響應面優化HS-SPME-GC/MS檢測啤酒微量酯類物質條件

許 楊，王德良*，李 紅，閆寅卓，宋 濤

（中國食品發酵工業研究院，北京 100015）

響應面優化HS-SPME-GC/MS檢測啤酒微量酯類物質條件

許 楊，王德良*，李 紅，閆寅卓，宋 濤

（中國食品發酵工業研究院，北京 100015）

該研究采用Plackett-Burman和Box-Behnken試驗設計，對頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法（HS-SPME-GC/MS）檢測啤酒中6種低含量酯類物質（辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯）的萃取條件進行優化，發現萃取溫度、萃取時間和平衡溫度為主要影響因素，通過響應面法分析得出最佳萃取條件為：萃取溫度42℃、萃取時間30 min和平衡溫度48℃；在該條件下，結合內標法定量，該方法的相關系數R2為0.990 0～0.999 9，回收率為93.43%～103.37%，檢測限為0.01～0.05 μg/L，相對標準偏差（RSD）為1.75%～8.24%，表明該方法準確可靠，可應用于啤酒中微量酯類物質的檢測。

啤酒；微量酯類物質；頂空固相微萃取-氣相色譜質譜法；響應面法；檢測分析

啤酒中的揮發性風味成分包括醇類、酯類、醛類、酮類、硫化物等[1]。其中，高級醇和酯類對啤酒質量至關重要。啤酒中酯類含量遠不及高級醇，但是酯類物質具有更高的風味貢獻度[2]。啤酒中的酯類，按其揮發性又可分為揮發性酯和非揮發性酯。酯類通常具有很強的“果香味”[3]，適量的酯能使酒體豐滿，香味協調[4-5]。酯類含量過高賦予啤酒不舒適的苦味和果味，過低則使啤酒淡寡[6]，影響啤酒風味的協調性[7-8]。另外，DAAN S等[9]發現酯類對老化物質有掩蔽作用，向比利時貯藏啤酒中添加乙酸異戊酯，可以提高2-甲基丁醛、甲硫基丙醛、苯乙醛等老化物質的閾值，因此可以有效掩蓋啤酒中老化物質帶來的不愉悅的氣味。

現在關于啤酒中酯類風味貢獻度的研究主要集中在乙酸乙酯、乙酸異戊酯等幾個主要酯類物質[10-11]，其他閾值低、啤酒中含量也低的某些特征酯類物質有待進一步研究分析。前期采用頂空固相微萃?。╤eadspace solid-phase microextraction，HS-SPME）-結合氣相色譜-嗅聞-質譜法（gas chromatography-olfactometry-mass spectrometry，GCO-MS）[12-14]對市售不同品牌貯藏啤酒進行檢測分析，發現辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯等6種酯香氣較愉悅。這些酯類因其含量較少，無法一次性全面對其定性定量檢測分析，對深入研究啤酒中含量較低的酯類物質的風味貢獻度造成了困難。

采用固相微萃取對目的物進行富集過程中，影響萃取效率的因素很多，如萃取柱極性、萃取溫度、萃取時間、解吸時間等[15-16]。響應面法可反映自變量變化對響應值的影響，并且可以分析自變量之間的相互作用，得到最優檢測條件[17-18]。本研究采用Plackett-Burman和Box-Behnken試驗設計優化檢測啤酒中酯類物質的萃取條件。在獲得的最優萃取條件下，結合內標法，建立了同時測定辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯6種酯類風味化合物的方法。在這些酯類中，如辛酸乙酯、乙酸異丁酯和乙酸苯乙酯具有較愉悅的香氣特征[19]，以期提升啤酒的香氣，可用于啤酒風味、新產品研發等多個領域，對實際生產有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售啤酒A：產地武漢；啤酒B、啤酒C：產地北京。

NaCl（分析純）、無水乙醇（色譜純）：北京化工廠；2-壬醇（純度≥98%）：美國Fluka公司；辛酸乙酯、乙酸異丁酯、丁酸乙酯（純度均≥98%）：比利時Acros Organics公司；乙酸苯乙酯（純度≥98%）：美國Sigma公司；苯甲酸乙酯（純度≥98%）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；3-苯基丙酸乙酯（純度≥98%）：北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Clarus 600型氣相色譜-質譜聯用儀：美國PerkinElmer公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取頭及萃取手柄：美國Supelco公司；AUX 320分析天平：日本島津公司；Xutemp恒溫水浴鍋：杭州雪中炭恒溫技術有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準試劑的制備

標準溶液的配制：準確配制質量濃度為10 mg/L的辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯標準儲備液，然后再用無水乙醇配分別配制成0.25 mg/L，0.50 mg/L，1.00 mg/L，2.00 mg/L的混合標準工作液，4℃避光處保存待用。

內標儲備液的配制：準確移取2-壬醇，用無水乙醇配制成10 mg/L的內標儲備液，然后再用無水乙醇配制成2.00 mg/L標準工作液，4℃避光處保存待用。

1.3.2 樣品中揮發性風味物質的提取

啤酒預先在4℃冰箱冷藏24 h，取10 mL樣品瓶依次加入3.0 g NaCl、5.0 mL啤酒樣品、0.3 mL 2-壬醇內標溶液，放入磁力攪拌轉子，加墊密封，樣品在一定溫度下平衡。平衡結束后，插入SPME萃取頭，萃取頭暴露于樣品瓶頂空部分，萃取一定時間。萃取結束后，將SPME萃取頭迅速插入GC進樣口中，在250℃不分流模式下解吸。

1.3.3 GC-MS分析條件

氣相色譜條件：WAX ETR毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.50 mm）；進樣口溫度220℃；載氣為氦氣，恒定流速1.2 mL/min；不分流進樣；柱箱升溫程序為：初始溫度40℃，保持3 min，以5℃/min升至215℃，保持3 min。

質譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源；電子能量70 eV，傳輸線溫度280℃，離子源溫度230℃；四級桿溫度150℃；溶劑延遲3 min；質譜掃描范圍40～600 u。

將實驗譜圖與美國國家標準及技術研究所（national institute of standards and technology，NIST）質譜數據庫比較和標樣定性兩種方法結合進行組分定性。在優化的萃取條件下，采取內標法對6種特征酯類物質進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman試驗設計

選取進樣量（X1）、解吸時間（X2）、攪拌速率（X3）、平衡溫度（X4）、平衡時間（X5）、萃取溫度（X6）、萃取時間（X7）和NaCl添加量（X8）8個因素作為自變量，每個因素選取高低（1和-1）2個水平，采用Plackett-Burman設計找出對風味物質峰面積（主要包括酯和醇）有顯著影響的因子，其因素與水平設計見表1。響應值為風味物質（酯和醇）色譜峰面積（Y），Plackett-Burman試驗設計與結果見表2。利用Design Expert 8.0.6對試驗數據進行分析，結果見表3。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design

表2 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 2 Design and results of Plackett-Burman experiments

由表3可知，萃取溫度、萃取時間、平衡溫度3個因素經過分析確定為極顯著（P＜0.01），而NaCl添加量顯著性分析為對結果影響顯著（P＜0.05）。因此，選取萃取溫度、萃取時間和平衡溫度作為主要影響因素進行響應面分析。

表3 Plackett-Burman試驗結果顯著性分析Table 3 Significance analysis of Plackett-Burman experiments results

2.2 Box-Behnken試驗設計優化參數水平

通過Plackett-Burman試驗設計獲得萃取溫度（A）、萃取時間（B）、平衡溫度（C）為主要影響因素。以酯類物質總峰面積（Z）為響應值，進行3因素3水平的Box-Behnken試驗設計，因素與水平見表4，試驗設計及結果見表5，方差分析見表6。

表4 Box-Behnken試驗因素與水平Table 4 Factors and levels of Box-Behnken experiments

表5 Box-Behnken試驗設計與結果Table 5 Design and results of Box-Behnken experiments

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

利用Design Expert對試驗數據進行多元回歸分析，得到回歸擬合方程如下：

Z=47.23-1.39A-11.39B+1.05C+7.26AB+0.28AC+2.25BC-5.41 A2-8.24B2-2.50C2

由表6可知，萃取時間對結果影響極顯著（P＜0.01），且萃取時間的二次項、A和B的交互作用對結果影響顯著（P＜0.05），模型極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），表明所建立的模型可用于啤酒中酯類物質總峰面積的分析。

根據回歸方程繪制響應面分析圖，以確認萃取溫度、萃取時間和平衡溫度對啤酒中酯類檢測的影響，響應面曲線和等高線如圖1所示。

由圖1可知，萃取溫度與萃取時間交互作用顯著，與表6中交互項P值的分析結果一致。響應面的坡度較為陡峭，表明酯類物質的響應值對萃取時間和萃取溫度的變化較為敏感。在萃取溫度不變的條件下，隨著萃取時間的延長，酯類物質響應值降低；在萃取時間不變的條件下，隨著萃取溫度的升高，酯類物質響應值呈現先略微上升然后下降的變化趨勢。

采用Designer Expert軟件分析，酯類物質固相微萃取最佳萃取條件為萃取溫度41.95℃、萃取時間30 min、平衡溫度47.12℃，在此條件下，酯類物質總峰面積的預測值為54.05×107?？紤]到實際操作方便性，本試驗所得固相微萃取最佳檢測條件為萃取溫度42℃、萃取時間30 min、平衡溫度48℃。

為了檢測所得結果的可靠性，在上述優化的條件下進行3次平行試驗，即萃取溫度42℃、萃取時間30 min、平衡溫度48℃，實際檢測平均酯類物質總峰面積為53.79×107，理論值與實驗值的相對偏差為0.48%，表明應用響應面法 優化固相微萃取條件檢測啤酒中酯類物質是可行的。

圖1 萃取溫度、萃取時間和平衡溫度交互作用對酯類物質總峰面積影響的響應面及等高線Fig.1 Response surface plots and contour line of effects of interaction between extraction temperature,extraction time and equilibrium temperature on the total peaks area of esters

2.3 模型方法學考察

本研究采用內標法對6種酯類物質進行定量，同時進行精密度和準確度試驗。

由表7可知，6種酯類物質的回收率為93.43%～103.37%，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.75%～8.24%，滿足檢測分析要求，并且重現性良好。以3倍信噪比（S/N=3）對應濃度為分析物的最低檢測濃度進行檢測限研究，檢測限在0.01～0.05 μg/L內。依次取1.3.1中不同稀釋倍數標準溶液，以標準溶液的質量濃度與峰面積響應值進行線性擬合，相關系數R2為0.990 0～0.999 9，表明6種分析物的線性回歸方程在所測質量濃度范圍內具有良好的線性相關性。

表7 啤酒中6種酯類物質的回收率、檢測限和回歸方程Table 7 Recovery rate,detection limit and regression equation of six esters in beer

2.4 市售啤酒中6種特征酯類物質的檢測

按照本研究所建立的方法，對3種市售啤酒中6種特征酯類物質的含量進行3次檢測，結果見表8。

表8 3種市售啤酒中6種酯類物質含量Table 8 Contents of six esters in three kinds of commercial beer

由表8可知，5種酯類檢測結果相對標準偏差≤10%，因苯甲酸乙酯含量較低，所以檢測誤差會相對偏高，但整體檢測誤差仍在合理范圍內，說明優化萃取條件后的檢測方法準確可靠，可以應用于啤酒中6種低含量酯類物質定性定量檢測。不同品牌啤酒的特征酯類物質的含量不同，這可能與酵母品種、釀造工藝以及貯存條件有關[20]。

3 結論

本研究采用響應面法對頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜法檢測啤酒中6種酯類物質（辛酸乙酯、丁酸乙酯、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯、苯甲酸乙酯和3-苯基丙酸乙酯）的萃取條件進行優化，通過響應面分析得較佳的萃取條件為：萃取溫度42℃、萃取時間30min和平衡溫度48℃。同時采用標準加入法定量，6種分析物的線性回歸方程在所測濃度范圍內具有良好的線性相關性，相關系數R2為0.9900～0.9999，回收率為93.43%～103.37%，檢測限在0.01～0.05 μg/L，滿足檢測分析要求。對實際啤酒生產中酯類物質的檢測具有重要的指導意義。

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Optimization of HS-SPME-GC/MS conditions for determination of trace esters in beer by response surface method

XU Yang,WANG Deliang*,LI Hong,YAN Yinzhuo,SONG Tao
(China National Research Institute of Food and Fermentation Industries,Beijing 100015,China)

The six low-content esters(including ethyl caprylate,ethyl butyrate,isobutyl acetate,phenylethyl acetate,ethyl benzoate and ethyl 3-phenylpropion)were extracted and determined by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-mass spectrometry(HS-SPME-GC/MS).The extraction conditions were optimized by Plackett-Burman and Box-Behnken experiments.The result showed that extraction temperature,extraction time and equilibrium temperature were identified as the main factors.Through response surface methodology analysis,the optimum extraction conditions were temperature 42℃,time 30 min and equilibrium temperature 48℃.Under the conditions,combined with the internal standard method to quantify,the R2of the method was 0.990 0-0.999 9,the recovery rate was 93.43%-103.37%.The limit of detection was 0.01-0.05 μg/L.The relative standard deviation(RSD)was 1.75%-8.24%,which indicated that the method was accurate and reliable,and could be applied to the determination of trace esters in beer.

beer;trace esters;HS-SPME-GC/MS;response surface methodology;detection and analysis

TS261.7；O657.63；O658.2

0254-5071（2017）09-0163-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.035

2017-05-15

國家自然科學基金（31401680）

許 楊（1993-），男，碩士研究生，研究方向為發酵工程。

*通訊作者：王德良（1972-），男，教授級高級工程師，博士，研究方向為發酵工程。