關于考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度實驗的誤差分析與改進

【摘要】本文對傳統的考馬斯亮藍測定蛋白質濃度的方法存在的問題進行了探討，并從減少實驗誤差的前提下對實驗細節進行了改進，并使該實驗成為設計嚴謹、操作簡便、數據可靠的生物化學實驗。

【關鍵詞】蛋白質濃度 比色法 考馬斯亮藍

【中圖分類號】G64 【文獻標識碼】A 【文章編號】2095-3089（2017）38-0248-01

考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度是生物化學中的經典實驗，是利用蛋白質-染料結合的原理，定量的測定微量蛋白濃度的快速、靈敏的方法。

1.考馬斯亮藍法測定蛋白質濃度實驗的基本原理

考馬斯亮藍G250的磷酸溶液呈棕紅色，最大吸收峰在465nm處。當與蛋白質結合時，溶液變成藍色，其最大吸收峰變為595nm，并且考馬斯亮藍G250-蛋白質復合物的高消光效應導致了蛋白質定量分析的高靈敏度。

依據朗伯-比爾定律，在一定濃度范圍內，考馬斯亮藍G250-蛋白質復合物的吸光度與蛋白質含量呈線性關系，其關系式為：A=kbC復合物，式中，A為吸光度，k為摩爾吸光系數，b為吸收層厚度，C復合物為考馬斯亮藍G250-蛋白質復合物的濃度。

如下圖表格所示，取8支干凈試管，并編號0-7。其中0號試管作為空白對照；1-6號試管按下表配方依次添加各種試劑，包括不同濃度的標準蛋白溶液；7號試管裝有未知蛋白液樣品。按比例混勻后，室溫靜置3min，于波長595nm處測得8支試管的吸光度值。取0-6號試管的吸光度值，以吸光度為縱坐標，各標準蛋白液濃度（ug/ml）為橫坐標作圖，繪制標準曲線；再根據標準曲線計算出考馬斯亮藍G250-蛋白質復合物的摩爾吸光系數k=A/bC復合物；最后將7號試管中未知蛋白液的吸光度代入公式C復合物=A/kb，即得求得蛋白質濃度。

2.實驗中存在的問題

（1）該實驗需要使用可見光分光光度計完成比色測定，學生初次使用可見光分光光度計進行比色測定，操作技術和流程不夠熟悉，耗時較長，往往不易獲得好的數據。

（2）該實驗中所使用的試劑，例如：考馬斯亮藍溶液、標準蛋白液、NaCl溶液等等，以及純水中存在著殘留蛋白質，也會對實驗造成干擾，影響標準曲線的繪制結果。

（3）該實驗中，0號試管中沒有加入任何蛋白液，作為空白組，理論上吸光度值為零，而實際測量中，由于溶液中殘留的蛋白質、吸收池以及儀器的系統誤差影響等，即使不加蛋白液，也存在著一定的可見光吸收，與朗伯-比爾定律計算公式A=kbC復合物的理論值不一致，從而造成標準曲線的繪制誤差。

（4）依據朗伯-比爾定律理論，溶液的濃度會導致定律發生偏離，即僅在一定濃度范圍內，考馬斯亮藍G250-蛋白質復合物的吸光度與蛋白質含量呈線性關系。

（5）在未知蛋白液的吸光度測量時，只有一個樣本，受系統誤差和人為誤差影響較大。

3.實驗的改進及解決方法

（1）給可見光分光光度計配備多聯池（最好六個樣品池），待繪制標準曲線時，僅需1次完成比色測定，大大提高檢測效率，并且6個不同濃度的標準品溶液幾乎同時測定，可消除考馬斯亮藍G250-蛋白質復合物的凝集沉淀影響。

（2）該實驗中所提到的試劑配制，例如：考馬斯亮藍溶液、標準蛋白液、NaCl溶液等等，以及所用到的純水均采用重蒸水，可最大限度的降低殘留蛋白質對本實驗的干擾。

（3）繪制標準曲線時，以0號試管（不加入任何蛋白質樣品）作參照，當不加任何蛋白質溶液時，手動設置吸光度值為零。在此基礎上，再測量標準蛋白液（1-6號試管）和未知蛋白液的吸光度值，從而盡可能減少對標準曲線繪制的影響。

（4）在測定未知蛋白液的蛋白質濃度時，可安排兩次完成。第一次測定時，依據標準曲線計算出未知蛋白液中蛋白質濃度的大致數值；第二次測定時依據標準曲線的良好線性范圍，對未知溶液作適當的稀釋，使之處于測量的最佳濃度范圍，從而獲得較為精確的數值。

（5）未知蛋白液準備三份，分別測定，最后取平均值，以盡可能減小系統誤差和人為誤差。

作者簡介：

毛伍祥（1986-），男，博士，講師，主要從事生物化學與分子生物學。endprint