芹菜素對裸鼠肝癌皮下移植瘤抑制作用的研究

高愛梅+程曉莉

[摘要] 目的 探討芹菜素（APG）對裸鼠肝癌皮下移植瘤的抑制作用及其相關(guān)機制。 方法 建立人肝癌阿霉素（ADM）耐藥細胞BEL-7402/ADM裸鼠皮下移植瘤模型，24只移植成功的裸鼠隨機分為三組：對照組（ADM 3 mg/kg）、APG組（APG 50 mg/kg+ADM 3 mg/kg）和miR-101 mimics組（miR-101 mimics 5 mg/kg+ADM 3 mg/kg），每組8只。上述藥物每3天注射l次，共7次。給藥結(jié)束后處死裸鼠，切取移植瘤組織。免疫組化法檢測Ki-67蛋白表達評價腫瘤細胞增殖，免疫蛋白印跡法檢測腫瘤組織核轉(zhuǎn)錄因子紅細胞系相關(guān)因子-2（Nrf2）蛋白的表達，qRT-PCR法測定移植瘤組織miR-101水平。 結(jié)果 與對照組相比，APG和miR-101 mimics能顯著抑制腫瘤生長（P < 0.05），抑制腫瘤細胞增殖（P < 0.05或P < 0.01），此外，APG和miR-101 mimics還能下調(diào)腫瘤組織Nrf2蛋白的表達（P < 0.01），上調(diào)miR-101表達（P < 0.05）。 結(jié)論 APG能有效抑制肝癌移植瘤生長，其機制可能與抑制腫瘤細胞增殖，上調(diào)miR-101表達和下調(diào)Nrf2表達有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 芹菜素；肝癌；化療增敏；核轉(zhuǎn)錄因子紅細胞系相關(guān)因子-2；miR-101

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）09（b）-0009-04

Inhibiting effect of apigenin on hepatocellar carcinoma xenografts in nude mice

GAO Aimei1 CHENG Xiaoli2

1.Department of Pharmacy， the Fifth People′s Hospital of Shanghai， Fudan University， Shanghai 200240， China； 2.Department of Pharmacy， Shenzhen Bao′an District Maternity and Child Health Care Hospital， Guangdong Province， Shenzhen 518133， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of apigenin （APG） on hepatocellar carcinoma xenografts in nude mice and the possible molecular mechanism. Methods Models of nude mice were transplanted with BEL-7402/doxorubicin （ADM）， and randomly divided into 3 groups， each group had 8 mice. The groups of mice were treated i.p. as follow： ADM （3 mg/kg， control group）， APG+ADM （50 mg/kg+3 mg/kg， APG group）， miR-101 mimics +ADM （5 mg/kg+3 mg/kg， miR-101 mimics group）， every three days for a total of seven times. The volumes of tumor were measured. After the end of medication， the mice were sacrificed for measurement of tumor weights. Tumor cell proliferation was analyzed by Ki-67 immunostaining. Nuclear factor erythroid-2-related factor 2 （Nrf2） protein level was measured by Western blot. miR-101 level was detected by Real-time PCR. Results The volumes and weights of tumors in APG group and miR-101 mimics group were decreased compared with the control group （P < 0.05）. Compared to the control group， APG and miR-101 mimics resulted in inhibition of tumor cell proliferation （P < 0.05 or P < 0.01）， inhibition of Nrf2 expression （P < 0.01）， and up-regulation of miR-101 levels （P < 0.05）. Conclusion APG can inhibit the growth of hepatocellar carcinoma， its mechanism may partly be to inhibit the expression of Ki-67 and Nrf2， up-regulate the level of miR-101.

[Key words] Apigenin； Hepatocellular carcinoma； Chemosensitization； Nrf2； miR-101endprint

芹菜素（4'，5，7-trihydroxyflavone，apigenin，APG）是天然存在的一種黃酮類化合物，廣泛存在于多種水果、蔬菜、豆類和茶葉中。研究發(fā)現(xiàn)，芹菜素具有抗氧化、抗誘變、抗炎癥、抗腫瘤等多種藥理活性[1-4]。多項研究表明芹菜素對腫瘤具有抑制作用，其主要作用機制包括抗腫瘤細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞侵襲、轉(zhuǎn)移以及抗氧化等[5-8]。因此，芹菜素作為一種天然高效低毒的抗腫瘤藥已成為目前腫瘤治療研究的熱點之一[9-10]。筆者前期實驗發(fā)現(xiàn)，APG可逆轉(zhuǎn)人肝癌阿霉素（doxorubicin，ADM）耐藥細胞BEL-7402/ADM的耐藥，增強ADM化療敏感性，增加細胞內(nèi)ADM的蓄積[11]。APG這種協(xié)同抑癌作用可能與下調(diào)耐藥細胞核轉(zhuǎn)錄因子紅細胞系相關(guān)因子-2（nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2）信號通路有關(guān)。為了進一步研究APG在體內(nèi)的抗腫瘤活性，本研究構(gòu)建裸鼠肝癌皮下移植腫瘤動物模型，探討APG的體內(nèi)抗腫瘤活性及相關(guān)機制，以期為肝癌耐藥的治療提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

APG，陜西慧科植物開發(fā)有限公司；RPMI-1640，美國GIBCO公司；小牛血清，杭州四季青生物工程公司；胰蛋白酶，美國Amresco公司；ADM，浙江海正藥業(yè)股份有限公司；鼠抗人Ki-67單克隆抗體、即用型二步法（非生物素）免疫組化檢測試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗人Nrf2抗體，美國Santa Cruz Biotechnology 公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG，美國Jackson免疫研究實驗室；TRIzol，美國Invitrogen公司；實時熒光定量PCR試劑盒，TaKaRa公司；定量PCR儀，美國ABI公司。

1.2 細胞和動物

BEL-7402/ADM人肝癌耐藥細胞購自南京凱基生物科技公司，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)。BALB/c-nu雌性裸小鼠，體重為22～24 g，鼠齡4～5周，購于北京華阜康生物公司，動物合格證號：SCXK（京）2014-0004。按規(guī)定飼養(yǎng)于實驗動物中心的SPF屏障系統(tǒng)內(nèi)。

1.3 裸鼠肝癌模型的建立及分組給藥

取對數(shù)生長期的BEL-7402/ADM細胞，經(jīng)胰酶消化，離心洗滌2次后，用生理鹽水調(diào)整至濃度為3×107/mL。取細胞懸液0.3 mL，用1 mL注射器將細胞接種到裸鼠右腋下皮下組織，10 d左右可觸及米粒大小結(jié)節(jié)。挑選出體積為50 mm3左右的裸鼠24只進行分組：對照組（ADM 3 mg/kg腹腔注射）、APG組（APG 50 mg/kg+ADM 3 mg/kg腹腔注射）和miR-101 mimics組（miR-101 mimics 5 mg/kg瘤內(nèi)注射+ADM 3 mg/kg）腹腔注射，每組8只。上述藥物每3天腹腔注射l次，共7次。給藥后每3天測移植瘤體積。移植瘤體積按公式V=ab2/2（a=瘤長，b=瘤寬）計算[12-14]，并繪制生長曲線。末次給藥后第2天，頸部脫臼法處死荷瘤鼠，剝離瘤體，觀察大體形態(tài)并稱取瘤重。

1.4 免疫組化檢測

瘤組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后包埋脫水，制成5 mm厚的切片。切片常規(guī)脫蠟，加入3%過氧化氫室溫孵育10 min，PBS漂洗3次；用0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液微波修復5 min，PBS漂洗3次；加入正常兔血清37℃孵育15 min，以封閉非特異性抗原；加一抗Ki-67多克隆抗體（1∶200），37℃孵育2 h，PBS漂洗3次；滴加相應的二抗，37℃孵育20 min，PBS漂洗3次；DAB顯色，蘇木精復染核，逐級脫水，透明，封片。染色結(jié)果的判定標準：細胞核可見棕黃色顆粒，即Ki-67染色陽性表達。每張切片隨機選取5個高倍視野，計數(shù)陽性染色細胞數(shù)，計算平均增殖指數(shù)。增殖指數(shù)=（陽性染色細胞數(shù)/腫瘤細胞總數(shù)）×100%。

1.5 Western blot檢測

取適量瘤組織，攪碎成勻漿，裂解獲得蛋白。根據(jù)BCA試劑盒說明對蛋白濃度進行測定。蛋白上樣，SDS凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，一抗孵育，4℃過夜，二抗室溫孵育1 h，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用Image J軟件對各抗體條帶灰度值進行統(tǒng)計。

1.6 qRT-PCR檢測

TRIzol提取組織總RNA，按試劑盒說明將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進行PCR擴增，以U6為內(nèi)參。miR-101上游引物：5′-CGGCGGTACAGTA CTGTGATAA-3′，下游引物5′-CTGGTGTCGTGGAGTC？鄄GGCAATTC-3′；U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCA？鄄CA-3′，下游引物5′-AACGCTTCACGAATTTG？鄄CGT-3′。反應條件：95℃ 15 min，95℃ 15 s，55℃ 20 s，70℃ 30 s，30個循環(huán)反應。實驗結(jié)果應用2-ΔΔCt方法進行相對定量分析。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠一般情況和腫瘤生長狀況

接種10 d左右，裸鼠皮下可見粟粒大小的類圓形結(jié)節(jié)，質(zhì)硬，不可活動。在接種后的前20 d，腫瘤增長緩慢，裸鼠精神良好，反應敏捷，飲食、大小便及活動正常，移植瘤未見破潰；在接種后的第21～30天，腫瘤增長速度開始加快，裸鼠精神狀態(tài)較之前變得萎靡不振、活動減少、反應遲鈍、消瘦等；從第30天以后，腫瘤增長速度更加迅速，裸鼠變得愈加萎靡不振，基本上不活動，飲食和飲水量急劇減少，身體愈加消瘦。整個實驗過程中無裸鼠意外死亡。endprint

2.2 抗腫瘤作用

待移植模型成功建立后（接種后第21天）確定分組并開始給藥。治療開始后每3天測量一次移植瘤體積，并繪制生長曲線。結(jié)果顯示，對照組腫瘤生長最快。與對照組相比，APG、miR-101 mimics組移植瘤生長受到明顯抑制。用藥結(jié)束后處死裸鼠，剝離瘤體，觀察其大體形態(tài)可見：腫瘤呈結(jié)節(jié)狀，包膜完整，血供豐富，切面呈灰白色，無周圍組織浸潤及出血壞死灶。移植瘤稱重結(jié)果顯示，與對照組相比，APG、miR-101 mimics組瘤重均呈不同程度的抑制，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）；APG組與miR-101 mimics組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖1。

2.3 肝癌移植瘤組織Ki-67的表達

Ki-67是反映細胞增殖活性的細胞核抗原。結(jié)果顯示，Ki-67抗原表達于移植瘤細胞核內(nèi)，陽性細胞呈棕黃色或棕褐色，其中對照組腫瘤組織可見大量片狀棕黃色陽性表達，而其余各治療組細胞陽性表達較對照組少。結(jié)果表明，與對照組相比，APG與miR-101 mimics均可抑制移植瘤細胞增殖，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.01或P < 0.05）；APG組與miR-101 mimics組比較，Ki-67的表達明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖2（封三）。

2.4 Western blot檢測移植瘤組織Nrf2蛋白表達

Western blot測定移植瘤組織Nrf2蛋白的表達水平。結(jié)果顯示，在APG及miR-101 mimics組Nrf2蛋白的表達明顯低于對照組（P < 0.01），提示APG與miR-101 mimics抑制肝癌移植瘤的作用可能與下調(diào)Nrf2蛋白有關(guān)。APG組與miR-101 mimics組比較，Nrf2蛋白的表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖3。

2.5 qRT-PCR檢測移植瘤組織miR-101的表達

結(jié)果顯示，在APG及miR-101 mimics組，miR-101的表達明顯高于對照組（P < 0.05），提示APG及miR-101 mimics抑制肝癌移植瘤的作用可能與上調(diào)miR-101有關(guān)。APG組與miR-101 mimics組比較，miR-101的表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見圖4。

3 討論

化療是肝癌綜合治療的重要手段之一。ADM是常用的肝癌化療藥，屬細胞周期非特異性藥物，具有強烈細胞毒性，可抑制腫瘤細胞RNA和DNA合成[15]，但其副作用也非常明顯，主要表現(xiàn)為多器官毒性，包括肝毒性、心臟毒性和骨髓抑制等，且長期應用還容易降低機體敏感性，導致化療失敗[16]。因此，在肝癌化療過程中降低化療藥毒副作用，增強其敏感性，提高化療效果己成為目前亟待解決的難題。

前期實驗發(fā)現(xiàn)，APG在體外可明顯增加BEL-7402/ADM對抗腫瘤藥的敏感性，其機制與下調(diào)PI3K/Akt/Nrf2信號通路有關(guān)。本實驗構(gòu)建了BEL-7402/ADM裸鼠肝癌皮下移植瘤模型，進一步研究了APG在體內(nèi)對肝癌細胞的作用。結(jié)果顯示，APG組和miR-101 mimics組腫瘤生長均較對照組明顯減慢；比較各組抑瘤率結(jié)果顯示，APG組和miR-101 mimics組瘤重均呈不同程度的抑制。Ki-67是與細胞增殖相關(guān)的核抗原，它是存在于增生細胞核的一種非組蛋白核蛋白，故可用于識別生長中的正常細胞和腫瘤細胞，評價細胞增生情況[17-20]。免疫組化結(jié)果顯示，APG組與miR-101 mimics組的增殖指數(shù)明顯低于對照組；上述體內(nèi)實驗結(jié)果表明，APG與miR-101 mimics可能通過抑制腫瘤細胞增殖，從而起到增強ADM抗癌效果的作用；進一步Western blot檢測瘤組織Nrf2蛋白的表達，結(jié)果顯示，APG與miR-101 mimics能夠降低移植瘤Nrf2蛋白的表達；qRT-PCR法測定瘤組織的miR-101水平，結(jié)果顯示，在APG及miR-101 mimics組，miR-101的表達明顯高于對照組。提示APG增加BEL-7402/ADM對ADM的敏感性可能與miR-101和Nrf2有關(guān)。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示APG可能通過上調(diào)腫瘤組織miR-101表達、下調(diào)腫瘤組織Nrf2表達，抑制腫瘤細胞增殖，進而有效提高肝癌細胞對ADM的化療敏感性，促進其抗癌療效。

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（收稿日期：2017-06-12 本文編輯：程 銘）endprint