一株產幾丁質脫乙酰酶誘變菌株的培養基配方及發酵條件優化

秦汪艷，李永成*

（海南大學 食品學院，海南 海口 570228）

一株產幾丁質脫乙酰酶誘變菌株的培養基配方及發酵條件優化

秦汪艷，李永成*

（海南大學 食品學院，海南 海口 570228）

以一株海洋來源產幾丁質脫乙酰酶（CDA）的絲狀真菌（Penicilium janthinellum）1-5-2為出發菌株，經紫外線誘變后獲得一高產CDA菌株UV-210S。通過單因素試驗得出該誘變菌株的最佳培養基配方為麥芽糖1.3%，牛肉浸膏2.6%，NaH2PO40.3%，CaCl20.1%，膠體幾丁質0.5%；最佳發酵工藝條件為NaCl 1.5%，初始pH值為9.0，發酵溫度30℃，搖床轉速180 r/min，CDA最佳收集時間為72 h。經培養基配方及發酵條件優化后該誘變菌株的最高CDA酶活為16.76 U/mL，相比優化前的酶活提高了52%。

幾丁質脫乙酰酶；發酵；培養基；條件優化；酶活

幾丁質（chitin）是由N-乙酰-2-氨基-2-脫氧-D-葡萄糖胺通過β-1,4糖苷鍵連接聚合而成的高聚物，是地球上含量豐富的可再生多糖[1-2]。主要存在于動物的甲殼和骨組織以及真菌和植物的細胞壁中，也存在于一些綠藻中；主要有支撐骨架，保護細胞的作用[3]。殼聚糖（chitosan）是幾丁質脫去乙?；笏纬傻漠a物，殼聚糖分子因其大量游離的氨基和堿性陽離子而比幾丁質具有更好的溶解性[4]和生物可降解性[5]。此外，殼聚糖還具有其他優良的性能，如抑菌性[6]、保濕性、吸附性、降低膽固醇等，在食品、醫藥、輕工、印染、環保和農業等領域應用廣泛，具有很大的開發和推廣潛力[7-9]。

目前，工業上制備殼聚糖的方法主要是濃堿熱解幾丁質脫除乙?；摲ù嬖趪乐氐沫h境污染問題，且獲得的殼聚糖產品中乙?；拿摮潭炔灰恢?，導致產品品質均一性差。酶法生產殼聚糖作為一種新型綠色環保的脫乙酰方法，反應條件溫和，能耗值相對較低[10-11]，可獲得脫乙酰程度均一穩定的產品，因此，運用幾丁質脫乙酰酶（chitin deacetylase，CDA）生產殼聚糖將是行業未來的發展方向。

目前，以海洋真菌為來源的CDA文獻并不多，高產CDA的菌株報道也很少見，且海洋來源的微生物具有耐高滲透壓和耐鹽等優良的性能[12-13]，為發酵生產CDA提供很大的便利。因此本試驗以一株海洋絲狀真菌為出發菌株，對紫外線誘變后獲得的CDA高產菌株UV-210S進行單因素試驗以獲得其最佳培養基配方和最佳的產酶條件，為今后的工業化生產發酵CDA奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌種：誘變菌株UV-210S，其出發菌株為從?？跂|寨港紅樹林土壤中篩選獲得的海洋絲狀真菌（Penicilium janthinellum）1-5-2，4℃于冰箱中保存。

初始發酵培養基：酵母浸膏0.5%，葡萄糖0.4%，磷酸二氫鉀0.15%，膠體幾丁質0.1%，NaCl 1.4%，初始pH 6.0。121℃高壓蒸汽滅菌16 min。

種子培養基：酵母浸膏0.5%，葡萄糖0.25%，硫酸銨0.4%，磷酸二氫鉀0.15%，NaCl 1.0%，初始pH 6.0。121℃高壓蒸汽滅菌16 min。

1.2 儀器與設備

LRH-250A生化培養箱：韶關市泰宏醫療器械有限公司；HZQ-X300C搖床：上海一恒科學儀器公司；TGL-16M離心機：上海盧湘儀離心機儀器有限公司；GM-1.0A隔膜真空泵：天津市津騰實驗設備有限公司；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用有限公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液的制備

斜面菌種在恒溫培養箱中于30℃培養5～6 d，待產孢后，用5 mL 0.85%生理鹽水刮下孢子，將孢子液倒入裝液量為50mL/250mL的種子瓶中，180r/min搖床振蕩培養36h用于發酵[14]。

1.3.2 CDA粗酶液的提取

將發酵液在低溫條件下進行抽濾，濾液即為胞外酶提取液。在抽濾所得的菌絲體中加入15mL預冷的0.05mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）和少量石英砂，在低溫環境中快速碾磨，漿液立即在4℃、6 000 r/min條件下離心20 min，所得上清液即為胞內酶提取液[15]。

1.3.3 幾丁質脫乙酰酶酶活的測定

在具塞試管中加入1 mL 200 mg/L的對硝基乙酰苯胺溶液，3mL0.05mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH7.0），50℃水浴處理10 min后加入1 mL酶液，搖勻后于50℃酶促反應15 min，最后沸水浴10 min滅酶活終止反應，若出現渾濁現象，在6 000r/min條件下離心10min，于波長400nm處測定吸光度值?？瞻讓φ战M添加1 mL滅活酶液，其余同上。幾丁質脫乙酰酶酶活定義：在該反應條件下每小時產生1 μg對硝基苯胺所需要的酶量定義為1個酶活力單位（U/mL）[16]。

1.3.4 培養基配方的優化

發酵培養方法：種子液按2%的接種量接種于裝液量為50 mL/250 mL發酵瓶中，30℃、180 r/min搖床振蕩培養72 h，測定其CDA酶活及菌絲體干質量。

碳源的確定：將碳源的種類設定為葡萄糖、麥芽糖、乳糖、淀粉、蔗糖。選取最佳碳源，將其添加量設定為0.1%、0.5%、0.9%、1.3%、1.7%、2.1%，考察碳源對菌株發酵產CDA的影響。

氮源的確定：氮源的種類設定為酵母浸膏、牛肉浸膏、蛋白胨、草酸銨、硫酸銨。選取最佳氮源，將其添加量設定為0.2%、0.8%、1.4%、2.0%、2.6%、3.2%，考察氮源對菌株發酵產CDA的影響。

無機鹽的確定：將發酵液中的無機鹽調整為MgSO4、CuSO4、CaCl2、NaH2PO4、KH2PO4、MnSO4、ZnSO4、BaCl2、FeCl3，考察無機鹽對菌株發酵產CDA的影響。

膠體幾丁質的確定：發酵液中膠體幾丁質的添加量為0、0.2%、0.5%、0.8%、1.1%、1.4%，考察膠體幾丁質添加量對發酵產CDA的影響。

滲透壓的確定：根據NaCl的加入量來調節滲透壓的大小，NaCl的加入量設定為0.1%、0.8%、1.5%、2.2%、2.9%、3.6%，考察滲透壓對發酵產CDA的影響。

1.3.5 發酵條件的優化

pH的確定：滅菌前將發酵液中的pH調整為5、6、7、8、9，考察pH對發酵產CDA的影響。

發酵溫度的確定：振蕩培養溫度設定為26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃，考察發酵溫度對發酵產CDA的影響。

搖床轉速的確定：搖床轉速分別設定為100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min，考察搖床轉速對發酵產CDA的影響。

2 結果與分析

2.1 胞外CDA與胞內CDA的對比

分別測定胞外及胞內CDA酶活，結果見表1。由表1可以看出，胞外CDA酶活在發酵過程中始終高于胞內CDA酶活。胞內和胞外CDA酶活均在72 h時達到最高，分別為2.5 U/mL和11.05 U/mL，故酶的最佳收集時間為72 h。胞外CDA酶活顯著高于胞內CDA酶活，故以下試驗酶的研究以胞外CDA酶活計。

表1 誘變菌株胞外CDA與胞內CDA酶活比較Table 1 Comparison of activity of extracellular CDA and intracellular CDA from the mutant strains

2.2 發酵培養基對菌生長與CDA合成的影響

2.2.1 碳源的影響

微生物對碳源的利用具有選擇性[17]，試驗采用5種碳源，探討其對CDA酶活的影響，結果見圖1（a）。由圖1（a）可知，以麥芽糖為碳源時，胞外CDA酶活最高，為7.41 U/mL，淀粉次之，為6.5 U/mL，葡萄糖作為碳源時酶活最低。因此，以麥芽糖為碳源，進行麥芽糖添加量對該誘變菌株產CDA酶影響的考察。

麥芽糖的添加量對CDA酶活的影響如圖1（b）所示。由圖1（b）可知，麥芽糖添加量在0.1%～1.3%范圍內，CDA酶活隨麥芽糖濃度的增加而穩步上升，在麥芽糖添加量為1.3%時，CDA酶活達到最高，為7.41 U/mL，麥芽糖添加量＞1.3%后，CDA酶活呈逐漸下降趨勢。分析其原因主要是當麥芽糖濃度較低時導致碳源匱乏，生物量處在較低的水平，對CDA的合成造成一定的影響；過高的麥芽糖濃度對CDA的合成造成一定的碳源阻遏作用，使酶活下降[18]。因此，最適麥芽糖添加量為1.3%。

圖1 碳源種類(a)與麥芽糖添加量(b)對誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.1 Effects of kinds of carbon source(a)and maltose addition(b)on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

2.2.2 氮源的影響

圖2 氮源種類(a)與牛肉浸膏添加量(b)對誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.2 Effects of kinds of nitrogen source(a)and beef extract addition(b)on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

不同氮源種類對CDA酶活的影響，結果見圖2（a）。由圖2（a）可知，有機氮作為氮源時CDA酶活以及生物量明顯高于無機氮源，可能是有機氮源中富含微生物生命活動所需的生長因子和微量元素，在生長過程中更易被微生物吸收利用或對CDA酶本身具有激活作用[19]。對比牛肉浸膏與酵母浸膏的CDA酶活和生物量的關系，發現生物量并不是影響酶活大小的唯一因素[20]。以牛肉浸膏作為氮源時，CDA酶活顯著高于其他氮源，為7.15 U/mL，因此以牛肉浸膏為氮源，對牛肉浸膏最佳的添加量進行探討。

氮源的添加量對CDA酶活的影響如圖2（b）所示。由圖2（b）可知，以牛肉浸膏為氮源時，在添加量0.1%～2.6%范圍內，菌體對氮源的需求較大，隨著牛肉浸膏添加量在0.2%～2.6%范圍內的上升，CDA酶活以及微生物的生物量也隨之上升，并在牛肉浸膏添加量為2.6%時CDA酶活達到最高，為15.85U/mL，牛肉浸膏添加量＞2.6%后，高濃度的氮源不利于菌體的生長和代謝產物的積累，對產CDA酶水平有一定抑制作用，酶活降低。因此，最適牛肉浸膏添加量為2.6%。

2.2.3 無機鹽的影響

圖3 金屬離子種類(a)、NaH2PO4(b)和CaCl2(c)添加量對誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.3 Effects of kinds of metal ions(a),NaH2PO4addition(b)and CaCl2 addition(c)on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

不同種類的金屬離子對CDA酶活的影響，結果見圖3（a）。由圖3（a）可知，不同種類的金屬離子對CDA酶的產生有不同的影響；Ca2+、Ba2+、Zn2+、Na+對產CDA均有促進作用，可能是這些金屬離子對CDA酶的產生具有一定的激活作用或作為酶的組成部分對維持CDA酶的活性結構具有重要意義。Mg2+對CDA酶的促進作用不明顯。Fe3+、Cu2+、Mn2+對產CDA酶有明顯的抑制作用，具體的抑制機理善不明確。有報道稱可能是CDA酶與某些金屬離子螯合形成的底物對CDA酶活會造成較大的影響，使酶活降低[21]。當金屬鹽的加入量為11mmol/L時，NaH2PO4對菌株產CDA酶的影響最大，為10.53 U/mL，CaCl2次之，為8.84 U/mL。因此以NaH2PO4、CaCl2為無機鹽，分別探討其最佳的添加量。

NaH2PO4的添加量對CDA酶活的影響，結果見圖3（b）。由圖3（b）可知，當發酵液中NaH2PO4的加入量為0.3%，CDA酶活最高，為10.27 U/mL。分析其原因主要是NaH2PO4提供微生物生長所必需的Na+和磷元素外，還能調節發酵液的pH，使之穩定在一定的范圍內。因此，選擇NaH2PO4的最適添加量為0.3%。

CaCl2的添加量對CDA酶活的影響，結果見圖3（c）。由圖3（c）可知，添加量為0～0.1%時，CDA酶活隨CaCl2添加量升高而穩步上升，并在CaCl2添加量為0.1%時CDA酶活達到最高，為8.84U/mL。CaCl2的添加量＞0.1%后，CDA酶活開始下降，說明Ca2+對CDA酶的產生具有雙重調節作用。因此選擇CaCl2的最適添加量為0.1%。

2.2.4 膠體幾丁質添加量的影響

膠體幾丁質的添加量對CDA酶活的影響，結果見圖4。由圖4可知，未添加膠體幾丁質時，CDA酶活處于較低水平，添加膠體幾丁質后酶活驟然上升，說明幾丁質作為CDA酶的作用底物對CDA的合成具有誘導作用；當發酵液中膠體幾丁質的添加量為0.5%時，CDA酶活達到最高，為6.89U/mL，膠體幾丁質的添加量＞0.5%后，CDA酶活呈下降趨勢。因此膠體幾丁質的最適添加量為0.5%。

圖4 膠體幾丁質的添加量對誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.4 Effect of colloidal chitin addition on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

2.3 培養條件對菌生長與CDA合成的影響

2.3.1 滲透壓的影響

根據NaCl的添加量來調節培養基的滲透壓。不同NaCl的添加量對CDA酶活的影響，結果見圖5。由圖5可知，NaCl添加量為1.5%時，CDA酶活最高，為5.46 U/mL。當NaCl添加量＞1.5%后，生物量的變化趨勢不顯著，而CDA酶活呈現微弱的下降趨勢。分析其原因可能是誘變體菌株的原始出發菌株是從海邊紅樹林篩選獲得，有較好的耐鹽性，滲透壓調節能力較強。因此NaCl最適添加量為1.5%。

圖5 NaCl添加量對誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.5 Effect of NaCl addition on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

2.3.2 發酵液初始pH的影響

不同的發酵液初始pH對CDA酶活的影響，結果見圖6。由圖6可知，發酵液初始pH對CDA酶活及生物量均有較大影響。pH為9時，CDA酶活最高，為14.55 U/mL。pH在5～6時，酶活與生物量呈上升趨勢，pH在7～9內，生物量隨pH上升而下降，而CDA酶活呈上升趨勢。分析其原因主要是該誘變菌株屬于真菌類，偏酸性的環境促進其生長，而在發酵過程中，該誘變真菌產生大量的酸性物質，被堿性發酵液中和后，更適于CDA的產生。

圖6 初始pH對誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.6 Effect of initial pH on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

2.3.3 發酵溫度的影響

不同發酵溫度對CDA酶活的影響，結果見圖7。由圖7可知，誘變菌株的最佳產酶溫度為30℃，此時胞外CDA酶活為7.02 U/mL，因此可將后續的發酵溫度設定在30℃。

圖7 發酵溫度對誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.7 Effect of fermentation temperature on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

2.3.4 搖床轉速的影響

不同搖床轉速對CDA酶活的影響，結果見圖8。由圖8可知，當轉速為100 r/min時，菌體的生長以及CDA酶活均處于較低的水平。該絲狀真菌為好氧性真菌，轉速過低，發酵瓶內的溶氧量不足導致菌絲體代謝異常而影響酶的產量。隨著搖床轉速上升至180r/min，酶活及生物量有所增長，搖床轉速＞180r/min之后，CDA酶活以及生物量有所下降。因此，將后續的發酵搖床轉速設定為180 r/min。

圖8 搖床轉速對誘變菌株CDA酶活和生物量的影響Fig.8 Effect of shaker rotate speed on the activity of CDA and biomass of the mutant strain

3 結論

本試驗通過單因素法對誘變菌株UV-210S產CDA的培養基配方和發酵條件進行了優化，得出產CDA最佳培養基配方為麥芽糖1.3%，牛肉浸膏2.6%，NaH2PO40.3%，CaCl20.1%，膠體幾丁質0.5%；最佳的發酵培養條件為NaCl 1.5%，初始pH 9，發酵溫度30℃，搖床轉速180 r/min，CDA收集時間72 h。經發酵優化后該誘變菌株的最高CDA酶活為16.76 U/mL，相比優化前的酶活提高了52%。

目前，生物法降解幾丁質制備殼聚糖的方法仍處于實驗室階段，還無法大批量的投入工業化生產。就本試驗優化后的結果來看，CDA的產率遠達不到工業生產的水平，仍需要進行深入的探討來改善其產酶特性，提高CDA的產率和增強CDA的穩定性。

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Optimization of medium formulas and fermentation conditions of a chitin deacetylase-producing mutant strain

QIN Wangyan,LI Yongcheng*
(College of Food Science and Technology,Hainan University,Haikou 570228,China)

Using a chitin deacetylase(CDA)-producingPenicilium janthinellum1-5-2 from ocean as original strain,strain UV-210S with high CDA-producing was obtained after ultraviolet mutation.By single factor experiments,the optimum medium formulas of strain UV-210S was maltose 1.3%,beef extract 2.6%,NaH2PO40.3%,CaCl20.1%and colloidal chitin 0.5%.The optimum fermentation conditions were NaCl 1.5%,initial pH 9.0,fermentation temperature 30℃,shaker oscillation rate 180 r/min,CDA optimum collection time 72 h.Under the optimum medium formulas and fermentation conditions,the highest CDA activity produced by the mutant strain was 16.76 U/ml,which was 52%higher than that of before optimization.

chitin deacetylase;fermentation;medium;conditions optimization;enzyme activity

TS201.3

0254-5071（2017）09-0050-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.09.011

2017-07-06

海南省自然科學基金項目（20163065）

秦汪艷（1991-）女，碩士研究生，研究方向為發酵工程。

*通訊作者：李永成（1964-）男，教授，博士，研究方向為微生物發酵。