submitted samples from the modeling group.The results of Baker scores demonstrated statistically significant differences between the modeling group and the control group(P＜0.05),which indicated the successful modeling.After the treatment using Xiaobi decoction and acitretin capsules,in auricle tissues the pathological conditions including hyperkeratosis,parakeratosis were significantly improved.Results showed statistically significant differences(P＜0.05)in the Xiaobi decotion group and the actitretin capsule group compared with modeling group,thus confirming the treatment effectiveness.The difference in scores between the Xiaobi decoction group and acitretin capsule group was not statistically significant(P=0.116),indicating that both Xiaobi decoction and acitretin capsules can inhibit hyperkeratosis and parakeratosis without significant difference in efficacy.Conclusions:It is feasible to build psoriasis-like skin lesion models by applying propranolol emulsion.Both Xiaobi decoction and acitretin capsule are proved to be effective in improving the pathological symptoms for psoriasis-like skin lesions.

Psoriasis;Xiaobi decoction;Acitretin capsule

R758.63

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2017.09.001

貴州省貴陽市科技計劃項目（編號：20151001）

# 通訊作者：賈敏，E-mail：281780920@qq.com

2017-05-03）